Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

לימפאדמה היא נפיחות בגפיים הנגרמת על ידי תפקוד לקוי של הלימפה. אנו מתארים מודל זנב מורין כרוני של ביצנית לימפה ושימוש חדשני בטכנולוגיית ננו-טראנספקטו רקמות (TNT) להעברת מטען גנטי לזנב.

Abstract

לימפאדמה היא נפיחות בגפיים הנגרמת על ידי תפקוד לקוי של הלימפה. הגפיים המושפעות גדלות בגלל הצטברות של נוזלים, שומן ופיברוזיס. אין תרופה למחלה זו. מודל זנב עכבר המשתמש כריתת עור בעובי מלא מוקד ליד בסיס הזנב, וכתוצאה מכך נפיחות הזנב, שימש לחקר בצקת הלימפה. עם זאת, מודל זה עלול לגרום נמק זנב מורכב וכתוצאה מכך ורזולוציה נפיחות זנב מוקדם, הגבלת התרגום הקליני שלה. מודל לימפאדמה זנב מורין כרונית מתמשכת משכיל לימפאדמה במשך 15 שבועות וזלוף אמין לזנב. שיפורים של מודל לימפאדמה זנב מורין המסורתי כוללים 1) כריתה מדויקת בעובי מלא גזירת לימפה באמצעות מיקרוסקופ כירורגי, 2) אישור של זלוף עורקי ורידים לאחר הניתוח באמצעות כתמ לייזר ברזולוציה גבוהה, ו 3) הערכה תפקודית באמצעות אינדוקינין ירוק ליד לימפנגיוגרפיה לייזר אינפרא אדום. אנו משתמשים גם בטכנולוגיית ננו-טרנזיזיה של רקמות (TNT) עבור משלוח חדשני לא ויראלי, עורי, מוקדי של מטען גנטי ל vasculature זנב העכבר.

Introduction

לימפאדמה היא נפיחות בגפיים הנגרמת על ידי תפקוד לקוי של הלימפה. הגפיים המושפעות גדלות בגלל הצטברות של נוזלים, שומן, פיברוזיס1. לימפאדמה משפיעה על 250 מיליון אנשים ברחבי העולם2,3,4. ההערכה היא כי 20-40% מהחולים שעוברים טיפול ממאיר מוצק, כגון סרטן השד, מלנומה, גידולים גינקולוגיים / אורולוגיים, או סרקומות, לפתח לימפאדמה2,4,5. תחלואה מבדים לימפאדמה כוללת זיהומים חוזרים ונשנים, כאב, עיוות6. אין תרופה למחלה מתקדמת זו לכל החיים. הטיפולים הנוכחיים הם variaby יעיל7 וכוללים דחיסה, טיפול decongestive מלא על ידי פיזיותרפיסטים, הליכים excisional, ניתוחים מיקרוכירורגיים, כולל העברת בלוטות לימפה וסקולרית מעקף לימפובלוס7,8,9,10,11,12,13,14. הטיפול האידיאלי לבצה לימפתית טרם התגלה.

לימוד המנגנון והטיפול של במצקת הלימפה היה מוגבל. יש הכנסה מתעכבת ממוצעת של שנה אחת בעקבות הפגיעה הלימפתית15,16 ורוב האנשים שחווים עלבון iatrogenic עם קרינה וניתוח לא לפתח לימפאדמה4,6,17. למרות מודלים בעלי חיים גדולים, כולל כלבים, כבשים, חזיר תוארו18,19,20, מודל זנב העכבר כבר מיושם הנפוץ ביותר בגלל קלות, עלות, רבייה. מודלים עכבר לחקירת לימפאדמה כוללים מודל זנב, אבלציה לימפתית בתיווך דיפתריה-רעלן, וניתוח בלוטות לימפה צירי או פופליטי21,22,23,24,25,26. רוב דגמי הזנב משתמשים בחתך עור בעובי מלא עם גזירת ערוץ לימפה המבוצעת בסמוך לבסיס הזנב22, וכתוצאה מכך נפיחות בזנב ותכונות היסטולוגיות הדומות לבתי לימפה אנושית24,27,28,29. עם זאת, מודל זנב מורין סטנדרטי בדרך כלל פותר כמה זמן עד 20 ימים והוא מלווה נמק זנב תקופתי30. מודל זנב עכבר לימפאדמה מאריך לימפאדמה מתמשכת מעבר ל -15 שבועות, מדגים טפיחה עורקית ורידית מאושרת, ומאפשר הערכה תפקודית של תפקוד לקוי של הלימפה.

מודל זנב מורין של לימפאדמה מאפשר הערכה של טיפוליים חדשניים לטיפול בבמצת לימפה. אסטרטגיות מבוססות גנים שימשו במודל העכבר בתיווך וקטורים ויראליים31,32. אנו משתמשים גם בטכנולוגיית ננו-טרנזיזיה חדשנית של רקמות (TNT) להעברת מטען גנטי לזנב העכבר הלימפדימטי. TNT מאפשרת אספקת גנים ישירה, עורית באמצעות שבב עם nanochannels בשדה חשמלי ממוקד מהיר33,34,35,36. המודל כולל שימוש ב- TNT2.0 כדי לאפשר אספקת גנים מוקדיים של טיפולים פוטנציאליים מבוססי גנים לאתר הפגיעה הלימפתית של זנב העכבר35.

Protocol

הפרוטוקול פועל על פי הנחיות ועדת האתיקה לחקר בעלי החיים של המוסד. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי בית הספר לרפואה של אוניברסיטת אינדיאנה מוסדי טיפול ושימוש בוועדה. בעלי חיים שוכנו תחת מחזור של 12 שעות של אור-חושך עם מזון ומים עד ליביטום.

1. הפרעה כירורגית של לימפטיקה זנב העכבר

  1. השתמש בשמונה עכברי C57BL/6 בני שבוע של חלוקה מגדרית שווה.
  2. מניחים עכבר תחת הרדמה כללית בתא אינדוקציה עם 3-4% איזופלוראן ב -100% חמצן ואחריו סם תחזוקה ב 1-3% במהלך ההליך.
  3. יש לתת 0.5 מ"ג/ק"ג בופרנורפין בתת עורית לשליטה בכאב.
    הערה: תרופות נוספות למרצך פעולה מנוהלות לאחר הניתוח: Carprofen אחת ל 24 שעות לפחות 48 שעות ו Bupivacaine פעם אחת או לאחר החתיכה נעשה או לפני סגירת החתיכה, מוחל על ידי טפטוף על קצות העור (נמשך עד 4 - 6 שעות).
  4. מקם את העכבר באופן אחורי והכן את הזנב עם 70% אלכוהול איזופרופיל.
  5. מדוד את קוטר הזנב לפני ההליך במרווחים של 5 מ"מ החל מ-20 מ"מ מבסיס הזנב באמצעות קליפר. מדידות אלה ישמשו לחישוב אמצעי האחסון באמצעות משוואת החרוט החתוך37.
  6. סמן כריתה היקפית של 3 מ"מ על הזנב 20 מ"מ מהבסיס.
  7. בצע כריתת עור קפדנית בעובי 3 מ"מ עם להב כירורגי סטרילי (מידה 15), והותיר את כל כלי ההשמדה הבסיסיים ללא פגע תחת הגדלה מיקרוסקופית כירורגית. יש להסית את סימן ההיקף המעולה (20 מ"מ מבסיס הזנב) תחילה דרך הדרמיס ואחריו פירוק 3 מ"מ בעובי מלא היקפי לפירוק הראשון.
    1. הפוך תפירה אנכית בעובי מלא בניצב כדי לחבר את שני החתכים. השתמש בטנדר עדין עם שיניים כדי לתפוס קצה מוביל ולהשתמש במיקרו-סיסורים כדי לנתח בזהירות עמוק בתוך מישור כלי הדם לדרמיס ושטחי לאפוונטיטיה של הווריד.
  8. הזריקו 0.1 מ"ל של כחול איזוסולפן (1%) פרוקסימלי תת עורי לקצה הזנב.
  9. זהה את שני ערוצי הלימפה הסמוכים לוורידים לרוחב הזנב מתחת למיקרוסקופ הכירורגי. הלימפה תיראה כחולה בגלל הזרקת איזוסולפן. תעביר את הלימפה בעזרת מספריים מיקרו-כירורגיים ישרים. השתמש במספריים כדי לנתח בזהירות מישור בין הווריד לרוחב ללימפה. לאחר מכן להעביר את קצה של להב מספריים אחד בין כלי הלימפה לבין הווריד לרוחב ולסגור את הלהבים כדי להעביר את כלי הלימפה.
  10. הלבישו את פצע הזנב ברוטב סטרילי ברור. בדוק חותרים לאחר הניתוח מדי יום כדי לוודא שהם לא נגועים או מדממים ולספק טיפול פצע במשך שבועיים.
  11. לשכן את בעלי החיים בסינגל כדי למנוע כל פגיעה נוספת בזנב ולמנוע מבעלי החיים לנשוך אחד את השני, מה שיוביל לסיבוכים כירורגיים.

2. הערכת כלי דם בזנב עם הדמיית ניגודיות כתמי לייזר

  1. עשיית העכבר כמו בשלב 1.2.
  2. כדי להשתמש בהדמיית ניגודיות כתמי לייזר כדי לדמיין את כלי הדם של הזנב, הגדר את הרוחב ל-0.8 ס"מ, גובה ל-1.8 ס"מ, צפיפות הנקודות לגבוהה, קצב הפריימים ל-44 תמונות לשנייה, זמן ל-30 שניות ותמונה צבעונית ל-1 ל-10 שניות.
  3. להעריך את זלוף ורידים ועורקים עבור patency. מבחינה איכותית, יש לדמיין את המשכיות הזרימה.

3. הערכה לימפתית תפקודית עם אנגיוגרפיה לייזר אינפרא אדום קרוב

  1. להפנט את החיה כמו בשלב 1.2
  2. תזרים את ירוק האינדוציאנין (ICG) (25 מ"ג/10 מ"ל) ותנהל 0.1 מ"ל בתת עורית בזנב העכבר הדיסטלי ליד הקצה.
  3. עמעמו את אורות החדר. מקם אנגיוגרפיה של לייזר כמעט אינפרא-אדום בהגדרת אגירה ואחריה לכידה חיה.

4. משלוח מוקד של מטען חומצה גרעין לזנב העכבר באמצעות TNT

  1. להעייש את החיה כמו בשלב 1.2.
  2. פילינג זנב העכבר באמצעות קרם פילינג עור אקטואלי.
  3. לטבול את זנב העכבר בתמיסת collagenase (10 מ"ג / מ"ל) ב 37 °C במשך 5 דקות.
  4. לטעון DNA לתוך מאגר השבב TNT2.0 35.
  5. מקם את התקן שבב הסיליקון TNT2.0 מעל אתר המסירה הרצוי על הזנב עם ננו-נוי במגע עם הזנב.
  6. הנח בדיקה חשמלית חיובית במאגר. חבר את הבדיקה השלילית למחט 30 G ולהכניס את המחט תת עורית לזנב לאתר המסירה.
  7. החל גירוי חשמלי פולס גל מרובע (10 x 10 ms פולסים, 250 V, 10 mA).

תוצאות

הטכניקה של דגם זנב העכבר לבוצת לימפה מתמשכת מוצגת באיור 1. הדמות מציגה את האנטומיה הרלוונטית של דגם זנב העכבר. איור 2 מדגים את הנפיחות המתקדמת ואת קיום לימפאדמה עמידה בזנב העכבר לאחר אינדוקציה של לימפאדמה. נפח זנב העכבר, כפי שחושב על ידי משו...

Discussion

לימפאדמה מסווגת כפגיעה ראשונית (מולדת) או משנית (לימפתית iatrogenic)38,39. לימפאדמה משנית מהווה 99% מהמקרים39. לימפאדמה משנית נגרמת בדרך כלל על ידי זיהום (פילריאזיס) או טיפול פוסט-אונקולוגי עם כריתת לימפאדן או קרינה4,39. מוד?...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מימון מענקים שסופקו על ידי האגודה האמריקאית של מנתחים פלסטיים מלגה אקדמית ומשרד ההגנה W81XWH2110135   ל AHH. מענק קרן חינוך ומחקר לכירורגיה אסתטית ל- MS. NIH U01DK119099, R01NS042617 ו- R01DK125835 ל- CKS.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Surgical MicroscopeLeica, Wetzlar, GermanyMSV266
Adherent Dressing (Tegaderm)3M, St. Paul, Minn.1626W
Laser speckle (Pericam PSI System )Perimed AB, Stockholm, Sweden)PSIZ
Near-infrared laser (LUNA)Stryker (Formerly Novadaq Technologies, Toronto, Canada)LU3000
C57BL/6 miceJackson Laboratories000664
Micro-Adson Forceps - 1x2 TeethFine Science Tools (USA) Inc.11019-12
V-HookFine Science Tools (USA) Inc.18052-12
Scalpel SS NO15Fischer Scientific29556
Disposable Needle 30GX1Fischer Scientific305128
Operating ScissorsFischer Scientific12-460-796
Surgi-Or Jeweler's Forceps, Sklar 4-1/2 inFischer Scientific50-118-4255
Spring Scissors - Straight/Sharp-Sharp/8mm Cutting EdgeFine Science Tools (USA) Inc.15024-10
CardiogreenSigmaI2633-25MG
IsosulfanBlue (Lymphazurin)  50 mg/5mlMylan67457-220-05

References

  1. Kataru, R. P., et al. Fibrosis and secondary lymphedema: chicken or egg. Translation Research. 209, 68-76 (2019).
  2. Brayton, K. M., et al. Lymphedema prevalence and treatment benefits in cancer: impact of a therapeutic intervention on health outcomes and costs. PLoS One. 9 (12), 114597 (2014).
  3. Mendoza, N., Li, A., Gill, A., Tyring, S. Filariasis: diagnosis and treatment. Dermatology and Therapy. 22 (6), 475-490 (2009).
  4. Rockson, S. G., Rivera, K. K. Estimating the population burden of lymphedema. Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 147-154 (2008).
  5. Soran, A., et al. Breast cancer-related lymphedema--what are the significant predictors and how they affect the severity of lymphedema. Breast Journal. 12 (6), 536-543 (2006).
  6. Hayes, S. C., et al. Upper-body morbidity after breast cancer: incidence and evidence for evaluation, prevention, and management within a prospective surveillance model of care. Cancer. 118, 2237-2249 (2012).
  7. Carl, H. M., et al. Systematic Review of the Surgical Treatment of Extremity Lymphedema. Journal of Reconstructive Microsurgery. 33 (6), 412-425 (2017).
  8. Garza, R., Skoracki, R., Hock, K., Povoski, S. P. A comprehensive overview on the surgical management of secondary lymphedema of the upper and lower extremities related to prior oncologic therapies. BMC Cancer. 17 (1), 468 (2017).
  9. Hassanein, A. H., et al. Deep Inferior Epigastric Artery Vascularized Lymph Node Transfer: A Simple and Safe Option for Lymphedema. Journal of Plastic, Reconstructive, Aesthetic Surgery. 73 (10), 1897-1916 (2020).
  10. Hassanein, A. H., Sacks, J. M., Cooney, D. S. Optimizing perioperative lymphatic-venous anastomosis localization using transcutaneous vein illumination, isosulfan blue, and indocyanine green lymphangiography. Microsurgery. 37 (8), 956-957 (2017).
  11. Chang, D. W., Masia, J., Garza, R., Skoracki, R., Neligan, P. C. Lymphedema: Surgical and Medical Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 138, 209-218 (2016).
  12. Gould, D. J., Mehrara, B. J., Neligan, P., Cheng, M. H., Patel, K. M. Lymph node transplantation for the treatment of lymphedema. Journal of Surgical Oncology. 118 (5), 736-742 (2018).
  13. Cook, J. A., et al. Immediate Lymphatic Reconstruction after Axillary Lymphadenectomy: A Single-Institution Early Experience. Annals of Surgical Oncology. , (2020).
  14. Cook, J. A., Hassanein, A. H. ASO Author Reflections: Immediate Lymphatic Reconstruction: A Proactive Approach to Breast Cancer-Related Lymphedema. Annals of Surgical Oncology. , (2020).
  15. Johansson, K., Branje, E. Arm lymphoedema in a cohort of breast cancer survivors 10 years after diagnosis. Acta Oncologica. 49 (2), 166-173 (2010).
  16. Johnson, A. R., et al. Lymphedema Incidence After Axillary Lymph Node Dissection: Quantifying the Impact of Radiation and the Lymphatic Microsurgical Preventive Healing Approach. Annals of Plastic Surgery. 82, 234-241 (2019).
  17. Gartner, R., Mejdahl, M. K., Andersen, K. G., Ewertz, M., Kroman, N. Development in self-reported arm-lymphedema in Danish women treated for early-stage breast cancer in 2005 and 2006--a nationwide follow-up study. Breast. 23 (4), 445-452 (2014).
  18. Shin, W. S., Rockson, S. G. Animal models for the molecular and mechanistic study of lymphatic biology and disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 50-74 (2008).
  19. Tobbia, D., et al. Lymphedema development and lymphatic function following lymph node excision in sheep. Journal of Vascular Research. 46 (5), 426-434 (2009).
  20. Olszewski, W., Machowski, Z., Sokolowski, J., Nielubowicz, J. Experimental lymphedema in dogs. Journal of Cardiovascular Surgery. 9 (2), 178-183 (1968).
  21. Rutkowski, J. M., Moya, M., Johannes, J., Goldman, J., Swartz, M. A. Secondary lymphedema in the mouse tail: Lymphatic hyperplasia, VEGF-C upregulation, and the protective role of MMP-9. Microvascular Research. 72 (3), 161-171 (2006).
  22. Tabibiazar, R., et al. Inflammatory manifestations of experimental lymphatic insufficiency. PLoS Medicine. 3 (7), 254 (2006).
  23. Slavin, S. A., Van den Abbeele, A. D., Losken, A., Swartz, M. A., Jain, R. K. Return of lymphatic function after flap transfer for acute lymphedema. Annals of Surgery. 229 (3), 421-427 (1999).
  24. Zampell, J. C., et al. Toll-like receptor deficiency worsens inflammation and lymphedema after lymphatic injury. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 302 (4), 709-719 (2012).
  25. Gardenier, J. C., et al. Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema. JCI Insight. 1 (15), 84095 (2016).
  26. Weiler, M. J., Cribb, M. T., Nepiyushchikh, Z., Nelson, T. S., Dixon, J. B. A novel mouse tail lymphedema model for observing lymphatic pump failure during lymphedema development. Scientific Reports. 9 (1), 10405 (2019).
  27. Avraham, T., et al. Th2 differentiation is necessary for soft tissue fibrosis and lymphatic dysfunction resulting from lymphedema. FASEB J. 27 (3), 1114-1126 (2013).
  28. Zampell, J. C., et al. CD4(+) cells regulate fibrosis and lymphangiogenesis in response to lymphatic fluid stasis. PLoS One. 7 (11), 49940 (2012).
  29. Arruda, G., Ariga, S., de Lima, T. M., Souza, H. P., Andrade, M. A modified mouse-tail lymphedema model. Lymphology. 53 (1), 29-37 (2020).
  30. Jun, H., et al. Modified Mouse Models of Chronic Secondary Lymphedema: Tail and Hind Limb Models. Annals of Vascular Surgery. 43, 288-295 (2017).
  31. Karkkainen, M. J., et al. A model for gene therapy of human hereditary lymphedema. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (22), 12677-12682 (2001).
  32. Yoon, Y. S., et al. VEGF-C gene therapy augments postnatal lymphangiogenesis and ameliorates secondary lymphedema. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 717-725 (2003).
  33. Gallego-Perez, D., et al. Topical tissue nano-transfection mediates non-viral stroma reprogramming and rescue. Nature Nanotechnology. 12 (10), 974-979 (2017).
  34. Moore, J. T., et al. Nanochannel-Based Poration Drives Benign and Effective Nonviral Gene Delivery to Peripheral Nerve Tissue. Advanced Biosystems. , 2000157 (2020).
  35. Zhou, X., et al. Exosome-Mediated Crosstalk between Keratinocytes and Macrophages in Cutaneous Wound Healing. ACS Nano. 14 (10), 12732-12748 (2020).
  36. Roy, S., et al. Neurogenic tissue nanotransfection in the management of cutaneous diabetic polyneuropathy. Nanomedicine. 28, 102220 (2020).
  37. Sitzia, J. Volume measurement in lymphoedema treatment: examination of formulae. European Journal of Cancer Care. 4 (1), 11-16 (1995).
  38. Smeltzer, D. M., Stickler, G. B., Schirger, A. Primary lymphedema in children and adolescents: a follow-up study and review. Pediatrics. 76 (2), 206-218 (1985).
  39. Maclellan, R. A., Greene, A. K. Lymphedema. Seminars in Pediatric Surgery. 23 (4), 191-197 (2014).
  40. Clavin, N. W., et al. TGF-beta1 is a negative regulator of lymphatic regeneration during wound repair. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 295 (5), 2113-2127 (2008).
  41. Gnyawali, S. C., et al. Retooling Laser Speckle Contrast Analysis Algorithm to Enhance Non-Invasive High Resolution Laser Speckle Functional Imaging of Cutaneous Microcirculation. Scientific Reports. 7, 41048 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

168TNT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved