АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Лимфедема – это отек конечностей, вызванный лимфатической дисфункцией. Мы описываем модель хронического мышиного хвоста лимфедемы и новое использование технологии нанотрансфекции тканей (TNT) для доставки генетического груза в хвост.

Аннотация

Лимфедема – это отек конечностей, вызванный лимфатической дисфункцией. Пораженная конечность увеличивается из-за накопления жидкости, жиров и фиброза. Лекарства от этого заболевания не существует. Модель мышиного хвоста, которая использует фокальный иссечение кожи полной толщины вблизи основания хвоста, что приводит к отеку хвоста, была использована для изучения лимфедемы. Однако эта модель может привести к сосудистому некрозу хвоста и раннему разрешению отека хвоста, ограничивая его клиническую переводимость. Модель хронической лимфедемы хвоста мыса вызывает устойчивую лимфедему в течение 15 недель и надежную перфузию в хвост. Усовершенствования традиционной модели лимфедемы хвоста мышая включают в себя 1) точное иссечение полной толщины и лимфатическое клипирование с помощью хирургического микроскопа, 2) подтверждение послеоперационной артериальной и венозной перфузии с использованием лазерного пятнышка высокого разрешения и 3) функциональную оценку с использованием индоцианиновой зеленой ближней инфракрасной лазерной лимфангиографии. Мы также используем технологию нанотрансфекции тканей (TNT) для новой невирусной, чрескожной, фокальной доставки генетического груза в сосудистую клетку хвоста мыши.

Введение

Лимфедема – это отек конечностей, вызванный лимфатической дисфункцией. Пораженная конечность увеличивается из-за накопления жидкости, жировой воды и фиброза1. Лимфедема поражает 250 миллионов человек во всем мире2,3,4. Подсчитано, что у 20-40% пациентов, которые проходят лечение солидных злокачественных новообразований, таких как рак молочной железы, меланома, гинекологические/урологические опухоли или саркомы, развивается лимфедема2,4,5. Заболеваемость лимфедемой включает рецидивирующие инфекции, боль и деформацию6. Нет никакого лекарства от этого прогрессирующего, пожизненного заболевания. Современные методы лечения эффективныпри вариаби7 и включают компрессию, полную безоперационную терапию физиотерапевтами, эксцизионные процедуры и микрохирургические операции, включая васкуляризованный перенос лимфатических узлов и лимфовенозное шунтирование7,8,9,10,11,12,13,14. Идеальное лечение лимфедемы еще предстоит открыть.

Изучение механизма и терапии лимфедемы было ограничено. Существует среднее отсроченное начало в течение одного года после лимфатической травмы15,16 и большинство лиц, которые испытывают ятрогенное оскорбление с помощью радиации и хирургии, не развивают лимфедему4,6,17. Хотя модели крупных животных, включая клыки, овец и свиней, были описаны18,19,20,модель мышиного хвоста была наиболее широко применена из-за простоты, стоимости и воспроизводимости. Мышиные модели для исследования лимфедемы включают модель хвоста, диптерийно-токсинную опосредованную лимфатическую абляцию и диссекцию подмышечных или подколенных лимфатических узлов21,22,23,24,25,26. Большинство моделей хвоста используют фокальное, полной толщины иссечение кожи с обрезанием лимфатических каналов, которое выполняется вблизи основания хвоста22,в результате чего возникает отек хвоста и гистологические признаки, сходные с лимфедемой человека24,27,28,29. Однако стандартная модель хвоста мыща обычно спонтанно разрешается всего за 20 дней и сопровождается периодическим некрозом хвоста30. Модель лимфедемического хвоста мыши продлевает устойчивую лимфедему более чем на 15 недель, демонстрирует подтвержденную артериальную и венозную проходимость и позволяет оценить функциональную лимфатическую дисфункцию.

Модель лимфедемы мышиного хвоста позволяет оценить новые терапевтические средства для лечения лимфедемы. Генные стратегии были использованы в мышиной модели, опосредопосредооченной вирусными векторами31,32. Мы также используем новую технологию нанотрансфекции тканей (TNT) для доставки генетического груза в лимфедематозный хвост мыши. TNT облегчает прямую, чрескожную доставку генов с помощью чипа с наноканалами в быстро сфокусированном электрическом поле33,34,35,36. Модель включает в себя использование TNT2.0, чтобы обеспечить фокальную доставку генов потенциальных генных терапевтических средств к месту лимфатического повреждения мышиного хвоста35.

протокол

Протокол следует руководящим принципам комитета по этике исследований на животных учреждения. Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Медицинской школы Университета Индианы. Животные были размещены под 12-часовым циклом света-темноты с пищей и водой ad libitum.

1. Хирургическое нарушение лимфатической хирургии мышиного хвоста

  1. Используйте восьминедельных мышей C57BL/6 с равным гендерным распределением.
  2. Поместите мышь под общую анестезию в индукционную камеру с 3-4% изофлурана в 100% кислороде с последующей поддерживающей спокоенностью на 1-3% во время процедуры.
  3. Вводят 0,5 мг/кг бупренорфина с замедленным высвобождением (SR) подкожно для контроля боли.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные обезболивающие препараты, вводимые после операции: карпрофен один раз в 24 ч в течение не менее 48 ч и бупивакаин один раз либо после того, как был сделан разрез, либо перед закрытием разреза, наносится капельным путем капания на края кожи (длится до 4 – 6 ч).
  4. Расположите мышь дорсально и подготовите хвост 70% изопропиловым спиртом.
  5. Измерьте диаметр хвоста перед процедурой с шагом 5 мм, начиная с 20 мм от основания хвоста, используя суппорт. Эти измерения будут использоваться для расчета объема с использованием усеченного конусного уравнения37.
  6. Отметьте 3 мм окружное иссечение на хвосте в 20 мм от основания.
  7. Выполните тщательное иссечение кожи полной толщиной 3 мм стерильным хирургическим лезвием (размер 15), оставив все подлежащие сосуды нетронутыми при хирургическом микроскопическом увеличении. Сначала проденьте верхний окружной знак (20 мм от основания хвоста) через дерму, а затем окружной разрез полной толщины 3 мм до первого разреза.
    1. Сделайте перпендикулярный вертикальный разрез полной толщины, чтобы соединить два разреза. Используйте зубчатый тонкий звукосниматель, чтобы захватить передний край и использовать микросубчики, чтобы тщательно рассекать глубоко внутри аваскулярной плоскости до дермы и поверхностную к адвентиции вены.
  8. Вводят 0,1 мл изосульфана синего (1%) подкожно проксимально к кончику хвоста.
  9. Определите два лимфатических канала, прилегающих к боковым хвостовым венам, под хирургическим микроскопом. Лимфатика будет казаться синей из-за инъекции изосульфана. Трансекцию лимфатических решеток с помощью прямых микрохирургических ножниц. Используйте ножницы, чтобы тщательно рассекать плоскость между боковой веной и лимфатической. Затем проведите кончик одной ножничной лопатки между лимфатическим сосудом и боковой веной и закройте лопасти, чтобы трансектировать лимфатический сосуд.
  10. Завязывание раны хвоста стерильной адгезивной прозрачной повязкой. Ежедневно проверяйте послеоперационные разрезы, чтобы убедиться, что они не инфицированы или не кровоточат, и обеспечьте уход за раной в течение 2 недель.
  11. Размещайте животных поо отдельно, чтобы предотвратить дальнейшее повреждение хвоста и предотвратить укус животных друг друга, что приведет к хирургическим осложнениям.

2. Оценка хвостовой сосуда с помощью лазерной спекл-контрастной визуализации

  1. Обезболивайте мышь, как по состоянию на шаге 1.2.
  2. Чтобы использовать лазерное спекл-контрастное изображение для визуализации сосудистости хвоста, установите ширину 0,8 см, высоту 1,8 см, высокую плотность точек, частоту кадров 44 изображения в секунду, время 30 секунд и цветную фотографию 1 раз в 10 секунд.
  3. Оцените венозную и артериальную перфузию на проходимость. Качественно следует визуализировать непрерывность потока.

3. Функциональная лимфатическая оценка с помощью лазерной ангиографии ближнего инфракрасного диапазона

  1. Обезболить животное, как на этапе 1.2
  2. Повторно вводят индоцианин зеленый (ICG) (25 мг/10 мл) и вводят 0,1 мл подкожно в дистальный хвост мыши возле кончика.
  3. Приглушите свет в комнате. Поместите лазерную ангиографию в ближнем инфракрасном диапазоне в буферную настройку с последующим захватом в реальном времени.

4. Фокальная доставка груза нуклеиновых кислот в хвост мыши с использованием тротила

  1. Обезболить животное, как на шаге 1.2.
  2. Отшелушивайте хвост мыши с помощью местного крема для отшелушивания кожи.
  3. Погрузите хвост мыши в раствор коллагеназы (10 мг/мл) при 37 °C в течение 5 минут.
  4. Загрузите ДНК в резервуар чипа TNT2.0 35.
  5. Поместите силиконовое чиповое устройство TNT2.0 над нужным фокальным местом доставки на хвосте с наноиглами, контактировками с хвостом.
  6. Поместите положительный электрический зонд в резервуар. Прикрепите отрицательный зонд к игле 30 G и вставьте иглу подкожно в хвост к месту доставки.
  7. Примените квадратную импульсную электростимуляцию (импульсы 10 x 10 мс, 250 В, 10 мА).

Результаты

Методика моделирования хвоста мыши для устойчивой лимфедемы показана на рисунке 1. На рисунке представлена соответствующая анатомия модели мышиного хвоста. Рисунок 2 демонстрирует прогрессирующий отек и устойчивую персистентную лимф...

Обсуждение

Лимфедема классифицируется как первичное (врожденное) или вторичное (ятрогенное лимфатическое) повреждение38,39. Вторичная лимфедема составляет 99% случаев39. Вторичная лимфедема чаще всего вызывается инфекцией (филяриатозом) или постонсологи...

Раскрытие информации

У авторов нет конкурирующих конфликтов интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантовой поддержкой, предоставленным Американской ассоциацией пластических хирургов Академической стипендией и Министерством обороны W81XWH2110135   для AHH. Грант Фонда образования и исследований эстетической хирургии MS. NIH U01DK119099, R01NS042617 и R01DK125835 для CKS.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Surgical MicroscopeLeica, Wetzlar, GermanyMSV266
Adherent Dressing (Tegaderm)3M, St. Paul, Minn.1626W
Laser speckle (Pericam PSI System )Perimed AB, Stockholm, Sweden)PSIZ
Near-infrared laser (LUNA)Stryker (Formerly Novadaq Technologies, Toronto, Canada)LU3000
C57BL/6 miceJackson Laboratories000664
Micro-Adson Forceps - 1x2 TeethFine Science Tools (USA) Inc.11019-12
V-HookFine Science Tools (USA) Inc.18052-12
Scalpel SS NO15Fischer Scientific29556
Disposable Needle 30GX1Fischer Scientific305128
Operating ScissorsFischer Scientific12-460-796
Surgi-Or Jeweler's Forceps, Sklar 4-1/2 inFischer Scientific50-118-4255
Spring Scissors - Straight/Sharp-Sharp/8mm Cutting EdgeFine Science Tools (USA) Inc.15024-10
CardiogreenSigmaI2633-25MG
IsosulfanBlue (Lymphazurin)  50 mg/5mlMylan67457-220-05

Ссылки

  1. Kataru, R. P., et al. Fibrosis and secondary lymphedema: chicken or egg. Translation Research. 209, 68-76 (2019).
  2. Brayton, K. M., et al. Lymphedema prevalence and treatment benefits in cancer: impact of a therapeutic intervention on health outcomes and costs. PLoS One. 9 (12), 114597 (2014).
  3. Mendoza, N., Li, A., Gill, A., Tyring, S. Filariasis: diagnosis and treatment. Dermatology and Therapy. 22 (6), 475-490 (2009).
  4. Rockson, S. G., Rivera, K. K. Estimating the population burden of lymphedema. Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 147-154 (2008).
  5. Soran, A., et al. Breast cancer-related lymphedema--what are the significant predictors and how they affect the severity of lymphedema. Breast Journal. 12 (6), 536-543 (2006).
  6. Hayes, S. C., et al. Upper-body morbidity after breast cancer: incidence and evidence for evaluation, prevention, and management within a prospective surveillance model of care. Cancer. 118, 2237-2249 (2012).
  7. Carl, H. M., et al. Systematic Review of the Surgical Treatment of Extremity Lymphedema. Journal of Reconstructive Microsurgery. 33 (6), 412-425 (2017).
  8. Garza, R., Skoracki, R., Hock, K., Povoski, S. P. A comprehensive overview on the surgical management of secondary lymphedema of the upper and lower extremities related to prior oncologic therapies. BMC Cancer. 17 (1), 468 (2017).
  9. Hassanein, A. H., et al. Deep Inferior Epigastric Artery Vascularized Lymph Node Transfer: A Simple and Safe Option for Lymphedema. Journal of Plastic, Reconstructive, Aesthetic Surgery. 73 (10), 1897-1916 (2020).
  10. Hassanein, A. H., Sacks, J. M., Cooney, D. S. Optimizing perioperative lymphatic-venous anastomosis localization using transcutaneous vein illumination, isosulfan blue, and indocyanine green lymphangiography. Microsurgery. 37 (8), 956-957 (2017).
  11. Chang, D. W., Masia, J., Garza, R., Skoracki, R., Neligan, P. C. Lymphedema: Surgical and Medical Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 138, 209-218 (2016).
  12. Gould, D. J., Mehrara, B. J., Neligan, P., Cheng, M. H., Patel, K. M. Lymph node transplantation for the treatment of lymphedema. Journal of Surgical Oncology. 118 (5), 736-742 (2018).
  13. Cook, J. A., et al. Immediate Lymphatic Reconstruction after Axillary Lymphadenectomy: A Single-Institution Early Experience. Annals of Surgical Oncology. , (2020).
  14. Cook, J. A., Hassanein, A. H. ASO Author Reflections: Immediate Lymphatic Reconstruction: A Proactive Approach to Breast Cancer-Related Lymphedema. Annals of Surgical Oncology. , (2020).
  15. Johansson, K., Branje, E. Arm lymphoedema in a cohort of breast cancer survivors 10 years after diagnosis. Acta Oncologica. 49 (2), 166-173 (2010).
  16. Johnson, A. R., et al. Lymphedema Incidence After Axillary Lymph Node Dissection: Quantifying the Impact of Radiation and the Lymphatic Microsurgical Preventive Healing Approach. Annals of Plastic Surgery. 82, 234-241 (2019).
  17. Gartner, R., Mejdahl, M. K., Andersen, K. G., Ewertz, M., Kroman, N. Development in self-reported arm-lymphedema in Danish women treated for early-stage breast cancer in 2005 and 2006--a nationwide follow-up study. Breast. 23 (4), 445-452 (2014).
  18. Shin, W. S., Rockson, S. G. Animal models for the molecular and mechanistic study of lymphatic biology and disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 50-74 (2008).
  19. Tobbia, D., et al. Lymphedema development and lymphatic function following lymph node excision in sheep. Journal of Vascular Research. 46 (5), 426-434 (2009).
  20. Olszewski, W., Machowski, Z., Sokolowski, J., Nielubowicz, J. Experimental lymphedema in dogs. Journal of Cardiovascular Surgery. 9 (2), 178-183 (1968).
  21. Rutkowski, J. M., Moya, M., Johannes, J., Goldman, J., Swartz, M. A. Secondary lymphedema in the mouse tail: Lymphatic hyperplasia, VEGF-C upregulation, and the protective role of MMP-9. Microvascular Research. 72 (3), 161-171 (2006).
  22. Tabibiazar, R., et al. Inflammatory manifestations of experimental lymphatic insufficiency. PLoS Medicine. 3 (7), 254 (2006).
  23. Slavin, S. A., Van den Abbeele, A. D., Losken, A., Swartz, M. A., Jain, R. K. Return of lymphatic function after flap transfer for acute lymphedema. Annals of Surgery. 229 (3), 421-427 (1999).
  24. Zampell, J. C., et al. Toll-like receptor deficiency worsens inflammation and lymphedema after lymphatic injury. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 302 (4), 709-719 (2012).
  25. Gardenier, J. C., et al. Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema. JCI Insight. 1 (15), 84095 (2016).
  26. Weiler, M. J., Cribb, M. T., Nepiyushchikh, Z., Nelson, T. S., Dixon, J. B. A novel mouse tail lymphedema model for observing lymphatic pump failure during lymphedema development. Scientific Reports. 9 (1), 10405 (2019).
  27. Avraham, T., et al. Th2 differentiation is necessary for soft tissue fibrosis and lymphatic dysfunction resulting from lymphedema. FASEB J. 27 (3), 1114-1126 (2013).
  28. Zampell, J. C., et al. CD4(+) cells regulate fibrosis and lymphangiogenesis in response to lymphatic fluid stasis. PLoS One. 7 (11), 49940 (2012).
  29. Arruda, G., Ariga, S., de Lima, T. M., Souza, H. P., Andrade, M. A modified mouse-tail lymphedema model. Lymphology. 53 (1), 29-37 (2020).
  30. Jun, H., et al. Modified Mouse Models of Chronic Secondary Lymphedema: Tail and Hind Limb Models. Annals of Vascular Surgery. 43, 288-295 (2017).
  31. Karkkainen, M. J., et al. A model for gene therapy of human hereditary lymphedema. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (22), 12677-12682 (2001).
  32. Yoon, Y. S., et al. VEGF-C gene therapy augments postnatal lymphangiogenesis and ameliorates secondary lymphedema. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 717-725 (2003).
  33. Gallego-Perez, D., et al. Topical tissue nano-transfection mediates non-viral stroma reprogramming and rescue. Nature Nanotechnology. 12 (10), 974-979 (2017).
  34. Moore, J. T., et al. Nanochannel-Based Poration Drives Benign and Effective Nonviral Gene Delivery to Peripheral Nerve Tissue. Advanced Biosystems. , 2000157 (2020).
  35. Zhou, X., et al. Exosome-Mediated Crosstalk between Keratinocytes and Macrophages in Cutaneous Wound Healing. ACS Nano. 14 (10), 12732-12748 (2020).
  36. Roy, S., et al. Neurogenic tissue nanotransfection in the management of cutaneous diabetic polyneuropathy. Nanomedicine. 28, 102220 (2020).
  37. Sitzia, J. Volume measurement in lymphoedema treatment: examination of formulae. European Journal of Cancer Care. 4 (1), 11-16 (1995).
  38. Smeltzer, D. M., Stickler, G. B., Schirger, A. Primary lymphedema in children and adolescents: a follow-up study and review. Pediatrics. 76 (2), 206-218 (1985).
  39. Maclellan, R. A., Greene, A. K. Lymphedema. Seminars in Pediatric Surgery. 23 (4), 191-197 (2014).
  40. Clavin, N. W., et al. TGF-beta1 is a negative regulator of lymphatic regeneration during wound repair. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 295 (5), 2113-2127 (2008).
  41. Gnyawali, S. C., et al. Retooling Laser Speckle Contrast Analysis Algorithm to Enhance Non-Invasive High Resolution Laser Speckle Functional Imaging of Cutaneous Microcirculation. Scientific Reports. 7, 41048 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

168

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены