Um modelo de linfedema de cauda murina

Resumo

Linfedema é inchaço na extremidade causado por disfunção linfática. Descrevemos um modelo crônico de cauda murina de linfedema e o novo uso da tecnologia de nanotransfescção de tecido (TNT) para entrega genética de carga na cauda.

Resumo

Linfedema é inchaço na extremidade causado por disfunção linfática. O membro afetado aumenta devido ao acúmulo de fluido, adiposo e fibrose. Não há cura para esta doença. Um modelo de cauda de rato que usa uma excisão focal de pele de espessura total perto da base da cauda, resultando em inchaço na cauda, tem sido usado para estudar linfedema. No entanto, este modelo pode resultar em compor vascular e consequente necrose da cauda e resolução precoce do inchaço da cauda, limitando sua tradução clínica. O modelo de linfedema crônico da cauda murina induz linfedema sustentado ao longo de 15 semanas e uma perfusão confiável à cauda. Os aprimoramentos do modelo tradicional de linfedema da cauda murina incluem 1) excisão de espessura total precisa e recorte linfático usando um microscópio cirúrgico, 2) confirmação de perfusão arterial pós-operatória e venosa usando mancha laser de alta resolução, e 3) avaliação funcional usando lymphangiography laser indocyanine perto de infravermelho. Também usamos a tecnologia de nanotransfesão de tecido (TNT) para a nova entrega não viral, transcutânea e focal de carga genética para a vasculatura da cauda do rato.

Introdução

Linfedema é inchaço na extremidade causado por disfunção linfática. O membro afetado aumenta devido ao acúmulo de fluido, adiposo e fibrose¹. Linfedema afeta 250 milhões de pessoas em todo o mundo^2,3,4. Estima-se que 20-40% das pacientes que se submetem ao tratamento de malignidades sólidas, como câncer de mama, melanoma, tumores ginecológicos/urológicos, ou sarcomas, desenvolvem linfedema^2,4,5. A morbidade do linfedema inclui infecções recorrentes, dor e deformidade⁶. Não há cura para esta doença progressiva ao longo da vida. As terapias atuais são variadas por⁷ eficazes e incluem compressão, terapia descongestória completa por fisioterapeutas, procedimentos excisionais e operações microcirúrgicas, incluindo transferência vascularizada de linfonodo e bypass linfovennoso^{7,8,9,10,11,12,13,14}. O tratamento ideal para linfedema ainda não foi descoberto.

O estudo do mecanismo e terapia do linfedema tem sido limitado. Há um início médio de atraso de um ano após a lesão linfática^15,16 e a maioria dos indivíduos que experimentam insulto iatrogênico com radiação e cirurgia não desenvolvem linfedema^4,6,17. Embora grandes modelos animais, incluindo caninos, ovinos e suínos tenham sido descritos^18,19,20, o modelo de cauda de rato tem sido o mais amplamente aplicado por causa da facilidade, custo e reprodução. Os modelos de camundongos para investigar linfedema incluem um modelo de cauda, ablação linfática mediada por difteria e dissecção de linfonodo axilar ou popliteal^{21,22,23,24,25,26}. A maioria dos modelos de cauda utiliza uma excisão focal de pele de espessura total com recorte de canal linfático que é realizado perto da base da cauda²², resultando em inchaço na cauda e características histológicas semelhantes ao linfedema humano^24,27,28,29. No entanto, o modelo padrão de cauda murina normalmente se resolve em apenas 20 dias e é acompanhado por necrose periódica da cauda³⁰. O modelo de cauda do rato linfedema estende um linfedema sustentado para além de 15 semanas, demonstra patência arterial e venosa confirmada e permite avaliação de disfunção linfática funcional.

Um modelo de cauda murina de linfedema permite a avaliação de novas terapêuticas para tratar linfedema. Estratégias baseadas em genes têm sido usadas no modelo de mouse mediado pelos vetores virais^31,32. Também usamos uma nova tecnologia de nanotransfesão de tecido (TNT) para entrega de carga genética à cauda linfática do rato. A TNT facilita a entrega direta e transcutânea de genes usando um chip com nanocanais em um campo elétrico rápido^{focado 33,34,35,36}. O modelo inclui o uso do TNT_2.0 para permitir a entrega de genes focais de potenciais terapêuticas baseadas em genes para o local de lesão linfática da cauda do rato³⁵.

Protocolo

O protocolo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa animal da instituição. Todos os experimentos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Medicina da Universidade de Indiana. Os animais foram alojados sob um ciclo claro-escuro de 12 horas com comida e água ad libitum.

1. Interrupção cirúrgica de linfáticos da cauda do rato

1. Use camundongos C57BL/6 de oito semanas de idade de distribuição igualitária de gênero.
2. Coloque um rato sob anestesia geral em uma câmara de indução com isoflurane de 3-4% em 100% de oxigênio seguido de sedação de manutenção em 1-3% durante o procedimento.
3. Administre 0,5 mg/kg de liberação sustentada (RS) de buprenorfina subcutânea para o controle da dor.
   NOTA: Medicamentos analgésicos adicionais administrados após a operação: Carprofen uma vez a cada 24 h por pelo menos 48 h e Bupivacaína uma vez após a incisão foi feita ou antes de fechar a incisão, aplicada pingando nas bordas da pele (dura até 4 - 6 h).
4. Posicione o rato dorsalmente e prepare a cauda com 70% de álcool isopropílico.
5. Meça o diâmetro da cauda antes do procedimento em incrementos de 5 mm a partir da base da cauda usando uma pinça. Estas medidas serão usadas para calcular o volume usando a equação do cone truncado³⁷.
6. Marque uma excisão circunferencial de 3 mm na cauda a 20 mm da base.
7. Realize uma meticulosa excisão de pele de 3 mm de espessura total com uma lâmina cirúrgica estéril (tamanho 15), deixando toda a vasculatura subjacente intacta sob ampliação microscópica cirúrgica. Incisar a marca circunferencial superior (20 mm da base da cauda) primeiro através da dermis seguido por uma incisão de espessura total circunferencial 3 mm distlal à primeira incisão.
   1. Faça uma incisão vertical de espessura total perpendicular para conectar as duas incisões. Use uma picape fina dentada para agarrar uma borda de ponta e use microscissores para dissecar cuidadosamente profundamente dentro do plano avascular para a derme e superficial para a veia adventitia.
8. Injete 0,1 mL de isosulfan azul (1%) subcutâneamente proximal à ponta da cauda.
9. Identifique os dois canais linfáticos adjacentes às veias laterais da cauda sob o microscópio cirúrgico. Os linfáticos aparecerão azuis por causa da injeção de isosulfan. Transecte os linfáticos usando tesoura microcirúrgica reta. Use a tesoura para dissecar cuidadosamente um plano entre a veia lateral e o linfático. Em seguida, passe a ponta de uma lâmina de tesoura entre o vaso linfático e a veia lateral e feche as lâminas para transectar o vaso linfático.
10. Vista a ferida da cauda com um curativo transparente estéril. Verifique as incisões pós-operatórias diariamente para garantir que elas não estejam infectadas ou sangrando e forneça cuidados com feridas por 2 semanas.
11. Abrigar os animais de forma singly para evitar qualquer lesão adicional na cauda e para evitar que os animais mordam uns aos outros, o que levaria a complicações cirúrgicas.

2. Avaliação vascular da cauda com imagem de contraste de manchas de laser

1. Anestesiar o mouse como na etapa 1.2.
2. Para usar imagens de contraste de manchas laser para visualizar a vascularidade da cauda, ajuste a largura para 0,8 cm, altura a 1,8 cm, densidade de ponto para alta, taxa de quadros para 44 imagens/segundo, tempo para 30 segundos e foto colorida para 1 por 10 segundos.
3. Avalie a perfusão venosa e arterial para patência. Qualitativamente, a continuidade do fluxo deve ser visualizada.

3. Avaliação linfática funcional com angiografia a laser infravermelha próxima

1. Anestesiar o animal como na etapa 1.2
2. Reconstitua o verde indocitanina (ICG) (25 mg/10 mL) e administre 0,1 mL subcutâneamente na cauda do rato distal perto da ponta.
3. Apague as luzes do quarto. Coloque angiografia a laser quase infravermelha na configuração de buffering seguida de captura ao vivo.

4. Entrega focal de carga de ácido nucleico para cauda de rato usando TNT

1. Anestesiar o animal como no passo 1.2.
2. Esfoliar a cauda do rato usando creme de esfoliação de pele tópico.
3. Mergulhe a cauda do mouse na solução de colagenase (10 mg/mL) a 37 °C por 5 minutos.
4. Carregue DNA no reservatório de chip TNT_2.0 ³⁵.
5. Coloque o dispositivo de chip de silicone TNT_2.0 sobre o local focal desejado de entrega na cauda com nanonegubras em contato com a cauda.
6. Coloque uma sonda elétrica positiva no reservatório. Conecte a sonda negativa a uma agulha de 30 G e insira a agulha subcutânea na cauda ao local de entrega.
7. Aplique estimulação elétrica de pulso de onda quadrada (pulsos de 10 x 10 ms, 250 V, 10 mA).

Resultados

A técnica para o modelo de cauda do rato para linfedema sustentado é mostrada na Figura 1. A figura exibe a anatomia relevante do modelo de cauda do rato. A Figura 2 demonstra o inchaço progressivo e o linfedema persistente sustentado na cauda do rato após a indução de linfedema. O volume da cauda do rato, calculado pela equação do cone truncado, atinge picos na semana 4 e planaltos para a semana 6 seguido de melhora grad...

Discussão

Linfedema é categorizado como lesão primária (congênita) ou secundária (linfática iatrogênica)^38,39. O linfedema secundário compreende 99% dos casos³⁹. Linfedema secundário é mais comumente causado por infecção (filariase) ou tratamento pós-oncológico com linfodenectomia ou radiação^4,39. Um modelo animal translacional é desafiador para o linfedema secundário, pois...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tegaderm Film		1626W
Surgical Microscope	Leica, Wetzlar, Germany	MSV266
Adherent Dressing (Tegaderm)	3M, St. Paul, Minn.	1626W
Laser speckle (Pericam PSI System )	Perimed AB, Stockholm, Sweden)	PSIZ
Near-infrared laser (LUNA)	Stryker (Formerly Novadaq Technologies, Toronto, Canada)	LU3000
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories	000664
Micro-Adson Forceps - 1x2 Teeth	Fine Science Tools (USA) Inc.	11019-12
V-Hook	Fine Science Tools (USA) Inc.	18052-12
Scalpel SS NO15	Fischer Scientific	29556
Disposable Needle 30GX1	Fischer Scientific	305128
Operating Scissors	Fischer Scientific	12-460-796
Surgi-Or Jeweler's Forceps, Sklar 4-1/2 in	Fischer Scientific	50-118-4255
Spring Scissors - Straight/Sharp-Sharp/8mm Cutting Edge	Fine Science Tools (USA) Inc.	15024-10
Cardiogreen	Sigma	I2633-25MG
IsosulfanBlue (Lymphazurin)  50 mg/5ml	Mylan	67457-220-05