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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il linfedema è gonfiore delle estremità causato da disfunzione linfatica. Descriviamo un modello di coda murina cronica di linfedema e il nuovo uso della tecnologia di nanotrasfezione tissutale (TNT) per la consegna del carico genetico alla coda.

Abstract

Il linfedema è gonfiore delle estremità causato da disfunzione linfatica. L'arto interessato si allarga a causa dell'accumulo di liquidi, adiposi e fibrosi. Non esiste una cura per questa malattia. Un modello di coda di topo che utilizza un'escissione cutanea focale a tutto spessore vicino alla base della coda, con conseguente gonfiore della coda, è stato utilizzato per studiare il linfedema. Tuttavia, questo modello può causare una vascolarizzazione e conseguente necrosi della coda e una risoluzione precoce del gonfiore della coda, limitandone la traducibilità clinica. Il modello di linfedema cronico della coda murina induce linfedema prolungato per 15 settimane e una perfusione affidabile alla coda. I miglioramenti del tradizionale modello di linfedema della coda murina includono 1) escissione precisa a tutto spessore e clipping linfatico utilizzando un microscopio chirurgico, 2) conferma della perfusione arteriosa e venosa post-operatoria utilizzando speckle laser ad alta risoluzione e 3) valutazione funzionale utilizzando linfangiografia laser a infrarossi verde indocianina. Utilizziamo anche la tecnologia di nanotrasfezione tissutale (TNT) per la nuova consegna non virale, transcutanea e focale del carico genetico alla vascolarizzazione della coda di topo.

Introduzione

Il linfedema è gonfiore delle estremità causato da disfunzione linfatica. L'arto interessato si allarga a causa dell'accumulo di liquidi, adiposi e fibrosi1. Il linfedema colpisce 250 milioni di persone in tutto il mondo2,3,4. Si stima che il 20-40% delle pazienti sottoposte a trattamento per tumori maligni solidi, come il cancro al seno, il melanoma, i tumori ginecologici/urologici, o i sarcomi, sviluppino linfedema 2,4,5. La morbilità da linfedema comprende infezioni ricorrenti, dolore e deformità6. Non esiste una cura per questa malattia progressiva e per tutta la vita. Le terapie attuali sono variaby efficace7 e comprendono compressione, terapia decongestionante completa da parte di fisioterapisti, procedure escissionali e operazioni microchirurgiche, tra cui il trasferimentodei linfonodi vascolarizzati e il bypass linfovenoso7,8,9,10,11,12,13,14. Il trattamento ideale per il linfedema deve ancora essere scoperto.

Lo studio del meccanismo e della terapia del linfedema è stato limitato. C'è un esordio ritardato medio di un anno dopo la lesione linfatica15,16 e la maggior parte degli individui che subiscono insulto iatrogeno con radiazioni e chirurgia non sviluppano linfedema4,6,17. Sebbene siano stati descritti modelli animali di grandi dimensioni, tra cui cani, pecore e maiali18,19,20,il modello di coda di topo è stato il più ampiamente applicato a causa della facilità, del costo e della riproducibilità. I modelli murini per lo studio del linfedema includono un modello di coda, ablazione linfatica mediata dalla diptheria-tossina e dissezione linfonodale ascellare o poplitea21,22,23,24,25,26. La maggior parte dei modelli di coda utilizza un'escissione cutanea focale a tutto spessore con clipping del canale linfatico che viene eseguita vicino alla base della coda22, con conseguente gonfiore della coda e caratteristiche istologiche simili al linfedema umano24,27,28,29. Tuttavia, il modello standard di coda murina si risolve tipicamente spontaneamente in appena 20 giorni ed è accompagnato da necrosi periodica della coda30. Il modello di coda di topo del linfedema estende un linfedema sostenuto oltre le 15 settimane, dimostra una pervietà arteriosa e venosa confermata e consente la valutazione della disfunzione linfatica funzionale.

Un modello di coda murina di linfedema consente la valutazione di nuove terapie per il trattamento del linfedema. Strategie basate su geni sono state utilizzate nel modello murino mediato da vettori virali31,32. Utilizziamo anche una nuova tecnologia di nanotrasfezione tissutale (TNT) per la consegna del carico genetico alla coda di topo linfedematosa. TNT facilita la consegna diretta e transcutanea del gene utilizzando un chip con nanocanali in un campo elettrico focalizzato rapido33,34,35,36. Il modello include l'utilizzo di TNT2.0 per consentire la consegna genica focale di potenziali terapie basate su geni al sito di lesione linfatica della coda di topo35.

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Protocollo

Il protocollo segue le linee guida del comitato etico per la ricerca animale dell'istituzione. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Indiana University School of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee. Gli animali sono stati ospitati sotto un ciclo luce-buio di 12 ore con cibo e acqua ad libitum.

1. Interruzione chirurgica dei linfatici della coda di topo

  1. Utilizzare topi C57BL/6 di otto settimane di equa distribuzione di genere.
  2. Posizionare un topo in anestesia generale in una camera di induzione con il 3-4% di isoflurano in ossigeno al 100% seguito da sedazione di mantenimento all'1-3% durante la procedura.
  3. Somministrare 0,5 mg/kg di buprenorfina a rilascio prolungato (SR) per via sottocutanea per il controllo del dolore.
    NOTA: Ulteriori farmaci analgesici somministrati dopo l'operazione: Carprofene una volta ogni 24 ore per almeno 48 ore e Bupivacaina una volta dopo l'incisione o prima di chiudere l'incisione, applicato gocciolando sui bordi della pelle (dura fino a 4 – 6 ore).
  4. Posizionare il topo dorsalmente e preparare la coda con il 70% di alcool isopropilico.
  5. Misurare il diametro della coda prima della procedura con incrementi di 5 mm a partire da 20 mm dalla base della coda utilizzando una pinza. Queste misurazioni saranno utilizzate per calcolare il volume utilizzando l'equazione del cono troncato37.
  6. Segnare un'escissione circonferenziale di 3 mm sulla coda a 20 mm dalla base.
  7. Eseguire una meticolosa escissione cutanea a tutto spessore di 3 mm con una lama chirurgica sterile (taglia 15), lasciando intatta tutta la vascolarizzazione sottostante sotto ingrandimento microscopico chirurgico. Incidere il segno circonferenziale superiore (20 mm dalla base della coda) prima attraverso il derma seguito da un'incisione circonferenziale a tutto spessore di 3 mm distlal alla prima incisione.
    1. Fare un'incisione verticale perpendicolare a tutto spessore per collegare le due incisioni. Utilizzare un pickup fine dentato per afferrare un bordo d'ingresso e utilizzare microscissori per sezionare attentamente in profondità all'interno del piano avascolare al derma e superficiale all'avventizia venosa.
  8. Iniettare 0,1 mL di isosulfan blu (1%) per via sottocutanea prossimale alla punta della coda.
  9. Identificare i due canali linfatici adiacenti alle vene laterali della coda al microscopio chirurgico. I linfatici appariranno blu a causa dell'iniezione di isosulfan. Transect i linfatici usando forbici microchirurgiche dritte. Usa le forbici per sezionare attentamente un piano tra la vena laterale e il linfatico. Quindi passare la punta di una lama a forbice tra il vaso linfatico e la vena laterale e chiudere le lame per transect il vaso linfatico.
  10. Vestire la ferita della coda con una medicazione trasparente aderente sterile. Controllare quotidianamente le incisioni post-operatorie per assicurarsi che non siano infette o sanguinanti e fornire assistenza alle ferite per 2 settimane.
  11. Ospitare gli animali da solo per prevenire ulteriori lesioni alla coda e per impedire agli animali di mordersi a vicenda, il che porterebbe a complicazioni chirurgiche.

2. Valutazione vascolare della coda con imaging laser a contrasto di macchie

  1. Anestetizzare il mouse come nel passaggio 1.2.
  2. Per utilizzare l'imaging laser speckle contrast per visualizzare la vascolarizzazione della coda, impostare la larghezza su 0,8 cm, l'altezza su 1,8 cm, la densità dei punti su alta, la frequenza dei fotogrammi su 44 immagini al secondo, il tempo a 30 secondi e la foto a colori su 1 ogni 10 secondi.
  3. Valutare la perfusione venosa e arteriosa per la pervietà. Qualitativamente, la continuità del flusso dovrebbe essere visualizzata.

3. Valutazione linfatica funzionale con angiografia laser nel vicino infrarosso

  1. Anestetizzare l'animale come nel passaggio 1.2
  2. Ricostituire il verde indocianina (ICG) (25 mg/10 ml) e somministrare 0,1 mL per via sottocutanea nella coda distale del topo vicino alla punta.
  3. Attenua le luci della stanza. Posizionare l'angiografia laser nel vicino infrarosso in un'impostazione di buffering seguita dall'acquisizione dal vivo.

4. Consegna focale del carico di acido nucleico alla coda del topo utilizzando TNT

  1. Anestetizzare l'animale come nel passaggio 1.2.
  2. Esfoliare la coda di topo usando una crema esfoliante topica per la pelle.
  3. Immergere la coda di topo in una soluzione di collagenasi (10 mg/mL) a 37 °C per 5 minuti.
  4. Caricare il DNA nel serbatoio del chip TNT2.0 35.
  5. Posizionare il dispositivo con chip in silicone TNT2.0 sul sito focale di consegna desiderato sulla coda con nanonutrienti a contatto con la coda.
  6. Posizionare una sonda elettrica positiva nel serbatoio. Attaccare la sonda negativa a un ago da 30 G e inserire l'ago per via sottocutanea nella coda fino al luogo del parto.
  7. Applicare la stimolazione elettrica a impulsi a onda quadra (impulsi 10 x 10 ms, 250 V, 10 mA).

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Risultati

La tecnica per il modello di coda di topo per il linfedema sostenuto è mostrata nella Figura 1. La figura mostra l'anatomia rilevante del modello di coda di topo. La Figura 2 mostra il gonfiore progressivo e il linfedema persistente prolungato nella coda del topo dopo l'induzione del linfedema. Il volume della coda del topo, come calcolato dall'equazione del tronco di cono, raggiunge il picco alla settimana 4 e si stabilizzano a...

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Discussione

Il linfedema è classificato come una lesione primaria (congenita) o secondaria (linfatica iatrogena)38,39. Il linfedema secondario comprende il 99% dei casi39. Il linfedema secondario è più comunemente causato da infezione (filariosi) o trattamento post-oncologico con linfoadenectomia o radiazione4,39. Un modello animale traslazionale è impegnativo per il linfedema secondario, ...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse concorrenti.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni fornite dall'American Association of Plastic Surgeons Academic Scholarship e dal Dipartimento della Difesa W81XWH2110135   ad AHH. Borsa di studio della Aesthetic Surgery Education and Research Foundation a MS. NIH U01DK119099, R01NS042617 e R01DK125835 a CKS.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Tegaderm Film1626W
Surgical MicroscopeLeica, Wetzlar, GermanyMSV266
Adherent Dressing (Tegaderm)3M, St. Paul, Minn.1626W
Laser speckle (Pericam PSI System )Perimed AB, Stockholm, Sweden)PSIZ
Near-infrared laser (LUNA)Stryker (Formerly Novadaq Technologies, Toronto, Canada)LU3000
C57BL/6 miceJackson Laboratories000664
Micro-Adson Forceps - 1x2 TeethFine Science Tools (USA) Inc.11019-12
V-HookFine Science Tools (USA) Inc.18052-12
Scalpel SS NO15Fischer Scientific29556
Disposable Needle 30GX1Fischer Scientific305128
Operating ScissorsFischer Scientific12-460-796
Surgi-Or Jeweler's Forceps, Sklar 4-1/2 inFischer Scientific50-118-4255
Spring Scissors - Straight/Sharp-Sharp/8mm Cutting EdgeFine Science Tools (USA) Inc.15024-10
CardiogreenSigmaI2633-25MG
IsosulfanBlue (Lymphazurin)  50 mg/5mlMylan67457-220-05

Riferimenti

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