穆林尾淋巴水肿模型

摘要

淋巴水肿是由淋巴功能障碍引起的四肢肿胀。我们描述了淋巴水肿的慢性粘液尾部模型，以及组织纳米透射技术 （TNT） 对尾部进行遗传货物输送的新用途。

摘要

淋巴水肿是由淋巴功能障碍引起的四肢肿胀。受影响的肢体由于积液、脂肪和纤维化而扩大。这种疾病没有治愈的方法。老鼠尾巴模型，使用焦点全厚皮肤切除附近的尾巴底部，导致尾部肿胀，已被用于研究淋巴水肿。然而，该模型可能导致血管组成和随后的尾部坏死和早期尾部肿胀的分辨率，限制其临床可翻译性。慢性阴唇尾淋巴水肿模型诱导持续淋巴水肿超过15周和可靠的灌注到尾巴。传统木质尾淋巴水肿模型的增强包括1）使用手术显微镜精确全厚切除和淋巴剪裁，2）使用高分辨率激光斑点确认术后动脉和静脉灌注，3）使用非多氰氨酸绿色近红外激光淋巴扫描进行功能评估。我们还使用组织纳米传递技术 （TNT） 为新的非病毒性、跨皮性、焦点性遗传货物输送到小鼠尾血管。

引言

淋巴水肿是由淋巴功能障碍引起的四肢肿胀。受影响的肢体由于积液、脂肪和纤维化¹而扩大。淋巴水肿影响全球^{2.5亿人2，3，4。}据估计，20-40%接受固体恶性肿瘤治疗的患者，如乳腺癌、黑色素瘤、妇科/泌尿肿瘤或肉瘤，会发展成淋巴水肿^2、4、5。淋巴水肿的发病率包括复发性感染、疼痛和畸形^6。这种渐进的终身疾病是无法治愈的。目前的疗法是变种有效^7，包括压缩，完全排泄治疗由物理治疗师，切除程序，和显微手术，包括血管淋巴结转移和淋巴旁路7，8，9，10，11，12，13，14。淋巴水肿的理想治疗方法尚未被发现。

研究淋巴水肿的机理和治疗是有限的。淋巴损伤后平均延迟一年^，15、16和大多数经历辐射和手术的诱导侮辱的人不会发展淋巴水肿^{4，6，17。}虽然大型动物模型，包括犬，羊，和猪已经描述了18，19，20，老鼠尾巴模型已被最广泛的应用，因为方便，成本，和繁殖能力。用于研究淋巴水肿的鼠标模型包括尾部模型、白喉毒素介导淋巴消融，以及轴状或弹出性淋巴结解剖 21、22、23、24、25、26。大多数尾部模型使用焦点，全厚皮肤切除与淋巴通道剪裁，这是在尾^{部底部附近执行22，}导致尾部肿胀和组织特征类似于人类淋巴水肿24，27，28，29。然而，标准的木乃伊尾巴模型通常自发解决在短短20天，并伴有周期性尾坏死^30。淋巴水肿鼠尾模型将持续淋巴水肿延长超过15周，演示确认的动脉和静脉轻度，并允许功能淋巴功能障碍评估。

淋巴水肿的阴唇尾部模型允许评估治疗淋巴水肿的新型治疗方法。基因策略已被用于由病毒载体^31，32调解的老鼠模型。我们还使用一种新的组织纳米传递技术（TNT）将遗传货物运送到淋巴小鼠尾部。TNT利用纳米通道芯片在快速聚焦电场^{33、34、35、36}中促进直接^的、皮下基因的传递。该模型包括使用TNT_2.0，使潜在的基因治疗焦点基因传递到小鼠尾部的淋巴损伤部位^35。

研究方案

该协议遵循该机构动物研究伦理委员会的指导方针。所有动物实验都得到了印第安纳大学医学院动物护理和使用委员会的批准。动物被安置在12小时的光暗循环下，食物和水的脂肪。

1. 小鼠尾淋巴的手术中断

1. 使用八周大的C57BL/6小鼠，性别分布均等。
2. 将鼠标置于全身麻醉下，在诱导室中，3-4%的异黄素在100%的氧气中，然后在手术过程中以1-3%的维持饱和度进行。
3. 持续释放 （SR） 丁丙诺啡皮下管理 0.5 毫克/千克，以控制疼痛。
   注:手术后施用的其他镇痛药物:卡洛芬每24小时一次，至少48小时，Bupivacaine一次，无论是切口后还是关闭切口之前，通过滴到皮肤边缘（持续长达4至6小时）。
4. 将鼠标定位在多处，并准备使用 70% 异丙醇的尾巴。
5. 使用卡钳从尾部底部开始，以 5 mm 增量测量手术前的尾径 5 mm 增量。这些测量将用于使用截断的锥体方程³⁷计算体积。
6. 在距底座 20 mm 的尾部标记 3 mm 的环切除术。
7. 用无菌手术刀片（大小 15）进行细致的 3 mm 全厚皮肤切除术，使所有底层血管在手术显微放大下完好无损。将优越的割礼标记（从尾部基座 20 毫米）首先穿过真皮，然后将环切的全厚切口 3 mm 分形切口切成第一个切口。
   1. 制作垂直全厚垂直切口，将两个切口连接起来。使用齿形精细皮卡抓住领先优势，并使用显微镜仔细剖析血管平面深处的真皮和表面的静脉冒险。
8. 将 0.1 mL 的异硫素蓝色 （1%） 皮下近端注射到尾部。
9. 在手术显微镜下识别与横向尾静脉相邻的两个淋巴通道。淋巴片会因为异硫素注射而呈蓝色。使用直微手术剪刀转录淋巴。使用剪刀仔细解剖横静脉和淋巴之间的平面。然后通过淋巴血管和横静脉之间的一把剪刀刀片的尖端，并关闭刀片以穿过淋巴血管。
10. 用无菌的粘附清敷料给尾部伤口穿衣。每天检查手术后切口，以确保它们没有感染或出血，并提供伤口护理2周。
11. 单独安置动物，以防止任何进一步的伤害尾巴，并防止动物咬对方，这将导致手术并发症。

2. 带激光斑点对比成像的尾血管评估

1. 麻醉鼠标，如第1.2步。
2. 要使用激光斑点对比成像可视化尾部血管，将宽度设置为 0.8 厘米，高度设置为 1.8 厘米，点密度为高，帧速率为 44 图像/秒，时间为 30 秒，彩色照片设置为每 10 秒 1 张。
3. 评估静脉和动脉灌注的足口。从质量上讲，流的连续性应该形象化。

3. 近红外激光血管造影功能淋巴评估

1. 麻醉动物作为第1.2步
2. 重组丁二苯丙胺绿色 （ICG） （25 毫克/10 mL）， 并在尖端附近的远小鼠尾皮下管理 0.1 mL。
3. 调暗房间的灯光。将近红外激光血管造影仪置于缓冲环境中，然后进行实时捕获。

4. 使用 TNT 将核酸货物重点运送到鼠标尾部

1. 麻醉动物作为第1.2步。
2. 使用局部皮肤去角质霜去角质小鼠尾巴。
3. 将鼠标尾部浸入拼贴剂溶液（10 毫克/毫升）中，在 37 °C 下浸入 5 分钟。
4. 将DNA加载到TNT_2.0 芯片储层³⁵中。
5. 将 TNT_2.0 硅胶芯片设备放在所需的交货焦点部位的尾部，与尾部接触的纳米胶。
6. 在储层中放置一个正电探头。将负探针连接到 30 G 针上，皮下插入针头到交货地点。
7. 应用方波脉冲电刺激（10 x 10 ms 脉冲，250 V，10 mA）。

结果

持续淋巴水肿的鼠标尾部模型技术见 图1。该图展示了鼠标尾部模型的相关解剖。 图2 显示了淋巴水肿诱导后小鼠尾部的渐进肿胀和持续持续淋巴水肿。按截断锥方程计算，鼠标尾部体积在第 4 周达到峰值，在第 6 周达到稳定点，随后逐渐改善，持续到第 15 周。尾部体积可用作结果变量，以评估治疗干预对模型淋巴水肿的影响?...

讨论

淋巴水肿分为原发性（先天性）或继发性（致畸淋巴）损伤^38，39。继发性淋巴水肿占39例病例的^99%。继发性淋巴水肿最常由感染（丝虫病）或肿瘤后治疗与淋巴切除术或辐射^4，39引起。转化动物模型对继发性淋巴水肿具有挑战性，因为70%接受淋巴切除术和放射治疗的动物不会获得淋巴水肿

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Microscope	Leica, Wetzlar, Germany	MSV266
Adherent Dressing (Tegaderm)	3M, St. Paul, Minn.	1626W
Laser speckle (Pericam PSI System )	Perimed AB, Stockholm, Sweden)	PSIZ
Near-infrared laser (LUNA)	Stryker (Formerly Novadaq Technologies, Toronto, Canada)	LU3000
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories	000664
Micro-Adson Forceps - 1x2 Teeth	Fine Science Tools (USA) Inc.	11019-12
V-Hook	Fine Science Tools (USA) Inc.	18052-12
Scalpel SS NO15	Fischer Scientific	29556
Disposable Needle 30GX1	Fischer Scientific	305128
Operating Scissors	Fischer Scientific	12-460-796
Surgi-Or Jeweler's Forceps, Sklar 4-1/2 in	Fischer Scientific	50-118-4255
Spring Scissors - Straight/Sharp-Sharp/8mm Cutting Edge	Fine Science Tools (USA) Inc.	15024-10
Cardiogreen	Sigma	I2633-25MG
IsosulfanBlue (Lymphazurin)  50 mg/5ml	Mylan	67457-220-05