ゼブラフィッシュをモデルシステムとして用いた3部屋選択行動課題

要約

認知能力を評価するために設計された行動室を提示します。ゼブラフィッシュは、一度取得すると、8週間後にタスクを覚えていることを示すデータを提供します。我々はまた、高血糖ゼブラフィッシュが認知能力を変化させたことを示し、このパラダイムが認知と記憶を評価する研究に適用されることを示す。

要約

神経変性疾患は、年齢依存性、衰弱性、不治の病です。最近の報告はまた、メモリや認知障害の変化と高血糖を相関しています。.私たちは、高血糖ゼブラフィッシュで使用するためにげっ歯類と同様の3チャンバー選択認知タスクを変更し、開発しました。試験室は、中央に位置する開始室と両側の2つの選択肢コンパートメントで構成され、報酬として使用される固有の浅瀬が使用されます。私たちは、取得したら、ゼブラフィッシュが少なくとも8週間後にタスクを覚えていることを示すデータを提供します。我々のデータは、ゼブラフィッシュがこの報酬に強く反応することを示し、我々は治療の4週間後に高血糖魚の認知障害を同定した。この行動アッセイは、認知および記憶に関連する他の研究にも適用可能である。

概要

神経変性疾患は、年齢依存性、衰弱性、不治の病です。これらの疾患は有病率の増加に伴い、新しい治療戦略を改善し、開発する緊急の必要性をもたらしている。各疾患の発症と提示は、言語、運動、自律神経脳領域に影響を与えるものもあれば、学習障害や記憶喪失を引き起こすもの^もあるので、ユニークです。最も顕著なのは、認知障害および/または障害は、すべての神経変性疾患2で最も一般的な合併症^である。これらの神経変性疾患に関与する根本的なメカニズムに光を当てることを期待して、多くの異なるモデルシステム(げっ歯類やヒトなどの高次脊椎動物への ショウジョウバエ への単細胞生物を含む)の使用が採用されている。しかし、神経変性疾患の大半は不治のままです。

環境への一定の変化は適応を必要とするので、学習と記憶は生物の間で非常に保存されたプロセス^である3.認知およびシナプス可塑性の両方の障害は、いくつかのげっ歯類モデルで実証されています。具体的には、十分に確立された行動アッセイは、様々な障害誘発性疾患および障害に続く認知変化を評価するために連想学習を使用する^4。さらに, コントラスト差別の逆転は、高次学習と記憶機能を伴うので認知障害を評価します, 逆転は、以前に学習した関連の阻害に依存します.広く使用されている3部屋選択タスクは、中枢神経系^5、6の学習および記憶経路における可能な赤字を解明する。近年、幼虫から^7歳、8歳までの年代に対していくつかのパラダイムが開発され、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)などの哺乳類以外のモデルが含まれるように拡大しています。

ゼブラフィッシュは、行動技術と認知障害の評価に有利である複雑さとシンプルさのバランスを提供します。第一に、ゼブラフィッシュは、その小さなサイズと多産の生殖特性を考えると、ハイスループットの行動スクリーニングに適しています。第二に、ゼブラフィッシュは、同様の神経マーカーと細胞型⁷を有する哺乳類海馬に類似した構造、横パリウムを有する。ゼブラフィッシュはまた、空間情報⁹を取得して記憶することができ、人間のように、日当り¹⁰です。したがって、ゼブラフィッシュが頻度の増加に伴い神経変性疾患のモデルとして使用されていることは驚くべきことではありません。しかし、適切な行動アッセイがないことにより、ゼブラフィッシュモデルを認知評価に適用することが困難になっています。ゼブラフィッシュ特異的行動アッセイを用いた公開された研究には、連想学習タスク^11、不安行動^12、記憶^13、物体認識^14、および条件付き場所優先15、16、17、18、19が含まれる。ゼブラフィッシュの行動アッセイに関しては多くの進展があったが、げっ歯類の認知機能のいくつかのテストの対応は、ゼブラフィッシュ¹⁸で使用するためにまだ開発されていない。

私たちの研究室からの以前の研究に基づいて、私たちは報酬として社会的相互作用を使用してげっ歯類で使用される3つの部屋の選択タスクに基づいてゼブラフィッシュの認知タスクをモデル化/開発しました。さらに、行動課題の連想学習の側面を拡大し、認知障害を評価するためのこの行動タスクをさらに発展させることを期待して、対照的な差別の逆転を取り入れた。これにより、差別学習の最初の獲得と、その後の逆転段階での学習の阻害の両方を調べることができ、現在の研究では、この手順が4〜8週間のグルコース浸漬後のゼブラフィッシュの認知機能を評価するための信頼できる方法を提供したことを実証した。

プロトコル

すべての実験手順は、アメリカン大学の制度的動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました(プロトコル#1606、19-02)。

1. 動物

1. 動物の飼育とメンテナンス
   1. 成虫の野生型ゼブラフィッシュ(ダニオ・レリオ)を4~11ヶ月齢の胚として入手し、社内で飼育する。
   2. 14-h 光:10-h 暗光周期で 28– 29 °C の水生ラック システムで魚を維持します。
   3. 商業フレークで1日2回魚を養い、生きた アルテミアを補充します。
   4. 行動実験のためにこれらのストックタンクからランダムに魚を選択してください。
2. 実験完了時に、0.02%トリケーヌに2分間浸漬するか、運動協調が不足し、後の分子および/または神経化学的分析のための呼吸速度が低下するまで動物を麻酔します。

2. 3部屋選択試験室

注意: この行動手法は、Ruhlら^20.

1. チャンバー建設
   1. 行動室²⁶を変更する - 40 L水槽(50 x 30 x 30 cm 3)-2つの側面選択室(それぞれ20 x 30 x 30 cm³⁾から分離された中央または開始室(10 x 30 x 30 cm³⁾を有する。
   2. 内ガラス壁に付着したアルミニウム「U字型」チャネルを使用して3つのコンパートメントを構築し、タンクを3つのチャンバーに分離します。
   3. 灰色のPVCシートの中から、両側のアルミニウムチャネルに収まる不透明な仕切り機を構築します。タンク内に永久に取り付けられた静止した底部分と、アルミトラックで上下に動く移動可能なトップピース:2つの部分から各仕切りを作ります。
   4. 灰色のPVCシートの上部に特大バインダークリップを接着して、ハンドルとして機能させます。
   5. 永久マーカーを使用して、タンクの外側に付着した灰色のPVCパイプの上に10cmの小さな水平線を描きます。
      注:このマークは、上部の灰色のPVCシートがいずれかの側へのアクセスを許可するために開かれるポイントです。
   6. タンクの底から上へ25cmのレベルにタンクに制御(システム)水を加える、または〜30 L.24時間のチャンバの各セクションにガラスの水槽ヒーターを置き、温度を28.5°Cに持ち込みます。
      注:動作セッションの開始時にヒーターを取り外し、2日間使用した後に完全な水交換を行います。
2. 差別の設定
   1. 各識別タスクについて、ベルクロを使用して、選択室の外側の裏、側面、および底部に色付きフェルトピース(ベージュ、黒、または白)を個別に配置します(図1B–D)。
      注: 中央の部屋には背景色が関連付けされていない必要があります。
3. 報酬として、各選択室の遠い隅にある小さな透明なタンクに、研究で使用されない4つの成体ゼブラフィッシュを配置することによって、特定のグループ(浅瀬)を作成します(図1B-D)。
   注:各浅瀬タンクの実験魚と同じ年齢と大きさの少なくとも1人の男性と1匹のメスで、毎日ストックタンクから浅瀬魚をランダムに選びます。

3. 行動タスク

1. 順化
   注:行動室への順応は、トレーニングの3日間で構成されています。グループ順応の2日間、続いて1日の個別トレーニング。
2. グループ順応
   1. 両方の選択肢コンパートメントの外側にベージュ(ニュートラル)フェルト背景を取り付け、それぞれの選択コンパートメントにライブショールタンクを水没させます(図1B)。
   2. 両方のスライドドアを開けた中央のスタートチャンバーに5〜6匹のゼブラフィッシュを加え、魚が30分間自由に歩き回るようにします。
      注:実験的なゼブラフィッシュは、順応中にどちらかの選択肢コンパートメントに入った後、報酬としてタンクを通してこれらの浅瀬魚と相互作用し、交流することができるはずです。魚は、その体全体がチャンバーに入るとき、側の部屋の1つに入ったと考えられています。
   3. 同じ実験魚を2日目(2日間の群順順化)に繰り返します。
      注:魚の同じグループを維持しないでください。
3. 個人の順応
   1. チャンバーのセットアップ:ベージュ(ニュートラル)フェルトの背景を両方の選択肢コンパートメントの外側に取り付け、グループ順応のように両方の選択コンパートメントにライブショールタンクを水没させます(図1B,E)。
      1. 中央のスタートチャンバーに個々のゼブラフィッシュを2分間スライドドアを閉めて、2分の期間の後、両方のドアを同時に開きます。
      2. 各魚が中央の部屋からドアを通って、どちらの側に関係なく合計10回泳ぐことを確認してください。それは側の部屋の一つに入るたびに魚に報酬を与える(個々の順応の1日)。
         注:魚が30分以内にこのタスクを10回完了できない場合、または出発室を離れることをまったく拒否した場合は、調査から除外してください。
   2. データ取得: 魚がいずれかの側に泳いだ回数と、タスクの完了にかかる合計時間を記録します。
4. 取得
   注:順応後、ゼブラフィッシュは3日間の買収作業を開始しました。
   1. チャンバーのセットアップ:一方の選択肢コンパートメントの外側に白いフェルト片を取り付け、もう一方の選択肢コンパートメントの外側に黒いフェルトピースを取り付けます(図1C,F)。
      注:擬似ランダムスケジュール³⁷を使用して、毎日それぞれの側の背景色を交互にします。
      1. トレーニングのこの段階の間、選択コンパートメントの1つにだけ置かれた浅瀬報酬を置きます。これは報われる側になります。
      2. 取得を開始するには、選択コンパートメントを閉じた状態で2分間、出発室に単一の実験魚を置きます。
      3. 2分順応後、両方のドアを同時に開き、両方の選択肢コンパートメントにアクセスし、ストップウォッチを起動して選択待ち時間を評価します。
      4. 偏ったデザインを使用して、魚に黒または白の好み(W+/B-またはB+/W-)をランダムに割り当て、浅瀬が黒(B+)または白(W+)の選択コンパートメントに配置されることを意味します。
   2. 選択応答の示し
      1. 魚がサイドコンパートメントの1つを入力して選択したら、タイマーを停止します。
      2. 魚が正しく好ましい側を選択した場合、中央室とその側の間のドアを直ちに閉じて、魚を1分間好ましい側に制限し、浅瀬タンクと相互作用して報われるようにします(図1C,F)。このトライアルを「正しい」(報われた)の「C」としてスコアを付けます。
      3. 魚が間違ったドアを泳いだ場合は、中央室に戻し、両方のドアを閉め、「間違った」(報われない)の「I」として裁判を採点します。
      4. ドアが開いてから2分以内に魚が決まらない場合は、魚を正しい側に1分間移動し、"マーク"(強制報い)の「M」としてトライアルを獲得します。
      5. 魚を出発室に戻す/移動するとき、羊飼いの道具として魚網を使って中央の部屋に魚をそっと導きます。
         注:これは行動アッセイに影響を与える可能性がありますので、水から魚をすくい取り、開始チャンバーに交換しないでください。
      6. 魚が中央の部屋に戻ったら、1分待ってからタスクを再度実行します。各魚がタスクを 8 回実行することを確認します。
   3. データ取得
      1. 各実験魚について、8 つの取得試行 (セクション 3.4.2) のそれぞれについて、最初の決定 (または選択遅延) と個々のスコア (C、I、または M) を順番に記録します。
      2. これらの実験の結果を報告し、各取得日の各試験のグループ平均として報告した。
      3. 魚が試験を完了したら、それを「高性能」魚または「パフォーマンスの低い」魚のいずれかに分類します。
         注:魚は、それが成功した場合は、その日の8つの合計試験の少なくとも6でタンクの正しい側面を選択した場合、「高性能」と見なされました。この基準を満たさない魚は「低い実行者」です。
      4. 一度識別, ハウス高いパフォーマンスと低パフォーマンスの魚は別々に.
      5. 魚が試験を完了した後、獲得の3日間のそれぞれで「高い」または「低い」パフォーマーとして魚を分類します。
         注:取得の3日目の終わりに、魚は研究期間中「高い」または「低い」パフォーマーのいずれかとして残ります。
         注:最初は「パフォーマンスの低い」グループにあった魚の中には、買収2日目または3日目にタスクを学ぶものもあります。これが起こると、最初の「低パフォーマンス」の魚は「高性能」グループに移動することができます。3日目(取得終了)の後、この方法でグループ間で魚を移動しないでください。

4. 実験的な治療

1. 取得期間後、魚が黒と白の背景の間の単純な差別作業を解決する能力を示すとき、実験ゼブラフィッシュの治療レジメンを開始する。
   注: この方法の適用性を示すために、この研究は2つの実験計画を示しています:
   1. 縦方向の研究
      1. 実験魚を8週間保持タンクに戻します。毎日の水の変化と標準的なタンクで魚を維持し、毎日2回それらを供給します。
         注:保持タンクでこれらの8週間の間、任意の行動訓練を行わない。
      2. この期間の後に逆転評価を行い、ゼブラフィッシュがトレーニングなしで8週間後に逆転タスクを解決できるかどうかを評価します。
   2. 高血糖症:実験群を水(ストレス制御の処理)、マンリトール(1%~3%、浸透圧制御)、またはグルコース(1%~3%)を4週間または8週間^22、23に曝します。
      注:この4週間または8週間の間、行動訓練を行わないで下してください。

5. 逆転

注:実験操作(セクション4.2のように)に続いて、魚は3部屋選択パラダイムの最終部分でテストされます- 逆転。これを行うには、報われた側は、以前に白い側の浅瀬で報われた魚が黒い側の浅瀬で報われるような(買収と比較して)逆転し、その逆もまた同様です。このように、逆転は、魚が報酬(浅瀬)が位置する場所を、背景の色に関係なく、学んだかどうかを評価します。

1. チャンバーのセットアップ
   1. 選択室の外側に黒いフェルトを取り付け、もう一方の外側に白いフェルトを取り付け、黒と白の側面が取得試験と同じ側面であることを確認します(セクション3.4)。
   2. 以前に報われた選択室の反対である側の遠い後ろの隅に浅瀬タンクを水没する(図1D,G)。
      注:言い換えれば、以前に白い側で報われた魚は今では黒い側に報われ、その逆もまた同様です。
   3. セクション3.5のように魚を個別にテストしてください。2分間、出発室に1つの実験魚を置くことから始め、選択肢コンパートメントへのアクセスを閉じます。
   4. 同時にチャンバーの両側を開きます。
      注:3回連続治療日の合計8回の試験を毎日完了してください。
2. 選択応答の示し
   1. 魚が正しく好みの色を選択した場合は、すぐに1分間中央室のドアを閉め、魚が浅瀬報酬と相互作用できるようにします。このトライアルを「正しい」(報われた)の「C」としてスコアを付けます。
   2. 魚が間違ったドアを泳いだ場合は、中央室に戻し、両方のドアを閉め、「間違った」(報われない)の「I」としてこの裁判を採点します。
   3. ドアが開いてから2分以内に魚が決定を下さない場合は、魚を正しい側に移動し、"マーク"(強制報い)の「M」としてトライアルを獲得します。
3. データ取得
   1. 実験用ゼブラフィッシュごとに、各試験の順番に、選択待ち時間と個々のスコア(C、I、M)を記録します。
   2. これらの実験の結果を、3 回の逆転日の各 2 試行ブロックのグループ平均として報告します。
   3. 高い魚と低パフォーマンスの魚のデータを別々に保ち、取り消し時と同じレベルの性能を獲得したかどうかを判断します。

結果

行動室への順応は、訓練の3日間を含む:グループ順応の2日間に続いて、個々の順応の1日。しかし、個々のゼブラフィッシュを区別することができなかったため、個々の順応の間しかデータを収集できませんでした。このとき、浅瀬ベースの報酬を使用して条件付けされた実験動物(n=30)は、最初の決定に達するまで平均125.11sを要し、平均725.34s(12分)を要して、個々の順応...

ディスカッション

過去15年間²⁴年にゼブラフィッシュを用いて行われた神経科学研究の量と多様性は大きく伸びていますが、哺乳類モデルシステム11,25,26と比較して行動アッセイがこの種に欠けている。ここでは、げっ歯類と共に使用するために開発された3つのチャンバー選択タスクを、ゼブラフィッシュにおける視覚差?...

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