Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Lenfödem, lenfatik disfonksiyondan kaynaklanan ekstremite şişmesidir. Lenfödemin kronik bir murine kuyruk modelini ve kuyruğa genetik kargo teslimatı için doku nanotransfeksiyon teknolojisinin (TNT) yeni kullanımını anlatıyoruz.

Özet

Lenfödem, lenfatik disfonksiyondan kaynaklanan ekstremite şişmesidir. Etkilenen uzuv sıvı, yağ ve fibrozis birikimi nedeniyle büyür. Bu hastalığın tedavisi yoktur. Lenfödem çalışması için kuyruğun tabanına yakın bir odak tam kalınlıkta cilt eksizyonu kullanan ve kuyruk şişmesine neden olan bir fare kuyruk modeli kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu model vasküler oluşur ve sonuç olarak kuyruk nekrozu ve erken kuyruk şişmesi çözünürlüğü ile klinik çevrilebilirliğini sınırlayabilir. Kronik murin kuyruk lenfödem modeli, 15 hafta boyunca sürekli lenfödemi ve kuyruğa güvenilir bir perfüzyonu indükler. Geleneksel murine kuyruk lenfödem modelinin geliştirmeleri arasında 1) cerrahi bir mikroskop kullanılarak hassas tam kalınlıkta eksizyon ve lenfatik kupür, 2) yüksek çözünürlüklü lazer benek kullanılarak ameliyat sonrası arteriyel ve venöz perfüzyonun onaylanması ve 3) kızılötesi lazer limphangiografisi yakın indocyanine yeşili kullanılarak fonksiyonel değerlendirme. Ayrıca genetik kargonun fare kuyruğu vaskülatına yeni viral olmayan, transkütan, odaksal teslimatı için doku nanotransfeksiyon teknolojisini (TNT) kullanıyoruz.

Giriş

Lenfödem, lenfatik disfonksiyondan kaynaklanan ekstremite şişmesidir. Etkilenen uzuv sıvı, yağ ve fibrozis birikimi nedeniyle büyür1. Lenfödem dünya çapında 250 milyon kişiyi etkiler2,3,4. Meme kanseri, melanom, jinekolojik/ürolojik tümörler veya sarkomlar gibi katı maligniteler için tedavi gören hastaların %20-40'ında lenfödemgeliştiğitahmin edilmektedir 2,4,5. Lenfödem morbidite tekrarlayan enfeksiyonlar, ağrı ve deformite içerir6. Bu ilerleyici, yaşam boyu süren hastalığın tedavisi yoktur. Mevcut tedaviler variaby etkili7'dir ve kompresyon, fizyoterapistler tarafından komple dekonjestif tedavi, eksizyonel prosedürler ve damarlı lenf nodu transferi ve lenfovenöz bypass 7 , 8 , 9,10,11,12,13,14dahil olmak üzere mikrocerrahi operasyonları içerir. Lenfödem için ideal tedavi henüz keşfedilmedi.

Lenfödem mekanizmasının ve tedavisinin incelenmesi sınırlı olmuştur. Lenfatik yaralanmadan sonra ortalama bir yıl gecikmeli başlangıç vardır15,16 ve radyasyon ve cerrahi ile iyatrojenik hakaret yaşayan çoğu birey lenfödemgeliştirmez 4,6,17. Köpek, koyun ve domuz da dahil olmak üzere büyük hayvan modelleri tanımlanmış olmasına rağmen18,19,20, fare kuyruk modeli kolaylık, maliyet ve çoğaltma nedeniyle en yaygın olarak uygulanmıştır. Lenfödemi araştırmak için fare modelleri bir kuyruk modeli, difteri-toksin aracılı lenfatik ablasyon ve aksiller veya popliteal lenf nodu diseksiyonu21,22,23,24,25,26içerir. Çoğu kuyruk modeli, kuyruğun tabanına yakın gerçekleştirilen lenfatik kanal kırpmalı bir odak, tam kalınlıkta cilt eksizyonu kullanır22, kuyruk şişmesi ve insan lenfödemi benzeri histolojik özelliklerle sonuçlanır24,27,28,29. Bununla birlikte, standart murine kuyruk modeli tipik olarak 20 gün gibi kısa bir sürede kendiliğinden çözülür ve periyodik kuyruk nekrozu30eşlik eder. Lenfödem fare kuyruk modeli, sürekli bir lenfödemi 15 haftanın ötesine uzatır, doğrulanmış arteriyel ve venöz açıklığı gösterir ve fonksiyonel lenfatik disfonksiyon değerlendirmesine izin verir.

Lenfödemin bir murine kuyruk modeli, lenfödemi tedavi etmek için yeni terapötiklerin değerlendirilmesini sağlar. Viral vektörlerin aracılık ettiği fare modelinde gen bazlı stratejiler kullanılmıştır31,32. Lenfömatöz fare kuyruğuna genetik kargo teslimatı için yeni bir doku nanotransfeksiyon teknolojisi (TNT) de kullanıyoruz. TNT, hızlı odaklanmış bir elektrik alanında nanokanelli bir çip kullanarakdoğrudan,transkütan gen iletimini kolaylaştırır33,34,35,36. Model, potansiyel gen bazlı terapötiklerin fare kuyruğunun lenfatik yaralanma bölgesine odak gen teslimatına izin vermek için TNT2.0'ın kullanılmasını içerir35.

Protokol

Protokol, kurumun hayvan araştırma etik komitesinin yönergelerine uyar. Tüm hayvan deneyleri Indiana Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Hayvanlar, yiyecek ve su reklam libitum ile 12 saatlik açık-karanlık bir döngü altında barındırıldı.

1. Fare Kuyruğu Lenfatiklerinin Cerrahi Bozulması

  1. Eşit cinsiyet dağılımında sekiz haftalık C57BL/6 fare kullanın.
  2. İşlem sırasında %100 oksijende %3-4 izofluran ve ardından %1-3 oranında bakım sedasyonu olan bir indüksiyon odasına genel anestezi altında bir fare yerleştirin.
  3. Ağrı kontrolü için 0,5 mg/kg sürekli salınım (SR) buprenorfin subkutan olarak uygulanır.
    NOT: Ameliyat sonrası uygulanan ek analjezik ilaçlar: Carprofen her 24 saat en az 48 saat boyunca ve Bupivacaine bir kez ya kesi yapıldıktan sonra ya da kesiyi kapatmadan önce, cilt kenarlarına damlatılarak uygulanır (4 – 6 saate kadar sürer).
  4. Fareyi dorsally yerleştirin ve kuyruğu% 70 izopropil alkolle hazırlayın.
  5. İşlemden önce kuyruk çapını bir kaliper kullanarak kuyruğun tabanından 20 mm'den başlayan 5 mm'lik artışlarla ölçün. Bu ölçümler, kesilen koni denklemi37kullanılarak hacmi hesaplamak için kullanılacaktır.
  6. Kuyrukta tabandan 20 mm uzaklıkta 3 mm'lik bir çevresel eksizyon işaretleyin.
  7. Steril bir cerrahi bıçak (15 beden) ile titiz bir 3 mm tam kalınlıklı cilt eksizyonu gerçekleştirin ve alttaki tüm vaskülatları cerrahi mikroskobik büyütme altında sağlam bırakın. Önce dermisten geçen üstün çevresel işareti (kuyruk tabanından 20 mm) ve ardından ilk kesiye 3 mm distlal olan çevresel tam kalınlıklı bir kesiyi inkünleyin.
    1. İki kesiyi bağlamak için dik tam kalınlıklı dikey kesi yapın. Önde gelen bir kenarı kavramak için dişli ince bir pikap kullanın ve avasküler düzlemin derinliklerinde dermis ve damar adventitiasına yüzeysel olarak dikkatlice parçalamak için mikros makas kullanın.
  8. Kuyruğun ucuna 0,1 mL izosulfan mavisi (%1) deri altı proksimal enjekte edin.
  9. Cerrahi mikroskop altında lateral kuyruk damarlarına bitişik iki lenfatik kanalı tanımlayın. Lenfatikler izosülfan enjeksiyonu nedeniyle mavi görünecektir. Lenfatikleri düz mikrocerrahi makas kullanarak transekte edin. Makası, yan damar ve lenfatik arasındaki bir düzlemi dikkatlice parçalamak için kullanın. Daha sonra bir makas bıçağının ucunu lenfatik damar ve lateral damar arasına geçirin ve lenfatik damarı transekte etmek için bıçakları kapatın.
  10. Kuyruk yarasını steril bir yapışan açık pansumanla giydirin. Enfekte veya kanama olmadığından emin olmak için ameliyat sonrası kesileri günlük olarak kontrol edin ve 2 hafta boyunca yara bakımı sağlayın.
  11. Kuyruktan daha fazla yaralanmayı önlemek ve hayvanların birbirlerini ısırmasını önlemek için hayvanları tek tek barındırın, bu da cerrahi komplikasyonlara yol açar.

2. Lazer benek kontrast görüntüleme ile kuyruk vasküler değerlendirme

  1. Fareyi adım 1.2'deki gibi uyuşturun.
  2. Kuyruk vasküleritesini görselleştirmek için lazer benek kontrastı görüntülemeyi kullanmak için genişliği 0,8 cm, yüksekliği 1,8 cm, nokta yoğunluğunu yüksek, kare hızını 44 görüntü/saniye, süreyi 30 saniye ve renkli fotoğrafı 10 saniyede 1 olarak ayarlayın.
  3. Açıklık için venöz ve arteriyel perfüzyonu değerlendirin. Nitel olarak akışın sürekliliği görselleştirilmelidir.

3. Yakın kızılötesi lazer anjiyografi ile fonksiyonel lenfatik değerlendirme

  1. Hayvanı adım 1.2'deki gibi uyuşturun
  2. İndocyanine green (ICG) (25 mg/10 mL) yeniden inşa edin ve ucun yakınındaki distal fare kuyruğuna deri altından 0,1 mL verin.
  3. Odanın ışıklarını kısın. Kızılötesi lazer anjiyografisini tamponlama ayarına ve ardından canlı yakalamaya yerleştirin.

4. TNT kullanarak fare kuyruğuna nükleik asit kargonun odaksal teslimatı

  1. Hayvanı adım 1.2'deki gibi uyuşturun.
  2. Topikal cilt eksfoliasyon kremi kullanarak fare kuyruğunu pul pul dökülür.
  3. Fare kuyruğunu 5 dakika boyunca 37 °C'de kollajenaz çözeltiye (10 mg/mL) daldırin.
  4. DNA'ları TNT2.0 çip haznesine yükleyin35.
  5. TNT2.0 silikon çip cihazını, kuyrukla temas eden nanoneedles ile kuyruk üzerinde istenen odak yeri üzerine yerleştirin.
  6. Rezervuara pozitif bir elektrik probu yerleştirin. Negatif probu 30 G'lık bir iğneye takın ve iğneyi kuyruk içine teslimat bölgesine deri altından yerleştirin.
  7. Kare dalga darbeli elektrik stimülasyonu uygulayın (10 x 10 ms darbe, 250 V, 10 mA).

Sonuçlar

Sürekli lenfödem için fare kuyruk modeli tekniği Şekil 1'de gösterilmiştir. Şekil, fare kuyruk modelinin ilgili anatomisini sergiler. Şekil 2 lenfödem indüksiyonu sonrası fare kuyruğunda ilerleyici şişlik ve sürekli dirençli lenfödem göstermektedir. Kesilen koni denklemi tarafından hesaplanan fare kuyruk hacmi, 4. haftada zirveler ve 6. haftaya platolar ve ardından 15. haftaya kadar sürdürülen kademeli iyi...

Tartışmalar

Lenfödem primer (konjenital) veya sekonder (iyatrojenik lenfatik) yaralanma olarak kategorize edilir38,39. sekonder lenfödem olguların %99'unu oluşturur39. sekonder lenfödem en sık lenfadenektomi veya radyasyon ile enfeksiyon (filariasis) veya onkolojik sonrası tedaviden kaynaklanır4,39. Lenfadektomi ve radyasyonla tedavi edilen hayvanların% 70'i lenfödem elde etmediği i...

Açıklamalar

Yazarların rakip çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Amerikan Plastik Cerrahlar Birliği Akademik Bursu ve Savunma Bakanlığı W81XWH2110135 tarafından AHH'ye sağlanan hibe finansmanı   ile desteklendi. Estetik Cerrahi Eğitim ve Araştırma Vakfı'nın MS. NIH U01DK119099, R01NS042617 ve R01DK125835'e CKS'ye hibesi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Surgical MicroscopeLeica, Wetzlar, GermanyMSV266
Adherent Dressing (Tegaderm)3M, St. Paul, Minn.1626W
Laser speckle (Pericam PSI System )Perimed AB, Stockholm, Sweden)PSIZ
Near-infrared laser (LUNA)Stryker (Formerly Novadaq Technologies, Toronto, Canada)LU3000
C57BL/6 miceJackson Laboratories000664
Micro-Adson Forceps - 1x2 TeethFine Science Tools (USA) Inc.11019-12
V-HookFine Science Tools (USA) Inc.18052-12
Scalpel SS NO15Fischer Scientific29556
Disposable Needle 30GX1Fischer Scientific305128
Operating ScissorsFischer Scientific12-460-796
Surgi-Or Jeweler's Forceps, Sklar 4-1/2 inFischer Scientific50-118-4255
Spring Scissors - Straight/Sharp-Sharp/8mm Cutting EdgeFine Science Tools (USA) Inc.15024-10
CardiogreenSigmaI2633-25MG
IsosulfanBlue (Lymphazurin)  50 mg/5mlMylan67457-220-05

Referanslar

  1. Kataru, R. P., et al. Fibrosis and secondary lymphedema: chicken or egg. Translation Research. 209, 68-76 (2019).
  2. Brayton, K. M., et al. Lymphedema prevalence and treatment benefits in cancer: impact of a therapeutic intervention on health outcomes and costs. PLoS One. 9 (12), 114597 (2014).
  3. Mendoza, N., Li, A., Gill, A., Tyring, S. Filariasis: diagnosis and treatment. Dermatology and Therapy. 22 (6), 475-490 (2009).
  4. Rockson, S. G., Rivera, K. K. Estimating the population burden of lymphedema. Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 147-154 (2008).
  5. Soran, A., et al. Breast cancer-related lymphedema--what are the significant predictors and how they affect the severity of lymphedema. Breast Journal. 12 (6), 536-543 (2006).
  6. Hayes, S. C., et al. Upper-body morbidity after breast cancer: incidence and evidence for evaluation, prevention, and management within a prospective surveillance model of care. Cancer. 118, 2237-2249 (2012).
  7. Carl, H. M., et al. Systematic Review of the Surgical Treatment of Extremity Lymphedema. Journal of Reconstructive Microsurgery. 33 (6), 412-425 (2017).
  8. Garza, R., Skoracki, R., Hock, K., Povoski, S. P. A comprehensive overview on the surgical management of secondary lymphedema of the upper and lower extremities related to prior oncologic therapies. BMC Cancer. 17 (1), 468 (2017).
  9. Hassanein, A. H., et al. Deep Inferior Epigastric Artery Vascularized Lymph Node Transfer: A Simple and Safe Option for Lymphedema. Journal of Plastic, Reconstructive, Aesthetic Surgery. 73 (10), 1897-1916 (2020).
  10. Hassanein, A. H., Sacks, J. M., Cooney, D. S. Optimizing perioperative lymphatic-venous anastomosis localization using transcutaneous vein illumination, isosulfan blue, and indocyanine green lymphangiography. Microsurgery. 37 (8), 956-957 (2017).
  11. Chang, D. W., Masia, J., Garza, R., Skoracki, R., Neligan, P. C. Lymphedema: Surgical and Medical Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 138, 209-218 (2016).
  12. Gould, D. J., Mehrara, B. J., Neligan, P., Cheng, M. H., Patel, K. M. Lymph node transplantation for the treatment of lymphedema. Journal of Surgical Oncology. 118 (5), 736-742 (2018).
  13. Cook, J. A., et al. Immediate Lymphatic Reconstruction after Axillary Lymphadenectomy: A Single-Institution Early Experience. Annals of Surgical Oncology. , (2020).
  14. Cook, J. A., Hassanein, A. H. ASO Author Reflections: Immediate Lymphatic Reconstruction: A Proactive Approach to Breast Cancer-Related Lymphedema. Annals of Surgical Oncology. , (2020).
  15. Johansson, K., Branje, E. Arm lymphoedema in a cohort of breast cancer survivors 10 years after diagnosis. Acta Oncologica. 49 (2), 166-173 (2010).
  16. Johnson, A. R., et al. Lymphedema Incidence After Axillary Lymph Node Dissection: Quantifying the Impact of Radiation and the Lymphatic Microsurgical Preventive Healing Approach. Annals of Plastic Surgery. 82, 234-241 (2019).
  17. Gartner, R., Mejdahl, M. K., Andersen, K. G., Ewertz, M., Kroman, N. Development in self-reported arm-lymphedema in Danish women treated for early-stage breast cancer in 2005 and 2006--a nationwide follow-up study. Breast. 23 (4), 445-452 (2014).
  18. Shin, W. S., Rockson, S. G. Animal models for the molecular and mechanistic study of lymphatic biology and disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 50-74 (2008).
  19. Tobbia, D., et al. Lymphedema development and lymphatic function following lymph node excision in sheep. Journal of Vascular Research. 46 (5), 426-434 (2009).
  20. Olszewski, W., Machowski, Z., Sokolowski, J., Nielubowicz, J. Experimental lymphedema in dogs. Journal of Cardiovascular Surgery. 9 (2), 178-183 (1968).
  21. Rutkowski, J. M., Moya, M., Johannes, J., Goldman, J., Swartz, M. A. Secondary lymphedema in the mouse tail: Lymphatic hyperplasia, VEGF-C upregulation, and the protective role of MMP-9. Microvascular Research. 72 (3), 161-171 (2006).
  22. Tabibiazar, R., et al. Inflammatory manifestations of experimental lymphatic insufficiency. PLoS Medicine. 3 (7), 254 (2006).
  23. Slavin, S. A., Van den Abbeele, A. D., Losken, A., Swartz, M. A., Jain, R. K. Return of lymphatic function after flap transfer for acute lymphedema. Annals of Surgery. 229 (3), 421-427 (1999).
  24. Zampell, J. C., et al. Toll-like receptor deficiency worsens inflammation and lymphedema after lymphatic injury. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 302 (4), 709-719 (2012).
  25. Gardenier, J. C., et al. Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema. JCI Insight. 1 (15), 84095 (2016).
  26. Weiler, M. J., Cribb, M. T., Nepiyushchikh, Z., Nelson, T. S., Dixon, J. B. A novel mouse tail lymphedema model for observing lymphatic pump failure during lymphedema development. Scientific Reports. 9 (1), 10405 (2019).
  27. Avraham, T., et al. Th2 differentiation is necessary for soft tissue fibrosis and lymphatic dysfunction resulting from lymphedema. FASEB J. 27 (3), 1114-1126 (2013).
  28. Zampell, J. C., et al. CD4(+) cells regulate fibrosis and lymphangiogenesis in response to lymphatic fluid stasis. PLoS One. 7 (11), 49940 (2012).
  29. Arruda, G., Ariga, S., de Lima, T. M., Souza, H. P., Andrade, M. A modified mouse-tail lymphedema model. Lymphology. 53 (1), 29-37 (2020).
  30. Jun, H., et al. Modified Mouse Models of Chronic Secondary Lymphedema: Tail and Hind Limb Models. Annals of Vascular Surgery. 43, 288-295 (2017).
  31. Karkkainen, M. J., et al. A model for gene therapy of human hereditary lymphedema. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (22), 12677-12682 (2001).
  32. Yoon, Y. S., et al. VEGF-C gene therapy augments postnatal lymphangiogenesis and ameliorates secondary lymphedema. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 717-725 (2003).
  33. Gallego-Perez, D., et al. Topical tissue nano-transfection mediates non-viral stroma reprogramming and rescue. Nature Nanotechnology. 12 (10), 974-979 (2017).
  34. Moore, J. T., et al. Nanochannel-Based Poration Drives Benign and Effective Nonviral Gene Delivery to Peripheral Nerve Tissue. Advanced Biosystems. , 2000157 (2020).
  35. Zhou, X., et al. Exosome-Mediated Crosstalk between Keratinocytes and Macrophages in Cutaneous Wound Healing. ACS Nano. 14 (10), 12732-12748 (2020).
  36. Roy, S., et al. Neurogenic tissue nanotransfection in the management of cutaneous diabetic polyneuropathy. Nanomedicine. 28, 102220 (2020).
  37. Sitzia, J. Volume measurement in lymphoedema treatment: examination of formulae. European Journal of Cancer Care. 4 (1), 11-16 (1995).
  38. Smeltzer, D. M., Stickler, G. B., Schirger, A. Primary lymphedema in children and adolescents: a follow-up study and review. Pediatrics. 76 (2), 206-218 (1985).
  39. Maclellan, R. A., Greene, A. K. Lymphedema. Seminars in Pediatric Surgery. 23 (4), 191-197 (2014).
  40. Clavin, N. W., et al. TGF-beta1 is a negative regulator of lymphatic regeneration during wound repair. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 295 (5), 2113-2127 (2008).
  41. Gnyawali, S. C., et al. Retooling Laser Speckle Contrast Analysis Algorithm to Enhance Non-Invasive High Resolution Laser Speckle Functional Imaging of Cutaneous Microcirculation. Scientific Reports. 7, 41048 (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 168lenf demmodellenfmhangiografilazer beneksiTNTdoku nanotransfeksiyon

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır