以斑马鱼为模型系统的三室选择行为任务

摘要

我们提出了一个行为室，旨在评估认知性能。我们提供的数据表明，一旦获得，斑马鱼记得任务8周后。我们还表明，高血糖斑马鱼改变了认知能力，表明这种模式适用于评估认知和记忆的研究。

摘要

神经退行性疾病是年龄依赖，衰弱和不治之症。最近的报告还把高血糖与记忆和/或认知障碍的变化联系起来。我们修改并开发了一个三室选择认知任务，类似于与啮齿动物一起用于高血糖斑马鱼的任务。测试室由位于中央的起始室和两侧的两个选择舱组成，并配有一个浅滩，用作奖励。我们提供的数据表明，一旦获得，斑马鱼记得任务至少8周后。我们的数据表明，斑马鱼对这一奖励反应强烈，经过4周的治疗，我们已经发现了高血糖鱼的认知缺陷。此行为分析可能也适用于与认知和记忆相关的其他研究。

引言

神经退行性疾病是年龄依赖，衰弱和不治之症。这些疾病的流行率正在上升，因此迫切需要改进和制定新的治疗战略。每种疾病的发病和表现是独一无二的，因为有些会影响语言、运动和自主大脑区域，而另一些疾病则会导致学习缺陷和记忆丧失^。最值得注意的是，认知缺陷和/或损伤是所有神经退行性疾病中最普遍的并发症^2。为了揭示这些神经退行性疾病所涉及的基本机制，采用了许多不同的模型系统（包括单细胞生物对 嗜好 动物，如啮齿动物和人类等高阶脊椎动物）的使用:然而，大多数神经退行性疾病仍然不治之症。

学习和记忆是生物体之间高度保守的过程，因为环境的不断变化需要适应^3。认知和突触可塑性的损伤已经在几个啮齿动物模型中得到了证明。具体来说，成熟的行为分析使用关联学习来评估各种损伤引起的疾病和紊乱后的认知变化^。此外，对比歧视逆转评估认知缺陷，因为它涉及到更高的顺序学习和记忆功能，而反转取决于对以前学会的关联的抑制。广泛使用的三室选择任务阐明了中枢神经系统^5，6的学习和记忆通路可能的缺陷。最近，这个领域已经扩大到包括非哺乳动物模型，如斑马鱼（Danio rerio），因为几个范式已经开发了从幼虫到成人^7，8的年龄范围。

斑马鱼提供了复杂性和简单性的平衡，有利于用行为技术评估认知障碍。首先，斑马鱼由于体积小、繁殖性大，可接受高通量的行为筛查。其次，斑马鱼有一个结构，横向苍白，这是类似于哺乳动物海马，因为它有类似的神经元标记和细胞类型^7。斑马鱼也能够获取和记住空间信息^9，并且，像人类一样，是日间^10。因此，斑马鱼被用作神经退行性疾病的模型，频率越来越高，这并不奇怪。然而，由于缺乏适当的行为检测，因此很难将斑马鱼模型应用于认知评估。使用斑马鱼特有的行为分析出版的工作包括关联学习任务^11，焦虑行为^12，记忆^13，对象识别^14，和条件地点偏好15，16，17，18，19。虽然斑马鱼的行为检测已经取得了许多进展，但啮齿动物认知功能的一些测试的对应物尚未开发用于斑马鱼^18。

基于我们实验室先前的研究，我们根据使用社交互动作为奖励与啮齿动物使用的三室选择任务，对斑马鱼的认知任务进行了建模/开发。此外，我们扩展了行为任务的关联学习方面，并纳入了对比度歧视逆转，希望进一步发展这一行为任务，以评估认知障碍。这使我们能够审查歧视学习的最初获得以及随后在逆转阶段对这种学习的抑制。在目前的研究中，我们证明这个程序提供了一个可靠的方法来评估斑马鱼在葡萄糖浸泡后4或8周的认知功能。

研究方案

所有实验程序均由美国大学机构动物护理和使用委员会 （协议 # 1606， 19-02） 批准。

1. 动物

1. 动物饲养和维护
   1. 获得成年野生斑马鱼（Danio rerio）4至11个月作为胚胎，并在内部饲养。
   2. 在 14 小时光:10-h 深色光圈下，将鱼保持在 28°29 °C 的水生架系统中。
   3. 每天用商业薄片喂鱼两次，并补充活 的阿提米亚。
   4. 从这些鱼缸中随机选择鱼进行行为实验。
2. 实验完成后，通过浸泡在0.02%的三卡因中2分钟或直到缺乏运动协调和降低呼吸率，为以后的分子和/或神经化学分析麻醉动物。

2. 三室选择测试室

注:这种行为技术是从鲁尔等人^20年修改的。

1. 房间建设
   1. 修改行为室²⁶L 水族馆 （50 x 30 x 30 厘米³） 有一个中央或启动室 （10 x 30 x 30 厘米^3），从两侧选择室 （每个 20 x 30 x 30 厘米^3，图 1A）.
   2. 使用铝制"U形"通道建造三个隔间，该通道贴在内部玻璃壁上，带有水族馆密封剂，将储罐分成三个腔室。
   3. 构造不透明的分隔器，高 10 厘米，由灰色 PVC 板材构建，可安装到两侧的铝通道中。将每个分隔器从 2 块中分离出来，每个分隔器的大小相等:永久安装在油箱内的固定底部部分和在铝轨中上下移动的可移动顶部件。
   4. 将超大活页夹粘附在灰色 PVC 板的顶部，以充当手柄。
   5. 使用永久标记，在油箱外部粘附的灰色 PVC 管上方 10 厘米处绘制小水平线。
      注:此标记是打开顶部灰色 PVC 表以允许访问任何一方的点。
   6. 在测试前将控制（系统）水添加到水箱中，从底部到顶部达到 25 厘米的水平，或将 30 L. Place 玻璃水族馆加热器放入腔室的每个部分 24 小时，使温度达到 28.5 °C。
      注:在行为会话开始时取下加热器，并在使用两天后进行完整的水交换。
2. 歧视设置
   1. 对于每个歧视任务，使用 Velcro（图 1B/D）将彩色毛毡片（米色、黑色或白色）分别放置在选择室的外背、侧面和底部。
      注:中央腔室不应具有与之相关的背景颜色。
3. 作为奖励，通过将4只成年斑马鱼（否则不会用于研究）放置在每个选择室后角的一个小而清晰的水箱中（图1B/D），创建一组特异性（浅滩）。
   注:每天从鱼缸中随机选择浅滩鱼，每个浅滩鱼箱中至少有一男一女的年龄和体型与实验鱼相同。

3. 行为任务

1. 服水土
   注:适应行为室包括三天的培训:两天的小组适应，然后一天的个别训练。
2. 组适应
   1. 将米色（中性）感觉背景连接到两个选择舱的外部，并在每个选择舱中浸入一个活浅滩油箱（图1B）。
   2. 将五六只斑马鱼添加到中心起跑室，打开两个推拉门，让鱼自由漫游30分钟。
      注:实验斑马鱼在适应过程中穿过任一选择舱后，应该能够通过鱼缸与这些浅滩鱼进行互动和社交，作为奖励。当鱼的整个身体进入房间时，它被认为是进入一个侧室的。
   3. 第二天（组适应2天）用同一实验鱼重复此程序。
      注意:不要保留相同的鱼群。
3. 个人适应
   1. 室设置:将米色（中性）感觉背景连接到两个选择舱的外部，并在两个选择舱中浸入一个活浅滩罐，如组适应（图1B，E）。
      1. 将单个斑马鱼放在中央起跑室 2 分钟，并关闭滑动门，2 分钟后，同时打开两个门。
      2. 确保每条鱼从中央房间从一扇门游过总共10次，无论哪一边。奖励鱼每次进入一个侧室（1天的个别适应）。
         注:如果鱼在30分钟内无法完成此任务10次或拒绝离开起始室，请将其排除在研究之外。
   2. 数据采集:记录鱼游进两边的次数和完成任务所需的总时间。
4. 收购
   注:适应后，斑马鱼开始了为期3天的采集任务。
   1. 房间设置:将白色毛毡片连接到一个选择舱的外部，将黑色毡片连接到另一个选择舱的外部（图1C，F）。
      注:每天使用伪多域时间表³⁷替代每一侧的背景颜色。
      1. 在培训的这一阶段，只将浅滩奖励放置在一个选择舱内:这成为奖励的一面。
      2. 要开始采集，请将一条实验鱼放在起始室中 2 分钟，选择舱关闭。
      3. 2 分钟适应后，同时打开两扇门，允许进入两个选择隔间，并启动秒表以评估选择延迟。
      4. 使用偏颇的设计，随机分配鱼的黑色或白色偏好（即W+/B-或B+/W-），这意味着浅滩被放置在黑色（B+）或白色（W+）选择舱。
   2. 表示选择响应
      1. 一旦鱼进入一个侧舱做出选择，停止定时器。
      2. 如果鱼正确选择首选侧，立即关闭中央室和侧之间的门，将鱼限制在首选侧 1 分钟，并允许它通过与浅滩水箱互动（图 1C，F）获得奖励。将此试验评分为"正确"（奖励）的"C"。
      3. 如果鱼游过不正确的门，将其移回中央室，关闭两扇门，并将试验评分为"I"为"不正确"（无奖励）。
      4. 如果鱼在开门后 2 分钟内没有做出决定，则将鱼移到正确的一侧 1 分钟，并将试验评分为"标记"（强制奖励）。
      5. 将鱼移回起始室时，使用鱼网作为牧羊工具，轻轻引导鱼进入中央室。
         注意:不要将鱼从水中挖出来，将其替换到起始室，因为这可能会影响行为分析。
      6. 鱼一旦回到中央室，等待1分钟，然后再执行任务。确保每条鱼执行任务 8 次。
   3. 数据采集
      1. 对于每个实验鱼，按顺序记录 8 个采集试验（第 3.4.2 节）中每个试验的第一决定（或选择延迟）和单个分数（C、I 或 M）的时间。
      2. 报告这些实验的结果，作为每个采集日每个试验的组平均值报告。
      3. 一旦鱼完成了试验，将其归类为"高性能"鱼或"低性能"鱼。
         注:如果一条鱼在当天的8次试验中至少选择了鱼缸的正确一侧，它就被认为是"高性能"的。任何不符合此标准的鱼都是"表现不佳"。
      4. 一旦确定，分别容纳高性能和低性能的鱼。
      5. 在鱼完成试验后，在三天的采集中，将鱼分类为"高"或"低"表演者。
         注:在收购的第三天结束时，鱼在研究期间仍保持"高"或"低"的表现。
         注:一些最初在"表现不佳"组的鱼在收购第2天或第3天学习任务。当这种情况发生时，初始的"低性能"鱼可能会移动到"高性能"组。在第 3 天（收购结束）后，不要以这种方式在群落之间移动鱼。

4. 实验治疗

1. 采集期结束后，当鱼表现出解决黑白背景之间简单辨别任务的能力时，开始对实验斑马鱼进行治疗。
   注:为了显示这种方法的适用性，本研究展示了两种实验设计:
   1. 纵向研究
      1. 将实验鱼放回它们的储水箱8周。将鱼保持在标准水箱中，每天更换水，每天喂鱼两次。
         注意:在这8周内，不要在储罐中进行任何行为训练。
      2. 在此期间后进行反向评估，以评估斑马鱼是否可以在 8 周后无需培训即可完成反转任务。
   2. 高血糖:将实验组暴露在水中（处理应激控制）、曼尼托（1%+3%、渗透控制）或葡萄糖（1%+3%），持续4或8周^22、23周。
      注意:在这 4 或 8 周内不要进行任何行为训练。

5. 反转

注:在实验操作后（如第4.2节），鱼在3室选择范式逆转的最后一部分进行测试。为此，奖励方被逆转（与收购相比），这样以前在白色一侧有浅滩奖励的鱼现在得到黑色一侧的浅滩奖励，反之亦然。通过这种方式，反向评估鱼是否了解奖励（浅滩）的位置，无论背景的颜色如何。

1. 会议厅设置
   1. 将黑色毛毡连接到其中一个选择室的外部，将白色毛毡连接到另一个选择室的外部，确保黑白侧与收购试验（第 3.4 节）相同。
   2. 将浅滩坦克淹没在侧的后角，与先前奖励的选择室相反（图1D，G）。
      注:换句话说，以前在白方奖励的鱼现在在黑方得到奖励，反之亦然。
   3. 像第3.5节一样单独测试鱼。首先，在起始室放置一条实验鱼2分钟，并关闭选择舱的通道。
   4. 同时打开会议厅的两侧。
      注:连续三天每天完成8次试验。
2. 表示选择响应
   1. 如果鱼正确选择首选颜色，请立即关闭中央室的门 1 分钟，让鱼与浅滩奖励互动。将此试验评分为"正确"（奖励）的"C"。
   2. 如果鱼游过不正确的门，将其移回中央室，关闭两扇门，并将此试验评分为"I"为"不正确"（无奖励）。
   3. 如果鱼在开门后 2 分钟内没有做出决定，则将鱼移到正确的一侧，并将试验评分为"标记"（强制奖励）的"M"。
3. 数据采集
   1. 对于每个实验斑马鱼，记录选择延迟和每个试验的单独分数（C，I，M）。
   2. 将这些实验的结果报告为 3 个反转天中每个两个试验块的组平均值。
   3. 将高绩效和低性能鱼的数据分开，以确定它们在反转过程中是否显示与收购期间相同的性能水平。

结果

适应行为室需要三天的训练:2天的集体适应，然后是1天的个体适应。然而，由于我们无法区分单个斑马鱼，我们只能在个体适应过程中收集数据。此时，实验动物（n = 30）使用浅滩奖励，平均需要125.11秒才能做出第一个决定（图2A），平均为725.34秒（12分钟）完成整个个体适应任务（图2B）。在适应过程中没有明显的侧偏好（图2C）。

讨论

虽然在过去15^年中，使用斑马鱼进行的神经科学研究的数量和种类都出现了巨大的增长，但与哺乳动物模型系统^11、25、26相比^，该物种缺乏行为检测。在这里，我们展示了一个三室选择任务，开发用于啮齿动物可以调整，以评估在斑马鱼视觉歧视学习的获取和逆转。这项任务以活浅滩作为奖励，提供了一个强?...

材料

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