Поведенческая задача «Выбор трех камер» с использованием рыбок данио в качестве модельной системы

Резюме

Мы представляем поведенческую камеру, предназначенную для оценки когнитивных функций. Мы предоставляем данные, показывающие, что однажды приобретенные, рыбки данио запоминают задачу через 8 недель. Мы также показываем, что гипергликемические рыбки данио изменили когнитивные функции, что указывает на то, что эта парадигма применима к исследованиям, оценивающим познание и память.

Аннотация

Нейродегенеративные заболевания зависят от возраста, изнурительны и неизлечимы. Недавние отчеты также коррелируют гипергликемию с изменениями в памяти и / или когнитивными нарушениями. Мы модифицировали и разработали трехкамерную когнитивную задачу выбора, аналогичную той, которая используется с грызунами для использования с гипергликемическими рыбками данио. Испытательная камера состоит из центрально расположенной пусковой камеры и двух отсеков выбора с обеих сторон, с косяком конспецифичностью, используемой в качестве награды. Мы предоставляем данные, показывающие, что однажды приобретенные рыбки данио запоминают задание по крайней мере через 8 недель. Наши данные показывают, что рыбки данио надежно реагируют на это вознаграждение, и мы выявили когнитивный дефицит у гипергликемических рыб после 4 недель лечения. Этот поведенческий анализ может быть также применим к другим исследованиям, связанным с познанием и памятью.

Введение

Нейродегенеративные заболевания зависят от возраста, изнурительны и неизлечимы. Распространенность этих заболеваний растет, что приводит к настоятельной необходимости в совершенствовании и разработке новых терапевтических стратегий. Начало и представление каждого заболевания уникально, так как некоторые влияют на языковые, двигательные и вегетативные области мозга, в то время как другие вызывают дефицит обучения и потерю памяти^1. В частности, когнитивный дефицит и / или нарушения являются наиболее распространенными осложнениями при всех нейродегенеративных заболеваниях^2. В надежде пролить свет на основные механизмы, связанные с этими нейродегенеративными заболеваниями, было использовано множество различных модельных систем (включая одноклеточные организмы от дрозофилы до позвоночных более высокого порядка, таких как грызуны и люди); однако большинство нейродегенеративных заболеваний остаются неизлечимыми.

Обучение и память являются высокосохраняемными процессами среди организмов, поскольку постоянные изменения окружающей среды требуют адаптации^3. Нарушение как познания, так и синаптической пластичности было продемонстрировано в нескольких моделях грызунов. В частности, хорошо заведомо заведомые поведенческие анализы используют ассоциативное обучение для оценки когнитивных изменений после различных заболеваний и расстройств, вызванных^{нарушениями4.} Кроме того, изменение контрастной дискриминации оценивает когнитивный дефицит, поскольку оно включает в себя функции обучения и памяти более высокого порядка, а изменение зависит от ингибирования ранее изученной ассоциации. Широко используемое трехкамерное задание на выбор разъясняет возможные дефициты путей обучения и памяти центральной нервной системы^5,6. В последнее время эта область расширилась, включив в себя модели, не являющиеся млекопитающими, такие как рыбкиданио (Danio rerio),поскольку было разработано несколько парадигм для диапазона возрастов от личинок до взрослых^{особей 7,8}лет.

Рыбки данио обеспечивают баланс сложности и простоты, что выгодно для оценки когнитивных нарушений с помощью поведенческих методов. Во-первых, рыбки данио поддаются высокопроизводительной поведенческой проверке, учитывая их небольшой размер и плодовитую репродуктивную природу. Во-вторых, рыбки данио обладают структурой, боковым паллием, который аналогичен гиппокампу млекопитающих, поскольку он имеет аналогичные нейронные маркеры и типы клеток^7. Рыбки данио также способны приобретать и запоминать пространственную информацию⁹ и, как и люди, являются суточными^10. Поэтому неудивительно, что рыбки данио все чаще используются в качестве модели нейродегенеративных заболеваний. Однако отсутствие соответствующих поведенческих анализов затруднило применение модели рыбок данио для когнитивных оценок. Опубликованная работа с использованием поведенческих анализов, специфичных для рыбок данио, включает ассоциативные учебные задания^11,тревожное поведение 12, память13, распознавание объектов¹⁴и обусловленное предпочтение места^{15,16,17,18,19.} Хотя было много разработок в отношении поведенческих анализов рыбок данио, аналоги для некоторых тестов когнитивных функций у грызунов еще не разработаны для использования с рыбками данио^18.

Основываясь на предыдущих исследованиях из нашей лаборатории, мы смоделировали / разработали когнитивную задачу у рыбок данио, основанную на трехкамерной задаче выбора, используемой с грызунами, использующими социальное взаимодействие в качестве вознаграждения. Кроме того, мы расширили аспект ассоциативного обучения поведенческой задачи и включили изменение контрастной дискриминации в надежде на дальнейшее развитие этой поведенческой задачи для оценки когнитивных нарушений. Это позволило нам изучить как первоначальное приобретение дискриминационного обучения, так и последующее торможение этого обучения на обратном этапе. В текущем исследовании мы демонстрируем, что эта процедура обеспечила надежный метод оценки когнитивного функционирования у рыбок данио после погружения в глюкозу в течение 4 или 8 недель.

протокол

Все экспериментальные процедуры были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) при Американском университете (протокол No 1606, 19-02).

1. Животные

1. Выращивание и содержание животных
   1. Приобретите взрослых рыбок данио дикого типа(Danio rerio)в возрасте 4-11 месяцев в качестве эмбрионов и выращивайте их самостоятельно.
   2. Поддерживайте рыбу в водной системе стоек при 28–29 °C при 14-ч при 14-ч светлом: 10-ч темном фотопериоде.
   3. Кормите рыбу два раза в день коммерческими хлопьями и добавяйте живую артемию.
   4. Выбирайте рыбу случайным образом из этих резервуаров для поведенческих экспериментов.
2. По завершении эксперимента обезболивают животных погружением в 0,02% трикаина в течение 2 мин или до тех пор, пока не появится недостаток двигательной координации и снижение частоты дыхания для последующего молекулярного и/или нейрохимического анализа.

2. Трехкамерная выборная испытательная камера

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта поведенческая техника была модифицирована из Ruhl et al.²⁰.

1. Конструкция камеры
   1. Модифицируйте поведенческую камеру²⁶— аквариум объемом 40 л (50 х 30 х 30^см3)— чтобы иметь центральную или пусковую камеру (10 х 30 х 30 см^3),отделенную от двух камер бокового выбора (каждая 20 х 30 х 30^см3, рисунок 1А).
   2. Сконструируйте три отсека, используя алюминиевый «U-образный» канал, прикрепленный к внутренним стеклянным стенам с помощью герметика аквариума, чтобы разделить резервуар на три камеры.
   3. Сконструйте непрозрачные перегородки высотой 10 см из серого листа ПВХ, которые вписываются в алюминиевые каналы с обеих сторон. Сделайте каждый разделитель из 2 частей, каждая из которых равна по размеру: неподвижная нижняя часть, постоянно установленная внутри резервуара, и подвижная верхняя часть, которая движется вверх и вниз по алюминиевым дорожкам.
   4. Приклейте очень большие зажимы для связующего к верхней части серых листов ПВХ, чтобы они выступали в качестве ручек.
   5. Используя постоянный маркер, прорисуйте небольшие горизонтальные линии на 10 см выше приклееной серой трубы ПВХ на внешней стороне резервуара.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта отметка является точкой, к которой верхний серый лист ПВХ будет открыт, чтобы обеспечить доступ с любой стороны.
   6. Добавьте контрольную (системную) воду в резервуар до уровня 25 см от дна до верха резервуара, или ~ 30 л. Поместите стеклянные аквариумные нагреватели в каждую секцию камеры за 24 ч до начала испытаний, чтобы довести температуру до 28,5 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Снимите нагреватели в начале сеанса поведения и выполните полный обмен воды после двух дней использования.
2. Установка дискриминации
   1. Для каждой задачи дискриминации индивидуально размещайте цветные войлочные изделия (бежевый, черный или белый) на внешней задней, боковой и нижней сторонах камер выбора, используя Velcro(рисунок 1B–D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Центральная камера не должна иметь цвета фона, связанного с ней.
3. В качестве награды создайте группу конспецифичных (мелководье), поместив 4 взрослых рыбок данио, которые иначе не будут использоваться в исследовании, в небольшой, прозрачный резервуар в дальнем заднем углу каждой камеры выбора(рисунок 1B-D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выбирайте мелководную рыбу случайным образом из резервуаров для скота каждый день, по крайней мере, с одним самцом и одной самкой того же возраста и размера, что и экспериментальная рыба в каждом мелководье.

3. Поведенческие задачи

1. Акклиматизация
   ПРИМЕЧАНИЕ: Акклиматация в поведенческую камеру состоит из трех дней обучения; два дня групповой акклиматизации с последующим днем индивидуального обучения.
2. Групповая акклиматация
   1. Прикрепите бежевый (нейтральный) войлочный фон к внешней стороне обоих отсеков выбора и погрузь живой отсек в каждый из выбранных отсеков(рисунок 1B).
   2. Добавьте пять-шесть рыбок данио в центральную стартовую камеру с открытыми раздвижными дверями и дайте рыбе свободно бродить в течение 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальная рыбка данио должна иметь возможность взаимодействовать и общаться с этими мелководными рыбами через аквариум в качестве награды после пересечения в любом отсеке выбора во время акклиматизации. Считается, что рыба вошла в одну из боковых камер, когда все ее тело входит в камеру.
   3. Повторите эту процедуру с той же подопытной рыбой в течение второго дня (2 дня групповой акклиматизации).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не держите одни и те же группы рыб.
3. Индивидуальная акклиматация
   1. Настройка камеры: Прикрепите бежевый (нейтральный) войлочный фон к внешней стороне обоих отсеков выбора и погрузь живой отсек в оба отсека выбора, как в групповой акклиматизации(рисунок 1B, E).
      1. Поместите отдельную рыбку данио в центральную стартовую камеру на 2 мин с закрытыми раздвижными дверями, а после 2-минутного периода откройте обе двери одновременно.
      2. Убедитесь, что каждая рыба плавает из центральной камеры через дверь в общей сложности 10 раз, независимо от того, с какой стороны. Вознаграждайте рыбу каждый раз, когда она входит в одну из боковых камер (1 день индивидуальной акклиматизации).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если рыба не может выполнить эту задачу 10 раз в течение 30-минутного периода или вообще отказывается покидать стартовую камеру, исключите ее из исследования.
   2. Сбор данных: запишите количество раз, когда рыба плавает в обе стороны, и общее время, необходимое для выполнения задачи.
4. Приобретение
   ПРИМЕЧАНИЕ: После акклиматизации рыбки данио приступили к 3-дневному приобретению.
   1. Установка камеры: Прикрепите белый войлок к внешней стороне одного отсека выбора и черный войлок к внешней стороне другого отсека выбора(рисунок 1C, F).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чередуйте цвет фона каждой стороны ежедневно, используя псевдослучайный график^37.
      1. На время этого этапа обучения размещайте мелкое вознаграждение, размещенное только в одном из выбранных отсеков; это становится вознаграждаемой стороной.
      2. Чтобы начать приобретение, поместите одну подопытную рыбу в стартовую камеру на 2-минутный период с закрытыми отсеками выбора.
      3. После 2-минутной акклиматизации одновременно откройте обе двери, предоставив доступ к обоим отсекам выбора, и запустите секундомер для оценки задержки выбора.
      4. Используя предвзятый дизайн, случайным образом назначьте рыбе либо черное, либо белое предпочтение (т. Е. Либо W +/ B-, либо B+/W-), что означает, что отмель помещается либо в черный (B+), либо в белый (W+) отсек выбора.
   2. Обозначение ответа на выбор
      1. Как только рыба сделает выбор, войдя в один из боковых отсеков, остановите таймер.
      2. Если рыба правильно выбрала предпочтительную сторону, немедленно закройте дверь между центральной камерой и этой стороной, чтобы ограничить рыбу предпочтительной стороной в течение 1 мин, и позвольте ей быть вознагражденной взаимодействием с мелководьем(рисунок 1C, F). Оцените это испытание как «C» за «Правильно» (вознаграждается).
      3. Если рыба проплывает через неправильную дверь, перенесите ее обратно в центральную камеру, закройте обе двери и отличьте испытание как «I» за «неправильное» (не вознагражденное).
      4. Если рыба не принимает решения в течение 2 минут после открытия дверей, переместите рыбу в правильную сторону в течение 1 минуты и засчилите испытание как «М» за «отмеченный» (с награждаемым силой).
      5. При перемещении / перемещении рыбы обратно в стартовую камеру осторожно направляйте рыбу в центральную камеру, используя рыбную сеть в качестве пастушьего инструмента.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Не вычерпывать рыбу из воды и не заменяйте ее в стартовой камере, так как это может повлиять на поведенческий анализ.
      6. Как только рыба вернется в центральную камеру, подождите 1 минуту, прежде чем снова выполнить задание. Убедитесь, что каждая рыба выполняет задание 8 раз.
   3. Сбор данных
      1. Для каждой экспериментальной рыбы запишите время до первого решения (или задержку выбора) и индивидуальные оценки (C, I или M) для каждого из 8 испытаний приобретения (раздел 3.4.2) в порядке.
      2. Отчет о результатах этих экспериментов был представлен в виде средних групп для каждого испытания в каждый день приобретения.
      3. После того, как рыба завершила испытание, классифицируйте ее как «высокоэффективную» рыбу или «низкопроизводительную» рыбу.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Рыба считалась «высокопроизводительной», если ей удалось выбрать правильную сторону аквариума по крайней мере в 6 из 8 общих испытаний за день. Любая рыба, которая не соответствует этому критерию, является «низкоукачествемной».
      4. После идентификации, разместите высокопроизводительных и низкопроизводительных рыб отдельно.
      5. Классифицируйте рыбу как «высоких» или «низких» исполнителей в каждый из трех дней приобретения, после того, как рыба завершила испытания.
         ПРИМЕЧАНИЕ: В конце третьего дня приобретения рыба остается либо «высокой», либо «низкой» в течение всего периода исследования.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые рыбы, которые изначально были в группе «низкой производительность», изучают задачу в день приобретения 2 или 3. Когда это происходит, первоначальная «низкопроизводительная» рыба может быть перемещена в группу «высокопроизводительных». Не перемещайте рыбу между группами таким образом после 3 дня (окончания приобретения).

4. Экспериментальное лечение

1. После периода приобретения, когда рыбки продемонстрируют способность решать простую задачу различения черного и белого фона, начинайте схему лечения подопытной рыбки данио.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы показать применимость этого метода, это исследование показывает два экспериментальных проекта:
   1. Продольное исследование
      1. Верните подопытных рыб в их резервуары на 8 недель. Поддерживайте рыб в стандартных аквариумах с ежедневной подпиткой воды, и кормите их два раза в день.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Не проводите никаких поведенческих тренировок в течение этих 8 недель в резервуарах для хранения.
      2. Выполните обратную оценку после этого периода, чтобы оценить, может ли рыбка данио решить задачу разворота после 8 недель без обучения.
   2. Гипергликемия: подвергайте экспериментальные группы воздействию воды (контроль стресса), маннитола (1%-3%, осмотический контроль) или глюкозы (1%-3%) в течение 4 или 8 недель^22,23.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не проводите никаких поведенческих тренировок в течение этих 4 или 8 недель.

5. Разворот

ПРИМЕЧАНИЕ: После экспериментальных манипуляций (как в разделе 4.2) рыбы тестируются в заключительной части парадигмы 3-камерного выбора — развороте. Для этого вознаграждаемая сторона переворачивается (по сравнению с приобретением) таким образом, что рыба, ранее вознагражденная косяном на белой стороне, теперь вознаграждается косякой на черной стороне и наоборот. Таким образом, разворот оценивает, узнала ли рыба, где находится награда (мелководье), независимо от цвета фона.

1. Установка камеры
   1. Прикрепите черный войлок к внешней стороне одной из выбранных камер и белый войлок к внешней стороне другой, убедившись, что черно-белые стороны являются теми же сторонами, что и в испытаниях по приобретению (раздел 3.4).
   2. Погрузьте отмельной бак в дальний задний угол стороны, который является противоположностью ранее вознагражденной камеры выбора(рисунок 1D, G).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другими словами, рыба, ранее награжденная на белой стороне, теперь вознаграждается на черной стороне и наоборот.
   3. Испытать рыбу по отдельности, как по описанию в разделе 3.5. Начните с помещения одной экспериментальной рыбы в стартовую камеру на 2-минутный период и закройте доступ к выбранным отсекам.
   4. Одновременно открывают обе стороны камеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Завершайте в общей сложности 8 испытаний каждый день в течение трех последовательных дней лечения.
2. Обозначение ответа на выбор
   1. Если рыба правильно выбрала предпочтительный цвет, немедленно закройте дверь в центральную камеру на 1 мин, позволив рыбе взаимодействовать с мелкой наградой. Оцените это испытание как «C» за «Правильно» (вознаграждается).
   2. Если рыба проплывает через неправильную дверь, перенесите ее обратно в центральную камеру, закройте обе двери и отличьте это испытание как «Я» за «неправильное» (не вознагражденное).
   3. Если рыба не принимает решения в течение 2 минут после открытия дверей, переместите рыбу в правильную сторону и поставьте испытание как «М» за «отмеченный» (награждаемый силой).
3. Сбор данных
   1. Для каждой экспериментальной рыбки данио запишите задержку выбора и индивидуальные оценки (C, I, M), в порядке, для каждого испытания.
   2. Сообщите о результатах этих экспериментов в виде средних значений группы для каждого блока с двумя испытаниями в каждый из 3 дней разворота.
   3. Храните данные для высоко- и низкопроизводительных рыб отдельно, чтобы определить, показывают ли они тот же уровень производительности во время разворота, что и во время захвата.

Результаты

Акклиматация в поведенческую камеру включает в себя три дня обучения: 2 дня групповой акклиматизации, за которыми следует 1 день индивидуальной акклиматизации. Однако, поскольку мы не могли отличить отдельных рыбок данио друг от друга, мы смогли собрать данные только во время индивидуа?...

Обсуждение

Хотя за последние 15 лет²⁴года наблюдался огромный рост количества и разнообразия нейробиологических исследований, выполненных с использованием рыбок данио, поведенческие анализы отсутствуют у этого вида по сравнению с модельными системами млекопитающих^11,

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Champion Sports Stopwatch Timer Set: Waterproof, Handheld Digital Clock Sport Stopwatches with Large Display for Kids or Coach - Bright Colored 6 Pack	Amazon	N/A	https://www.amazon.com/Champion-Sports-910SET-Stopwatch-Timer/dp/B001CD9LJK/ref=sr_1_17?dchild=1&keywords=stopwatch+for+sports&qid=1597081570&sr=8-17 Recommend two of different colors; one for choice latency and one for time to completion
Coofficer Extra Large Binder Clips 2-Inch (24 Pack), Big Paper Clamps for Office Supplies, Black	Amazon	N/A	https://www.amazon.com/Coofficer-Binder-2-Inch-Clamps-Supplies/dp/B07C94YCR5/ref=sr_1_3_sspa?dchild=1&keywords=large+binder+clips&qid=1597081521&sr=8-3-spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVyPUExUENWUTRZVjlIWEVPJmVuY3J5cHRlZElkPUEwNDQ5NDU0MlpSREkwTFlLSThVQiZlbmNyeXB0ZWRBZElkPUEwMTg5NDI3MllRV1EzOUdWTVpSOCZ3aWRnZXROYW1lPXNwX2F0ZiZhY3Rpb249Y2xpY2tSZWRpcmVjdCZkb05vdExvZ0NsaWNrPXRydWU=
Marineland® Silicone Aquarium Sealant	Petsmart	Item #2431002
PVC (Polyvinyl Chloride) Sheet, Opaque Gray, Standard Tolerance, UL 94/ASTM D1784, 0.125" Thickness, 12" Width, 24" Length	Amazon	N/A	https://www.amazon.com/Polyvinyl-Chloride-Standard-Tolerance-Thickness/dp/B000MAMGEQ/ref=sr_1_2?dchild=1&keywords=grey+PVC+sheet&qid=1597081440&sr=8-2
Steelworks 1/4-in W x 8-ft L Mill Finished Aluminum Weldable Trim U-shaped Channel	Lowes	Item #55979Model #11377	https://www.lowes.com/pd/Steelworks-1-4-in-W-x-8-ft-L-Mill-Finished-Aluminum-Weldable-Trim-Channel/3058181
Tetra 10 Gallon Fish tank	Petsmart	Item #5271256
Top Fin Fine Mesh Fish Net (3 in)	Petsmart	Item #5175115