Un modèle de lymphœdème de la queue murine

Résumé

Le lymphœdème est un gonflement des extrémités causé par un dysfonctionnement lymphatique. Nous décrivons un modèle chronique de la queue murine du lymphœdème et la nouvelle utilisation de la technologie de nanotransfection tissulaire (TNT) pour l’administration de cargaisons génétiques à la queue.

Résumé

Le lymphœdème est un gonflement des extrémités causé par un dysfonctionnement lymphatique. Le membre affecté s’agrandit en raison de l’accumulation de liquide, d’adipeux et de fibrose. Il n’y a pas de remède pour cette maladie. Un modèle de queue de souris qui utilise une excision focale de la peau de pleine épaisseur près de la base de la queue, entraînant un gonflement de la queue, a été utilisé pour étudier le lymphœdème. Cependant, ce modèle peut entraîner une nécrose vasculaire de la queue et une résolution précoce de l’enflure de la queue, limitant sa traductibilité clinique. Le modèle de lymphœdème chronique murin de la queue induit un lymphœdème soutenu sur 15 semaines et une perfusion fiable à la queue. Les améliorations apportées au modèle traditionnel de lymphœdème murin de la queue comprennent 1) une excision précise de pleine épaisseur et une coupure lymphatique à l’aide d’un microscope chirurgical, 2) la confirmation de la perfusion artérielle et veineuse postopératoire à l’aide de mouchetures laser à haute résolution et 3) une évaluation fonctionnelle à l’aide d’une lymphangiographie laser proche infrarouge vert indocyanine. Nous utilisons également la technologie de nanotransfection tissulaire (TNT) pour une nouvelle livraison focale non virale, transcutanée et focale de cargaison génétique au système vasculaire de la queue de souris.

Introduction

Le lymphœdème est un gonflement des extrémités causé par un dysfonctionnement lymphatique. Le membre affecté s’agrandit en raison de l’accumulation de liquide, d’adipeux et de fibrose¹. Le lymphœdème touche 250 millions de personnes dans le monde^2,3,4. On estime que 20 à 40% des patientes qui subissent un traitement pour des tumeurs malignes solides, telles que le cancer du sein, le mélanome, les tumeurs gynécologiques / urologiques ou les sarcomes, développent un lymphœdème^2,4,5. La morbidité causée par le lymphœdème comprend les infections récurrentes, la douleur et la déformation⁶. Il n’y a pas de remède pour cette maladie progressive qui dure toute la vie. Lesthérapies actuelles sont variaby^{efficaces 7} et comprennent la compression, la thérapie décongestionnante complète par les physiothérapeutes, les procédures excisionnelles et les opérations microchirurgicales, y compris le transfert de ganglions lymphatiques vascularisés et le pontage lymphoveneux^{7,8,9,10 , 11},^12,13^,14. Le traitement idéal pour le lymphœdème n’a pas encore été découvert.

L’étude du mécanisme et du traitement du lymphœdème a été limitée. Il y a un début retardé moyen d’un an après la lésion lymphatique^15,16 et la plupart des personnes qui subissent une insulte iatrogène avec radiothérapie et chirurgie ne développent pas de lymphœdème^4,6,17. Bien que de grands modèles animaux, y compris canins, moutons et porcins aient été^décrits18,^19,20, le modèle de queue de souris a été le plus largement appliqué en raison de sa facilité, de son coût et de sa reproductibilité. Les modèles murins pour l’étude du lymphœdème comprennent un modèle de queue, une ablation lymphatique médiée par la diphtérie et un curage ganglionnaire axillaire ou poplitéal^{21,22,23,24,25,26}. La plupart des modèles de queue utilisent une excision focale de la peau de pleine épaisseur avec coupure du canal lymphatique qui est effectuée près de la base de la queue²², entraînant un gonflement de la queue et des caractéristiques histologiques similaires au lymphœdème humain^24,27,28,29. Cependant, le modèle standard de la queue murine se résout généralement en aussi peu que 20 jours et s’accompagne d’une nécrose périodique de la queue³⁰. Le modèle de la queue de souris lymphœdème prolonge un lymphœdème soutenu au-delà de 15 semaines, démontre une perméabilité artérielle et veineuse confirmée et permet une évaluation du dysfonctionnement lymphatique fonctionnel.

Un modèle de lymphœdème à queue murine permet d’évaluer de nouveaux traitements pour traiter le lymphœdème. Des stratégies basées sur les gènes ont été utilisées dans le modèle murin médié par des vecteurs viraux^31,32. Nous utilisons également une nouvelle technologie de nanotransfection tissulaire (TNT) pour l’administration de cargaisons génétiques à la queue de souris lymphœdémateuse. TNT facilite l’administration directe et transcutanée de gènes à l’aide d’une puce avec des nanocanaux dans un champ électrique focalé rapide^33,34,35,36. Le modèle comprend l’utilisation de TNT_2.0 pour permettre l’administration de gènes focaux de thérapies potentielles à base de gènes au site de lésion lymphatique de la queue de souris³⁵.

Protocole

Le protocole suit les lignes directrices du comité d’éthique de la recherche animale de l’établissement. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’École de médecine de l’Indiana. Les animaux étaient logés sous un cycle lumière-obscurité de 12 heures avec de la nourriture et de l’eau ad libitum.

1. Perturbation chirurgicale des lymphatiques de la queue de souris

1. Utilisez des souris C57BL/6 âgées de huit semaines de répartition égale entre les sexes.
2. Placer une souris sous anesthésie générale dans une chambre d’induction avec 3-4% d’isoflurane dans 100% d’oxygène suivie d’une sédation d’entretien à 1-3% pendant la procédure.
3. Administrer 0,5 mg/kg de buprénorphine à libération prolongée (SR) par voie sous-cutanée pour le contrôle de la douleur.
   REMARQUE: Médicaments analgésiques supplémentaires administrés après l’opération: Carprofène une fois toutes les 24 h pendant au moins 48 h et Bupivacaïne une fois après l’incision ou avant de fermer l’incision, appliqué en dégoulinant sur les bords de la peau (dure jusqu’à 4 – 6 h).
4. Positionnez la souris dorsalement et préparez la queue avec de l’alcool isopropylique à 70%.
5. Mesurez le diamètre de la queue avant la procédure par incréments de 5 mm à partir de 20 mm de la base de la queue à l’aide d’un étrier. Ces mesures seront utilisées pour calculer le volume à l’aide de l’équation du cône tronqué³⁷.
6. Marquez une excision circonférentielle de 3 mm sur la queue à 20 mm de la base.
7. Effectuez une excision méticuleuse de la peau de 3 mm sur toute l’épaisseur avec une lame chirurgicale stérile (taille 15), en laissant toute la vascularisation sous-jacente intacte sous un grossissement microscopique chirurgical. Inciser la marque circonférentielle supérieure (20 mm de la base de la queue) d’abord à travers le derme, suivie d’une incision circonférentielle de pleine épaisseur de 3 mm distlal à la première incision.
   1. Faites une incision verticale perpendiculaire de pleine épaisseur pour relier les deux incisions. Utilisez un micro fin denté pour saisir un bord d’attaque et utilisez des microcisseurs pour disséquer soigneusement profondément dans le plan avasculaire jusqu’au derme et superficiel à l’adventitie veineuse.
8. Injecter 0,1 mL de bleu d’isosulfan (1 %) par voie sous-cutanée proximale jusqu’au bout de la queue.
9. Identifier les deux canaux lymphatiques adjacents aux veines latérales de la queue au microscope chirurgical. Les lymphatiques apparaîtront bleus à cause de l’injection d’isosulfan. Transectez les lymphatiques à l’aide de ciseaux microchirurgicaux droits. Utilisez les ciseaux pour disséquer soigneusement un plan entre la veine latérale et le lymphatique. Ensuite, passez la pointe d’une lame de ciseaux entre le vaisseau lymphatique et la veine latérale et fermez les lames pour transecter le vaisseau lymphatique.
10. Habillez la plaie de la queue avec un pansement transparent adhérent stérile. Vérifiez quotidiennement les incisions postopéroïdes pour vous assurer qu’elles ne sont pas infectées ou ne saignent pas et fournissez des soins aux plaies pendant 2 semaines.
11. Hébergez les animaux individuellement pour éviter toute autre blessure à la queue et pour empêcher les animaux de se mordre les uns les autres, ce qui entraînerait des complications chirurgicales.

2. Évaluation vasculaire de la queue avec imagerie de contraste de moucheture laser

1. Anesthésiez la souris comme à l’étape 1.2.
2. Pour utiliser l’imagerie de contraste de moucheture laser pour visualiser la vascularité de la queue, réglez la largeur sur 0,8 cm, la hauteur sur 1,8 cm, la densité de points sur élevée, la fréquence d’images sur 44 images/ seconde, le temps sur 30 secondes et la photo couleur sur 1 par 10 secondes.
3. Évaluer la perfusion veineuse et artérielle pour la perméabilité. Qualitativement, la continuité du flux doit être visualisée.

3. Évaluation lymphatique fonctionnelle avec angiographie laser proche infrarouge

1. Anesthésier l’animal comme à l’étape 1.2
2. Reconstituer l’indocyanine verte (ICG) (25 mg/10 mL) et administrer 0,1 mL par voie sous-cutanée dans la queue distale de la souris près de la pointe.
3. Éteignez les lumières de la pièce. Placez l’angiographie laser proche infrarouge dans un réglage tampon suivi d’une capture en direct.

4. Livraison focale de la cargaison d’acide nucléique à la queue de souris à l’aide de TNT

1. Anesthésier l’animal comme à l’étape 1.2.
2. Exfoliez la queue de souris à l’aide d’une crème topique d’exfoliation de la peau.
3. Immerger la queue de souris dans une solution de collagénase (10 mg/mL) à 37 °C pendant 5 minutes.
4. Charger l’ADN dans le réservoir de puce TNT_2.0 ³⁵.
5. Placez le dispositif à puce en silicone TNT_2.0 sur le site focal de livraison souhaité sur la queue avec des nano-besoins en contact avec la queue.
6. Placez une sonde électrique positive dans le réservoir. Fixez la sonde négative à une aiguille de 30 G et insérez l’aiguille par voie sous-cutanée dans la queue jusqu’au site d’accouchement.
7. Appliquer une stimulation électrique à impulsions carrées (impulsions de 10 x 10 ms, 250 V, 10 mA).

Résultats

La technique du modèle de queue de souris pour le lymphœdème soutenu est illustrée à la figure 1. La figure montre l’anatomie pertinente du modèle de queue de souris. La figure 2 montre l’enflure progressive et le lymphœdème persistant soutenu dans la queue de la souris après l’induction du lymphœdème. Le volume de la queue de souris, tel que calculé par l’équation du cône tronqué, culmine à la semaine 4 e...

Discussion

Le lymphœdème est classé comme une lésion primaire (congénitale) ou secondaire (lymphatique iatrogène)^38,39. Le lymphœdème secondaire représente 99% des cas³⁹. Le lymphœdème secondaire est le plus souvent causé par une infection (filariose) ou un traitement post-oncologique par lymphadénectomie ou radiothérapie^4,39. Un modèle animal translationnel est difficile pour ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tegaderm Film		1626W
Surgical Microscope	Leica, Wetzlar, Germany	MSV266
Adherent Dressing (Tegaderm)	3M, St. Paul, Minn.	1626W
Laser speckle (Pericam PSI System )	Perimed AB, Stockholm, Sweden)	PSIZ
Near-infrared laser (LUNA)	Stryker (Formerly Novadaq Technologies, Toronto, Canada)	LU3000
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories	000664
Micro-Adson Forceps - 1x2 Teeth	Fine Science Tools (USA) Inc.	11019-12
V-Hook	Fine Science Tools (USA) Inc.	18052-12
Scalpel SS NO15	Fischer Scientific	29556
Disposable Needle 30GX1	Fischer Scientific	305128
Operating Scissors	Fischer Scientific	12-460-796
Surgi-Or Jeweler's Forceps, Sklar 4-1/2 in	Fischer Scientific	50-118-4255
Spring Scissors - Straight/Sharp-Sharp/8mm Cutting Edge	Fine Science Tools (USA) Inc.	15024-10
Cardiogreen	Sigma	I2633-25MG
IsosulfanBlue (Lymphazurin)  50 mg/5ml	Mylan	67457-220-05