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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El linfedema es la hinchazón de las extremidades causada por una disfunción linfática. Describimos un modelo de cola murina crónica de linfedema y el uso novedoso de la tecnología de nanotransfección tisular (TNT) para la entrega de carga genética a la cola.

Resumen

El linfedema es la hinchazón de las extremidades causada por una disfunción linfática. La extremidad afectada se agranda debido a la acumulación de líquido, adiposo y fibrosis. No hay cura para esta enfermedad. Un modelo de cola de ratón que utiliza una escisión focal de piel de espesor completo cerca de la base de la cola, lo que resulta en hinchazón de la cola, se ha utilizado para estudiar el linfedema. Sin embargo, este modelo puede dar lugar a una comprendeción vascular y la consiguiente necrosis de la cola y la resolución temprana de la hinchazón de la cola, lo que limita su traducibilidad clínica. El modelo de linfedema crónico de cola murina induce linfedema sostenido durante 15 semanas y una perfusión confiable a la cola. Las mejoras del modelo tradicional de linfedema de cola murina incluyen 1) escisión precisa de espesor completo y recorte linfático utilizando un microscopio quirúrgico, 2) confirmación de perfusión arterial y venosa postoperatoria utilizando manchas láser de alta resolución, y 3) evaluación funcional utilizando linfangiografía láser de infrarrojo cercano verde de indocianina. También utilizamos la tecnología de nanotransfección tisular (TNT) para la nueva entrega focal no viral, transcutánea y de carga genética a la vasculatura de la cola del ratón.

Introducción

El linfedema es la hinchazón de las extremidades causada por una disfunción linfática. La extremidad afectada se agranda debido a la acumulación de líquido, adiposo y fibrosis1. El linfedema afecta a 250 millones de personas en todo el mundo2,3,4. Se estima que el 20-40% de las pacientes que se someten a tratamiento para neoplasias malignas sólidas, como cáncer de mama, melanoma, tumores ginecológicos/urológicos o sarcomas, desarrollan linfedema2,4,5. La morbilidad por linfedema incluye infecciones recurrentes, dolor y deformidad6. No hay cura para esta enfermedad progresiva de por vida. Las terapias actuales son varias por efectividad7 e incluyen compresión, terapia descongestiva completa por fisioterapeutas, procedimientos de escisión y operaciones microquirúrgicas, incluida la transferencia vascularizada de ganglios linfáticos y el bypass linfovenoso7,8,9, 10,11,12,13,14. El tratamiento ideal para el linfedema aún no se ha descubierto.

El estudio del mecanismo y la terapia del linfedema ha sido limitado. Hay un retraso promedio de inicio de un año después de la lesión linfática15,16 y la mayoría de los individuos que experimentan lesión iatrogénica con radiación y cirugía no desarrollan linfedema4,6,17. Aunque se han descrito modelos animales grandes, incluidos caninos, ovejas y cerdos18,19,20,el modelo de cola de ratón ha sido el más ampliamente aplicado debido a la facilidad, el costo y la reproducibilidad. Los modelos de ratón para investigar el linfedema incluyen un modelo de cola, ablación linfática mediada por toxina difteria y disección de ganglios linfáticos axilares o poplíteos21,22,23,24,25,26. La mayoría de los modelos de cola utilizan una escisión focal de la piel de espesor completo con recorte del canal linfático que se realiza cerca de la base de la cola22,lo que resulta en hinchazón de la cola y características histológicas similares al linfedema humano24,27,28,29. Sin embargo, el modelo de cola murina estándar típicamente se resuelve espontáneamente en tan solo 20 días y se acompaña de necrosis de cola periódica30. El modelo de cola de ratón con linfedema extiende un linfedema sostenido más allá de las 15 semanas, demuestra permeabilidad arterial y venosa confirmada y permite la evaluación de la disfunción linfática funcional.

Un modelo de linfedema de cola murina permite la evaluación de nuevas terapias para tratar el linfedema. Se han utilizado estrategias basadas en genes en el modelo de ratón mediado por vectores virales31,32. También utilizamos una novedosa tecnología de nanotransfección tisular (TNT) para la entrega de carga genética a la cola linfedematosa del ratón. TNT facilita la entrega directa y transcutánea de genes utilizando un chip con nanocanales en un campo eléctrico de enfoque rápido33,34,35,36. El modelo incluye el uso de TNT2.0 para permitir la entrega focal de genes potenciales terapéuticos basados en genes al sitio de lesión linfática de la cola deratón 35.

Protocolo

El protocolo sigue las directrices del comité de ética en investigación animal de la institución. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Indiana. Los animales fueron alojados bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas con comida y agua ad libitum.

1. Interrupción quirúrgica de los linfáticos de la cola de ratón

  1. Use ratones C57BL/6 de ocho semanas de edad de igual distribución de género.
  2. Coloque un ratón bajo anestesia general en una cámara de inducción con 3-4% de isoflurano en oxígeno al 100% seguido de sedación de mantenimiento al 1-3% durante el procedimiento.
  3. Administrar 0,5 mg/kg de buprenorfina de liberación sostenida (SR) por vía subcutánea para el control del dolor.
    NOTA: Medicamentos analgésicos adicionales administrados después de la operación: Carprofeno una vez cada 24 h durante al menos 48 h y Bupivacaína una vez después de que se realizó la incisión o antes de cerrar la incisión, aplicado goteando sobre los bordes de la piel (dura hasta 4 – 6 h).
  4. Coloque el ratón dorsalmente y prepare la cola con alcohol isopropílico al 70%.
  5. Mida el diámetro de la cola antes del procedimiento en incrementos de 5 mm a partir de 20 mm desde la base de la cola usando una pinza. Estas mediciones se utilizarán para calcular el volumen utilizando la ecuación del cono truncado37.
  6. Marque una escisión circunferencial de 3 mm en la cola a 20 mm de la base.
  7. Realice una meticulosa escisión de piel de 3 mm de espesor completo con una cuchilla quirúrgica estéril (tamaño 15), dejando intacta toda la vasculatura subyacente bajo aumento microscópico quirúrgico. Incise la marca circunferencial superior (20 mm desde la base de la cola) primero a través de la dermis seguido de una incisión circunferencial de espesor completo 3 mm distlal a la primera incisión.
    1. Haga una incisión vertical perpendicular de espesor completo para conectar las dos incisiones. Use una pastilla fina dentada para agarrar un borde de ataque y use microscisores para diseccionar cuidadosamente profundamente dentro del plano avascular a la dermis y superficial a la adventicia venosa.
  8. Inyecte 0,1 ml de azul isosulfán (1%) por vía subcutánea proximal a la punta de la cola.
  9. Identifique los dos canales linfáticos adyacentes a las venas laterales de la cola bajo el microscopio quirúrgico. Los linfáticos aparecerán azules debido a la inyección de isosulfán. Transecte los linfáticos usando tijeras microquirúrgicas rectas. Use las tijeras para diseccionar cuidadosamente un plano entre la vena lateral y la linfática. Luego pase la punta de una hoja de tijera entre el vaso linfático y la vena lateral y cierre las cuchillas para transectar el vaso linfático.
  10. Vístase la herida de la cola con un apósito transparente adherente estéril. Revise las incisiones postoperatorias diariamente para asegurarse de que no estén infectadas o sangrando y brinde cuidado de la herida durante 2 semanas.
  11. Alquila a los animales solos para evitar cualquier lesión adicional en la cola y para evitar que los animales se muerda entre sí, lo que conduciría a complicaciones quirúrgicas.

2. Evaluación vascular de la cola con imágenes de contraste de manchas láser

  1. Anestesiar el ratón como en el paso 1.2.
  2. Para usar imágenes de contraste de manchas láser para visualizar la vascularización de la cola, establezca el ancho en 0,8 cm, la altura en 1,8 cm, la densidad de puntos en alta, la velocidad de fotogramas en 44 imágenes / segundo, el tiempo en 30 segundos y la foto en color en 1 por 10 segundos.
  3. Evaluar la perfusión venosa y arterial para la permeabilidad. Cualitativamente, se debe visualizar la continuidad del flujo.

3. Evaluación linfática funcional con angiografía láser de infrarrojo cercano

  1. Anestesiar al animal como en el paso 1.2
  2. Reconstituir el verde de indocianina (ICG) (25 mg/10 ml) y administrar 0,1 ml por vía subcutánea en la cola distal del ratón cerca de la punta.
  3. Atenúa las luces de la habitación. Coloque la angiografía láser de infrarrojo cercano en un entorno de almacenamiento en búfer seguido de una captura en vivo.

4. Entrega focal de carga de ácido nucleico a la cola de ratón utilizando TNT

  1. Anestesiar al animal como en el paso 1.2.
  2. Exfolia la cola de ratón usando crema tópica exfoliante para la piel.
  3. Sumergir la cola de ratón en solución de colagenasa (10 mg/ml) a 37 °C durante 5 minutos.
  4. Cargue ADN en el depósito del chip TNT2.0 35.
  5. Coloque el dispositivo de chip de silicona TNT2.0 sobre el sitio focal deseado de entrega en la cola con nanoagujas en contacto con la cola.
  6. Coloque una sonda eléctrica positiva en el depósito. Conecte la sonda negativa a una aguja de 30 G e inserte la aguja por vía subcutánea en la cola hasta el sitio de entrega.
  7. Aplicar estimulación eléctrica de pulso de onda cuadrada (pulsos de 10 x 10 ms, 250 V, 10 mA).

Resultados

La técnica para el modelo de cola de ratón para el linfedema sostenido se muestra en la Figura 1. La figura exhibe la anatomía relevante del modelo de cola de ratón. La Figura 2 demuestra la hinchazón progresiva y el linfedema persistente sostenido en la cola del ratón después de la inducción del linfedema. El volumen de la cola del ratón, calculado por la ecuación del cono truncado, alcanza su punto máximo en la seman...

Discusión

El linfedema se clasifica como una lesión primaria (congénita) o secundaria (linfática iatrogénica)38,39. El linfedema secundario comprende el 99% de los casos39. El linfedema secundario es más comúnmente causado por infección (filariasis) o tratamiento post-oncológico con linfadenectomía o radiación4,39. Un modelo animal traslacional es un desafío para el linfedema secu...

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses en competencia.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por fondos de subvención proporcionados por la Beca Académica de la Asociación Americana de Cirujanos Plásticos y el Departamento de Defensa W81XWH2110135   a AHH. Subvención de la Fundación de Educación e Investigación en Cirugía Estética a MS. NIH U01DK119099, R01NS042617 y R01DK125835 a CKS.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Surgical MicroscopeLeica, Wetzlar, GermanyMSV266
Adherent Dressing (Tegaderm)3M, St. Paul, Minn.1626W
Laser speckle (Pericam PSI System )Perimed AB, Stockholm, Sweden)PSIZ
Near-infrared laser (LUNA)Stryker (Formerly Novadaq Technologies, Toronto, Canada)LU3000
C57BL/6 miceJackson Laboratories000664
Micro-Adson Forceps - 1x2 TeethFine Science Tools (USA) Inc.11019-12
V-HookFine Science Tools (USA) Inc.18052-12
Scalpel SS NO15Fischer Scientific29556
Disposable Needle 30GX1Fischer Scientific305128
Operating ScissorsFischer Scientific12-460-796
Surgi-Or Jeweler's Forceps, Sklar 4-1/2 inFischer Scientific50-118-4255
Spring Scissors - Straight/Sharp-Sharp/8mm Cutting EdgeFine Science Tools (USA) Inc.15024-10
CardiogreenSigmaI2633-25MG
IsosulfanBlue (Lymphazurin)  50 mg/5mlMylan67457-220-05

Referencias

  1. Kataru, R. P., et al. Fibrosis and secondary lymphedema: chicken or egg. Translation Research. 209, 68-76 (2019).
  2. Brayton, K. M., et al. Lymphedema prevalence and treatment benefits in cancer: impact of a therapeutic intervention on health outcomes and costs. PLoS One. 9 (12), 114597 (2014).
  3. Mendoza, N., Li, A., Gill, A., Tyring, S. Filariasis: diagnosis and treatment. Dermatology and Therapy. 22 (6), 475-490 (2009).
  4. Rockson, S. G., Rivera, K. K. Estimating the population burden of lymphedema. Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 147-154 (2008).
  5. Soran, A., et al. Breast cancer-related lymphedema--what are the significant predictors and how they affect the severity of lymphedema. Breast Journal. 12 (6), 536-543 (2006).
  6. Hayes, S. C., et al. Upper-body morbidity after breast cancer: incidence and evidence for evaluation, prevention, and management within a prospective surveillance model of care. Cancer. 118, 2237-2249 (2012).
  7. Carl, H. M., et al. Systematic Review of the Surgical Treatment of Extremity Lymphedema. Journal of Reconstructive Microsurgery. 33 (6), 412-425 (2017).
  8. Garza, R., Skoracki, R., Hock, K., Povoski, S. P. A comprehensive overview on the surgical management of secondary lymphedema of the upper and lower extremities related to prior oncologic therapies. BMC Cancer. 17 (1), 468 (2017).
  9. Hassanein, A. H., et al. Deep Inferior Epigastric Artery Vascularized Lymph Node Transfer: A Simple and Safe Option for Lymphedema. Journal of Plastic, Reconstructive, Aesthetic Surgery. 73 (10), 1897-1916 (2020).
  10. Hassanein, A. H., Sacks, J. M., Cooney, D. S. Optimizing perioperative lymphatic-venous anastomosis localization using transcutaneous vein illumination, isosulfan blue, and indocyanine green lymphangiography. Microsurgery. 37 (8), 956-957 (2017).
  11. Chang, D. W., Masia, J., Garza, R., Skoracki, R., Neligan, P. C. Lymphedema: Surgical and Medical Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 138, 209-218 (2016).
  12. Gould, D. J., Mehrara, B. J., Neligan, P., Cheng, M. H., Patel, K. M. Lymph node transplantation for the treatment of lymphedema. Journal of Surgical Oncology. 118 (5), 736-742 (2018).
  13. Cook, J. A., et al. Immediate Lymphatic Reconstruction after Axillary Lymphadenectomy: A Single-Institution Early Experience. Annals of Surgical Oncology. , (2020).
  14. Cook, J. A., Hassanein, A. H. ASO Author Reflections: Immediate Lymphatic Reconstruction: A Proactive Approach to Breast Cancer-Related Lymphedema. Annals of Surgical Oncology. , (2020).
  15. Johansson, K., Branje, E. Arm lymphoedema in a cohort of breast cancer survivors 10 years after diagnosis. Acta Oncologica. 49 (2), 166-173 (2010).
  16. Johnson, A. R., et al. Lymphedema Incidence After Axillary Lymph Node Dissection: Quantifying the Impact of Radiation and the Lymphatic Microsurgical Preventive Healing Approach. Annals of Plastic Surgery. 82, 234-241 (2019).
  17. Gartner, R., Mejdahl, M. K., Andersen, K. G., Ewertz, M., Kroman, N. Development in self-reported arm-lymphedema in Danish women treated for early-stage breast cancer in 2005 and 2006--a nationwide follow-up study. Breast. 23 (4), 445-452 (2014).
  18. Shin, W. S., Rockson, S. G. Animal models for the molecular and mechanistic study of lymphatic biology and disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 50-74 (2008).
  19. Tobbia, D., et al. Lymphedema development and lymphatic function following lymph node excision in sheep. Journal of Vascular Research. 46 (5), 426-434 (2009).
  20. Olszewski, W., Machowski, Z., Sokolowski, J., Nielubowicz, J. Experimental lymphedema in dogs. Journal of Cardiovascular Surgery. 9 (2), 178-183 (1968).
  21. Rutkowski, J. M., Moya, M., Johannes, J., Goldman, J., Swartz, M. A. Secondary lymphedema in the mouse tail: Lymphatic hyperplasia, VEGF-C upregulation, and the protective role of MMP-9. Microvascular Research. 72 (3), 161-171 (2006).
  22. Tabibiazar, R., et al. Inflammatory manifestations of experimental lymphatic insufficiency. PLoS Medicine. 3 (7), 254 (2006).
  23. Slavin, S. A., Van den Abbeele, A. D., Losken, A., Swartz, M. A., Jain, R. K. Return of lymphatic function after flap transfer for acute lymphedema. Annals of Surgery. 229 (3), 421-427 (1999).
  24. Zampell, J. C., et al. Toll-like receptor deficiency worsens inflammation and lymphedema after lymphatic injury. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 302 (4), 709-719 (2012).
  25. Gardenier, J. C., et al. Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema. JCI Insight. 1 (15), 84095 (2016).
  26. Weiler, M. J., Cribb, M. T., Nepiyushchikh, Z., Nelson, T. S., Dixon, J. B. A novel mouse tail lymphedema model for observing lymphatic pump failure during lymphedema development. Scientific Reports. 9 (1), 10405 (2019).
  27. Avraham, T., et al. Th2 differentiation is necessary for soft tissue fibrosis and lymphatic dysfunction resulting from lymphedema. FASEB J. 27 (3), 1114-1126 (2013).
  28. Zampell, J. C., et al. CD4(+) cells regulate fibrosis and lymphangiogenesis in response to lymphatic fluid stasis. PLoS One. 7 (11), 49940 (2012).
  29. Arruda, G., Ariga, S., de Lima, T. M., Souza, H. P., Andrade, M. A modified mouse-tail lymphedema model. Lymphology. 53 (1), 29-37 (2020).
  30. Jun, H., et al. Modified Mouse Models of Chronic Secondary Lymphedema: Tail and Hind Limb Models. Annals of Vascular Surgery. 43, 288-295 (2017).
  31. Karkkainen, M. J., et al. A model for gene therapy of human hereditary lymphedema. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (22), 12677-12682 (2001).
  32. Yoon, Y. S., et al. VEGF-C gene therapy augments postnatal lymphangiogenesis and ameliorates secondary lymphedema. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 717-725 (2003).
  33. Gallego-Perez, D., et al. Topical tissue nano-transfection mediates non-viral stroma reprogramming and rescue. Nature Nanotechnology. 12 (10), 974-979 (2017).
  34. Moore, J. T., et al. Nanochannel-Based Poration Drives Benign and Effective Nonviral Gene Delivery to Peripheral Nerve Tissue. Advanced Biosystems. , 2000157 (2020).
  35. Zhou, X., et al. Exosome-Mediated Crosstalk between Keratinocytes and Macrophages in Cutaneous Wound Healing. ACS Nano. 14 (10), 12732-12748 (2020).
  36. Roy, S., et al. Neurogenic tissue nanotransfection in the management of cutaneous diabetic polyneuropathy. Nanomedicine. 28, 102220 (2020).
  37. Sitzia, J. Volume measurement in lymphoedema treatment: examination of formulae. European Journal of Cancer Care. 4 (1), 11-16 (1995).
  38. Smeltzer, D. M., Stickler, G. B., Schirger, A. Primary lymphedema in children and adolescents: a follow-up study and review. Pediatrics. 76 (2), 206-218 (1985).
  39. Maclellan, R. A., Greene, A. K. Lymphedema. Seminars in Pediatric Surgery. 23 (4), 191-197 (2014).
  40. Clavin, N. W., et al. TGF-beta1 is a negative regulator of lymphatic regeneration during wound repair. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 295 (5), 2113-2127 (2008).
  41. Gnyawali, S. C., et al. Retooling Laser Speckle Contrast Analysis Algorithm to Enhance Non-Invasive High Resolution Laser Speckle Functional Imaging of Cutaneous Microcirculation. Scientific Reports. 7, 41048 (2017).

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