A Tarefa Comportamental de Escolha de Três Câmaras usando zebrafish como um sistema modelo

Resumo

Apresentamos uma câmara comportamental projetada para avaliar o desempenho cognitivo. Fornecemos dados mostrando que uma vez adquiridos, zebrafish se lembram da tarefa 8 semanas depois. Também mostramos que os zebrafish hiperglicêmicos alteraram o desempenho cognitivo, indicando que esse paradigma é aplicável a estudos que avaliam a cognição e a memória.

Resumo

As doenças neurodegenerativas são dependentes da idade, debilitantes e incuráveis. Relatórios recentes também correlacionaram a hiperglicemia com alterações na memória e/ou comprometimento cognitivo. Modificamos e desenvolvemos uma tarefa cognitiva de três câmaras semelhante à usada com roedores para uso com zebrafish hiperglicímico. A câmara de teste consiste em uma câmara de partida localizada centralmente e dois compartimentos de escolha de cada lado, com um cardume de conespecíficos usado como recompensa. Fornecemos dados mostrando que uma vez adquiridos, os zebrafish se lembram da tarefa pelo menos 8 semanas depois. Nossos dados indicam que os zebrafish respondem robustamente a esta recompensa, e identificamos déficits cognitivos em peixes hiperglicômicos após 4 semanas de tratamento. Este ensaio comportamental também pode ser aplicável a outros estudos relacionados à cognição e memória.

Introdução

As doenças neurodegenerativas são dependentes da idade, debilitantes e incuráveis. Essas doenças estão aumentando na prevalência, resultando em uma necessidade urgente de melhorar e desenvolver novas estratégias terapêuticas. O início e apresentação de cada doença é único, pois alguns afetam as regiões do cérebro, motor e autônomo, enquanto outras causam déficits de aprendizagem e perda de memória¹. Mais notavelmente, déficits cognitivos e/ou prejuízos são as complicações mais prevalentes em todas as doenças neurodegenerativas². Na esperança de lançar luz sobre os mecanismos subjacentes envolvidos nessas doenças neurodegenerativas, o uso de muitos sistemas de modelos diferentes (incluindo organismos unicelulares para Drosophila para vertebrados de maior ordem, como roedores e humanos) foram empregados; no entanto, a maioria das doenças neurodegenerativas permanece incurável.

A aprendizagem e a memória são processos altamente conservados entre os organismos, pois mudanças constantes no ambiente requerem adaptação³. O comprometimento tanto na cognição quanto na plasticidade sináptica tem sido demonstrado em vários modelos de roedores. Especificamente, ensaios comportamentais bem estabelecidos utilizam aprendizado associativo para avaliar alterações cognitivas após várias doenças e distúrbios induzidos por comprometimento⁴. Além disso, a reversão da discriminação por contraste avalia déficits cognitivos porque envolve funções de aprendizagem e memória de maior ordem, e a reversão depende da inibição de uma associação previamente aprendida. A tarefa de escolha de três câmaras amplamente utilizada elucida possíveis déficits nas vias de aprendizagem e memória do sistema nervoso central^5,6. Recentemente, este campo expandiu-se para incluir modelos não-mamíferos, como o zebrafish (Danio rerio), já que vários paradigmas foram desenvolvidos para uma faixa etária, desde larvas até adultos^7,8.

O zebrafish proporciona um equilíbrio de complexidade e simplicidade que é vantajoso para a avaliação de prejuízos cognitivos com técnicas comportamentais. Primeiro, os zebrafish são favoráveis à triagem comportamental de alto rendimento, dado seu pequeno tamanho e natureza reprodutiva prolífica. Em segundo lugar, os zebrafish possuem uma estrutura, o pálio lateral, que é análogo ao hipocampo mamífero, pois possui marcadores neuronais semelhantes e tipos^{celulares 7}. Os zebrafish também são capazes de adquirir e lembrar informações espaciais⁹ e, como os humanos, são diurnos¹⁰. Portanto, não é de surpreender que os zebrafish estejam sendo usados como modelo para doenças neurodegenerativas com frequência crescente. No entanto, a ausência de ensaios comportamentais adequados tem dificultado a aplicação do modelo de zebrafish para avaliações cognitivas. Os trabalhos publicados utilizando ensaios comportamentais específicos de zebrafish incluem tarefas de aprendizagem associativa^11,comportamento de ansiedade^12,memória^13,reconhecimento de^{objetos 14}e preferência de local condicionado^{15,16,17,18,19}. Embora tenha havido muitos desenvolvimentos em relação aos ensaios comportamentais dos zebrafish, as contrapartidas para alguns testes de funções cognitivas em roedores ainda não foram desenvolvidas para uso com zebrafish¹⁸.

Com base em estudos anteriores do nosso laboratório, modelamos/desenvolvemos uma tarefa cognitiva em zebrafish baseada na tarefa de escolha de três câmaras usada com roedores usando a interação social como recompensa. Além disso, expandimos o aspecto de aprendizagem associativa da tarefa comportamental e incorporamos a reversão da discriminação de contraste na esperança de desenvolver ainda mais essa tarefa comportamental para avaliar o comprometimento cognitivo. Isso nos permitiu examinar tanto a aquisição inicial da aprendizagem por discriminação quanto a subsequente inibição desse aprendizado na fase de reversão. No presente estudo, demonstramos que este procedimento forneceu um método confiável para avaliar o funcionamento cognitivo em zebrafish após a imersão da glicose por 4 ou 8 semanas.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Americana (protocolo nº 1606, 19-02).

1. Animais

1. Criação e manutenção de animais
   1. Obter zebrafish adultos do tipo selvagem (Danio rerio) com idades entre 4 e 11 meses como embriões e criá-los internamente.
   2. Mantenha o peixe em um sistema de rack aquático a 28-29 °C em um fotoperíodo escuro de 14 horas:10 h.
   3. Alimente o peixe duas vezes por dia com flocos comerciais e suplemento com Artemiaviva .
   4. Escolha peixes aleatoriamente destes tanques de estoque para experimentos comportamentais.
2. Após a conclusão do experimento, anestesia os animais por imersão em 0,02% de tricaine por 2 min ou até que haja falta de coordenação motora e taxa de respiração reduzida para análises moleculares e/ou neuroquímicas posteriores.

2. Câmara de teste de escolha de três câmaras

NOTA: Esta técnica comportamental foi modificada a partir de Ruhl et al.²⁰.

1. Construção de câmara
   1. Modifique a câmara comportamental²⁶— um aquário de 40 L (50 x 30 x 30 cm³)— para ter uma câmara central ou inicial (10 x 30 x 30 cm³), separada de duas câmaras de escolha lateral (cada uma 20 x 30 x 30 cm³, Figura 1A).
   2. Construa os três compartimentos usando um canal de alumínio "em forma de U" afixado nas paredes de vidro interior com selante de aquário, para separar o tanque em três câmaras.
   3. Construa divisores opacos, 10 cm de altura, de folha de PVC cinza encaixe nos canais de alumínio de ambos os lados. Faça cada divisor de 2 peças, cada uma igual em tamanho: uma peça inferior estacionária permanentemente montada dentro do tanque e uma peça superior móvel que se move para cima e para baixo nas faixas de alumínio.
   4. Cole clipes de aglutinante extra-grandes na parte superior das folhas de PVC cinza para agir como alças.
   5. Usando um marcador permanente, desenhe pequenas linhas horizontais 10 cm acima do tubo de PVC cinza aderido na parte externa do tanque.
      NOTA: Esta marca é o ponto para o qual a folha de PVC cinza superior será aberta para permitir o acesso a ambos os lados.
   6. Adicione o controle (sistema) água ao tanque a um nível de 25 cm de baixo para cima do tanque, ou ~ 30 L. Coloque aquecedores de aquário de vidro em cada seção da câmara por 24 horas antes do teste para levar a temperatura a 28,5 °C.
      NOTA: Remova os aquecedores no início da sessão de comportamento e realize uma troca completa de água após dois dias de uso.
2. Configuração de discriminação
   1. Para cada tarefa de discriminação, coloque individualmente peças de feltro coloridas (bege, preto ou branco) nas costas, laterais e inferiores das câmaras de escolha usando Velcro(Figura 1B-D).
      NOTA: A câmara central não deve ter cor de fundo associada a ela.
3. Como recompensa, crie um grupo de conespecíficos (cardumes) colocando 4 zebrafish adultos, que não serão usados de outra forma no estudo, em um pequeno tanque claro no canto traseiro de cada câmara de escolha(Figura 1B-D).
   NOTA: Escolha peixes cardume aleatoriamente de tanques de estoque todos os dias, com pelo menos um macho e uma fêmea da mesma idade e tamanho que os peixes experimentais em cada tanque de cardum.

3. Tarefas comportamentais

1. Aclimatação
   NOTA: A aclimatação à câmara de comportamento consiste em três dias de treinamento; dois dias de aclimatação em grupo seguido de um dia de treinamento individual.
2. Aclimatação em grupo
   1. Anexar o fundo bege (neutro) ao exterior de ambos os compartimentos de escolha, e submergir um tanque de cardilho vivo em cada um dos compartimentos de escolha(Figura 1B).
   2. Adicione cinco-seis zebrafish à câmara de partida central com ambas as portas deslizantes abertas, e deixe o peixe vagar livremente por 30 minutos.
      NOTA: O zebrafish experimental deve ser capaz de interagir e socializar com esses peixes de cardume através do tanque como recompensa depois de cruzar em ambos os compartimentos de escolha durante a aclimatação. Acredita-se que um peixe tenha entrado em uma das câmaras laterais quando seu corpo inteiro entra na câmara.
   3. Repita este procedimento com o mesmo peixe experimental por um segundo dia (2 dias de aclimatação em grupo).
      NOTA: Não mantenha os mesmos grupos de peixes.
3. Aclimatação individual
   1. Configuração da câmara: Anexar o fundo bege (neutro) à parte externa de ambos os compartimentos de escolha, e submergir um tanque de cardião vivo em ambos os compartimentos de escolha, como na aclimatação em grupo(Figura 1B,E).
      1. Coloque um zebrafish individual na câmara de partida central por 2 minutos com as portas deslizantes fechadas, e após o período de 2 minutos, abra ambas as portas simultaneamente.
      2. Certifique-se de que cada peixe nada da câmara central através de uma porta por um total de 10 vezes, independentemente de qual lado. Recompense o peixe cada vez que ele entra em uma das câmaras laterais (1 dia de aclimatação individual).
         NOTA: Se um peixe não conseguir completar essa tarefa 10 vezes dentro de um período de 30 minutos ou se recusar a deixar a câmara inicial, exclua-a do estudo.
   2. Aquisição de dados: Registo o número de vezes que o peixe nada para ambos os lados e o tempo total necessário para concluir a tarefa.
4. Aquisição
   NOTA: Após a aclimatação, o zebrafish iniciou uma tarefa de aquisição de 3 dias.
   1. Configuração da câmara: Anexar uma peça de feltro branco ao lado de fora de um compartimento de escolha e uma peça de feltro preto para fora do compartimento de outra escolha(Figura 1C,F).
      NOTA: Alterne a cor de fundo de cada lado diariamente usando um cronograma de pseudorandom³⁷.
      1. Durante a duração desta fase de treinamento, coloque um cardume-recompensa apenas colocado em um dos compartimentos de escolha; este se torna o lado recompensado.
      2. Para começar a aquisição, coloque um único peixe experimental na câmara inicial por um período de 2 minutos com os compartimentos de escolha fechados.
      3. Após a aclimatação de 2 minutos, abra simultaneamente ambas as portas, dando acesso aos dois compartimentos de escolha, e inicie o cronômetro para avaliar a latência da escolha.
      4. Usando um design tendencioso, atribua aleatoriamente ao peixe uma preferência em preto ou branco (ou seja, W+/B- ou B+/W-), o que significa que o cardume é colocado no compartimento de escolha preto (B+) ou branco (W+).
   2. Denotando a resposta de escolha
      1. Uma vez que o peixe faça uma escolha entrando em um dos compartimentos laterais, pare o temporizador.
      2. Se o peixe escolher corretamente o lado preferido, feche imediatamente a porta entre a câmara central e aquele lado para restringir o peixe ao lado preferido por 1 min, e permitir que ele seja recompensado interagindo com o tanque de cardum(Figura 1C,F). Marque este teste como "C" para "Correto" (recompensado).
      3. Se o peixe nadar pela porta incorreta, transfira-o de volta para a câmara central, feche as duas portas e marque o teste como "eu" para "incorreto" (não recompensado).
      4. Se o peixe não tomar uma decisão dentro de 2 minutos após as portas serem abertas, mova o peixe para o lado correto por 1 min, e marque o teste como "M" para "marcado" (recompensado à força).
      5. Ao transferir/mover peixes de volta para a câmara de partida, guie suavemente o peixe para a câmara central usando uma rede de peixe como ferramenta de pastoreio.
         NOTA: Não retire o peixe da água e substitua-o na câmara inicial, pois isso pode afetar o ensaio comportamental.
      6. Assim que o peixe voltar para a câmara central, espere 1 min antes de realizar a tarefa novamente. Certifique-se de que cada peixe executa a tarefa 8 vezes.
   3. Aquisição de dados
      1. Para cada peixe experimental, regisque o tempo para primeira decisão (ou latência de escolha) e as pontuações individuais (C, I ou M) para cada um dos 8 ensaios de aquisição (seção 3.4.2) em ordem.
      2. Os resultados desses experimentos foram relatados como médias de grupo para cada ensaio em cada dia de aquisição.
      3. Uma vez que um peixe tenha concluído um teste, categorize-o como um peixe de "alto desempenho" ou um peixe de "baixo desempenho".
         NOTA: Um peixe foi considerado de "alto desempenho" se tivesse sucesso na escolha do lado correto do tanque em pelo menos 6 dos 8 ensaios totais do dia. Qualquer peixe que não atenda a esse critério é um "baixo desempenho".
      4. Uma vez identificados, abrigam peixes de alto desempenho e de baixo desempenho separadamente.
      5. Categorize o peixe como "alto" ou "baixo" em cada um dos três dias de aquisição, após um peixe ter concluído os ensaios.
         NOTA: Ao final do terceiro dia de aquisição, os peixes permanecem como artistas "altos" ou "baixos" durante a duração do estudo.
         NOTA: Alguns peixes que estavam inicialmente no grupo de "baixo desempenho" aprendem a tarefa no dia 2 ou 3 de aquisição. Quando isso acontece, o peixe inicial de "baixo desempenho" pode ser movido para o grupo de "alto desempenho". Não mova o peixe entre os grupos desta forma após o dia 3 (o fim da aquisição).

4. Tratamento experimental

1. Após o período de aquisição, quando os peixes demonstram a capacidade de resolver uma simples tarefa de discriminação entre o fundo preto e branco, iniciam o regime de tratamento para o zebrafish experimental.
   NOTA: Para mostrar a aplicabilidade deste método, este estudo mostra dois projetos experimentais:
   1. Estudo longitudinal
      1. Devolva os peixes experimentais aos tanques de espera por 8 semanas. Mantenha os peixes em tanques padrão com mudanças diárias de água, e alimente-os duas vezes ao dia.
         NOTA: Não realize nenhum treinamento comportamental durante estas 8 semanas nos tanques de retenção.
      2. Realize a avaliação de reversão após esse período para avaliar se o zebrafish pode resolver a tarefa de reversão após 8 semanas sem treinamento.
   2. Hiperglicemia: Exponha os grupos experimentais à água (controle de estresse), manitol (1%-3%, controle osmótico) ou glicose (1%-3%) para 4 ou 8 semanas^22,23.
      NOTA: Não realize nenhum treinamento comportamental durante estas 4 ou 8 semanas.

5. Reversão

NOTA: Após a manipulação experimental (como na seção 4.2), os peixes são testados na parte final do paradigma de escolha de 3 câmaras — reversão. Para isso, o lado recompensado é invertido (comparado à aquisição) de tal forma que os peixes anteriormente recompensados com um cardume no lado branco são agora recompensados com um cardume no lado preto e vice-versa. Dessa forma, a reversão avalia se os peixes aprenderam onde está a recompensa (cardume) está localizada, independentemente da cor do fundo.

1. Configuração da câmara
   1. Anexar o feltro preto ao lado de uma das câmaras de escolha e o branco sentido para o lado de fora do outro, certificando-se de que os lados preto e branco são os mesmos lados dos ensaios de aquisição (seção 3.4).
   2. Submergir o tanque de cardião no canto traseiro do lado que é o oposto da câmara de escolha previamente recompensada(Figura 1D,G).
      NOTA: Em outras palavras, os peixes anteriormente recompensados no lado branco são agora recompensados no lado preto e vice-versa.
   3. Teste o peixe individualmente como na seção 3.5. Comece colocando um único peixe experimental na câmara inicial por um período de 2 minutos, e feche o acesso aos compartimentos de escolha.
   4. Ao mesmo tempo abra os dois lados da câmara.
      NOTA: Complete um total de 8 ensaios por dia durante três dias consecutivos de tratamento.
2. Denotando a resposta de escolha
   1. Se o peixe escolher corretamente a cor preferida, feche imediatamente a porta da câmara central por 1 minuto, permitindo que o peixe interaja com a recompensa do cardume. Marque este teste como "C" para "Correto" (recompensado).
   2. Se o peixe nadar pela porta incorreta, transfira-o de volta para a câmara central, feche as duas portas e marque este teste como "eu" para "incorreto" (não recompensado).
   3. Se o peixe não tomar uma decisão dentro de 2 minutos após as portas serem abertas, mova o peixe para o lado correto, e marque o teste como "M" para "marcado" (recompensado à força).
3. Aquisição de dados
   1. Para cada zebrafish experimental, regisse a latência da escolha e as pontuações individuais (C, I, M), em ordem, para cada ensaio.
   2. Informe os resultados desses experimentos como médias de grupo para cada bloco de dois ensaios em cada um dos 3 dias de reversão.
   3. Mantenha os dados para peixes de alto e baixo desempenho separados para determinar se eles exibem o mesmo nível de desempenho durante a reversão como durante a aquisição.

Resultados

A aclimatação à câmara de comportamento envolve três dias de treinamento: 2 dias de aclimatação em grupo seguido de 1 dia de aclimatação individual. No entanto, como não conseguimos distinguir os zebrafish individuais uns dos outros, só conseguimos coletar dados durante a aclimatação individual. Neste momento, os animais experimentais (n = 30), condicionados a uma recompensa baseada em cardum, levaram uma média de 125,11 s para chegar à primeira decisão(Figura 2A) e uma médi...

Discussão

Embora tenha havido um enorme crescimento na quantidade e variedade de pesquisas de neurociência realizadas usando zebrafish nos últimos 15 anos²⁴, faltam ensaios comportamentais nesta espécie em comparação com os sistemas de modelos mamíferos^11,25,26. Aqui, mostramos que uma tarefa de escolha de três câmaras desenvolvida para uso com roedores pode ser adaptada para avaliar a aquisição e revers?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Champion Sports Stopwatch Timer Set: Waterproof, Handheld Digital Clock Sport Stopwatches with Large Display for Kids or Coach - Bright Colored 6 Pack	Amazon	N/A	https://www.amazon.com/Champion-Sports-910SET-Stopwatch-Timer/dp/B001CD9LJK/ref=sr_1_17?dchild=1&keywords=stopwatch+for+sports&qid=1597081570&sr=8-17 Recommend two of different colors; one for choice latency and one for time to completion
Coofficer Extra Large Binder Clips 2-Inch (24 Pack), Big Paper Clamps for Office Supplies, Black	Amazon	N/A	https://www.amazon.com/Coofficer-Binder-2-Inch-Clamps-Supplies/dp/B07C94YCR5/ref=sr_1_3_sspa?dchild=1&keywords=large+binder+clips&qid=1597081521&sr=8-3-spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVyPUExUENWUTRZVjlIWEVPJmVuY3J5cHRlZElkPUEwNDQ5NDU0MlpSREkwTFlLSThVQiZlbmNyeXB0ZWRBZElkPUEwMTg5NDI3MllRV1EzOUdWTVpSOCZ3aWRnZXROYW1lPXNwX2F0ZiZhY3Rpb249Y2xpY2tSZWRpcmVjdCZkb05vdExvZ0NsaWNrPXRydWU=
Marineland® Silicone Aquarium Sealant	Petsmart	Item #2431002
PVC (Polyvinyl Chloride) Sheet, Opaque Gray, Standard Tolerance, UL 94/ASTM D1784, 0.125" Thickness, 12" Width, 24" Length	Amazon	N/A	https://www.amazon.com/Polyvinyl-Chloride-Standard-Tolerance-Thickness/dp/B000MAMGEQ/ref=sr_1_2?dchild=1&keywords=grey+PVC+sheet&qid=1597081440&sr=8-2
Steelworks 1/4-in W x 8-ft L Mill Finished Aluminum Weldable Trim U-shaped Channel	Lowes	Item #55979Model #11377	https://www.lowes.com/pd/Steelworks-1-4-in-W-x-8-ft-L-Mill-Finished-Aluminum-Weldable-Trim-Channel/3058181
Tetra 10 Gallon Fish tank	Petsmart	Item #5271256
Top Fin Fine Mesh Fish Net (3 in)	Petsmart	Item #5175115