제브라피쉬를 모델 시스템으로 사용하는 3챔버 선택 행동 작업

요약

우리는 인지 성능을 평가하기 위해 설계된 행동 챔버를 제시한다. 우리는 일단 인수한 후, 제브라피쉬가 8주 후에 그 일을 기억한다는 것을 보여주는 데이터를 제공합니다. 우리는 또한 고혈당 얼룩말 물고기인지 성능을 변경 했다 보여줍니다., 이 패러다임 인식 및 메모리를 평가 하는 연구에 적용 할 수 있음을 나타내는.

초록

신경 퇴행성 질환은 연령에 따라 다르고 쇠약하며 불치입니다. 최근 보고서는 또한 기억 및 인지 장애의 변화와 고혈당증을 상관. 우리는 고혈당 제브라피시와 함께 사용하기 위해 설치류와 유사한 3 챔버 선택 인지 작업을 수정하고 개발했습니다. 테스트 챔버는 중앙에 위치한 시작 챔버와 양쪽에 두 개의 선택 구획으로 구성되어 있으며, 보상으로 사용되는 동특화 의 숄. 우리는 일단 인수한 후, 제브라피쉬가 적어도 8주 후에 작업을 기억한다는 것을 보여주는 데이터를 제공합니다. 우리의 데이터는 제브라피쉬가 이 보상에 강력하게 반응한다는 것을 표시하고, 우리는 처리의 4 주 후에 고혈당 물고기에 있는 인식 적자를 확인했습니다. 이 행동 분석은 또한 인식 및 기억과 관련 있는 그밖 연구 결과에 적용될 수 있습니다.

서문

신경 퇴행성 질환은 연령에 따라 다르고 쇠약하며 불치입니다. 이 질병은 보급에서 증가하고, 새로운 치료 전략을 개선하고 개발하는 긴급한 필요의 결과로. 각 질병의 발병 및 프리젠 테이션은 독특하며, 일부는 언어, 모터 및 자율 뇌 영역에 영향을 미치며 다른 질병은 학습 적자 및 기억 상실^1을유발합니다. 가장 주목할 만한 것은, 인지 적자 및/또는 손상은 모든 신경 퇴행성 질환^2에걸쳐 가장 널리 퍼진 합병증입니다. 이러한 신경 퇴행성 질환에 관여하는 근본적인 메커니즘에 빛을 흘리기 위해, 많은 다른 모델 시스템 (설치류와 인간과 같은 고차 척추 동물에 Drosophila에 단세포 유기체를 포함)의 사용이 사용되었습니다; 그러나, 신경 퇴행성 질환의 대부분은 불치의 남아.

학습과 기억은 환경에 대한 지속적인 변화로 인해 적응^3이필요하기 때문에 유기체 들 사이에서 매우 보존된 과정입니다. 인지 및 시 냅 스 가소성 모두에서 손상 여러 설치류 모델에서 입증 되었습니다. 구체적으로, 잘 확립된 행동적 인약은 다양한 장애 유발 질환 및 장애^4에따른 인지 변화를 평가하기 위해 연관 학습을 사용한다. 또한, 대조 차별 반전 은 높은 순서 학습 및 메모리 기능을 포함 하기 때문에 인지 적자를 평가, 반전 이전에 배운 협회의 억제에 따라 달라 집니다. 널리 사용되는 3 챔버 선택 작업은 중추^신경계의학습 및 메모리 경로에서 가능한 적자를 해명^5,6. 최근에는 유충에서^성인7,^8까지다양한 연령대의 패러다임이 개발됨에 따라 제브라피쉬(Daniorerio)와같은 비포유류 모델을 포함하도록 확장되고 있다.

Zebrafish는 행동 기술로 인지 장애의 평가에 유리한 복잡성과 단순성의 균형을 제공합니다. 첫째, 제브라피쉬는 작은 크기와 다작 생식 특성을 감안할 때 높은 처리량 행동 검진에 순종합니다. 둘째, 제브라피쉬는 유사한 뉴런 마커및 세포유형^7을가지므로 포유류 해마와 유사한 구조, 측면 팔륨을 갖는다. Zebrafish는 또한 공간 정보^9를 획득하고 기억할 수 있으며, 인간과 마찬가지로^{10개입니다.} 따라서, 제브라피쉬가 빈도가 증가하는 신경퇴행성 질환의 모델로 사용되고 있다는 것은 놀라운 일이 아니다. 그러나 적절한 행동 적 실험이 없으면 인지 평가를 위해 제브라피시 모델을 적용하기가 어려워졌습니다. 제브라피쉬특이적 행동적 작용제는 연관학습작업(11, 불안행동^{12개,기억13,}개체인식^14,조건부-장소 선호도^{15,16,17,18,19)}등이 있다. 제브라피쉬 행동 실험과 관련하여 많은 발전이 있었지만, 설치류에서 인지 기능의 일부 테스트에 대한 대응은 아직 제브라피시^18과함께 사용하기 위해 개발되지 않았습니다.

우리의 실험실에서 이전 연구를 기반으로, 우리는 모델링 / 보상으로 사회적 상호 작용을 사용하여 설치류와 함께 사용되는 세 챔버 선택 작업을 기반으로 제브라피시에 인지 작업을 개발. 또한, 우리는 행동 작업의 연관 학습 측면에 확장하고 인지 장애를 평가하기 위해이 행동 작업을 더 개발하기 위해 대비 차별 반전을 통합. 이를 통해 차별 학습의 초기 인수와 반전 단계에서 그 학습의 후속 억제를 모두 검토할 수 있었습니다. 현재 연구에서는, 우리는 이 절차가 4 또는 8 주 동안 포도당 침수 다음 제브라피시에서 인지 기능을 평가하기위한 신뢰할 수있는 방법을 제공 한다는 것을 보여줍니다.

프로토콜

모든 실험 절차는 미국 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다 (프로토콜 # 1606, 19-02).

1. 동물

1. 동물 사육 및 유지 보수
   1. 4-11개월 된 성인 야생형 제브라피쉬(Daniorerio)를배아로 획득하고 사내에서 사육합니다.
   2. 14h 광:10-h 어두운 광기간에 28-29°C에서 수중 랙 시스템에서 물고기를 유지합니다.
   3. 상업용 플레이크로 하루에 두 번 물고기를 먹이고 살아있는 아르테미아로보충하십시오.
   4. 행동 실험을 위해 이러한 스톡 탱크에서 무작위로 물고기를 선택하십시오.
2. 실험 이 완료되면, 2 분 동안 0.02 % 트리카인에 침수하여 동물을 마취하거나 모터 조정이 부족하고 나중에 분자 및 / 또는 신경 화학 적 분석을위한 호흡 속도를 감소시킬 때까지.

2. 3 챔버 선택 테스트 챔버

참고:이 행동 기술은 Ruhl 외^20에서수정되었습니다.

1. 챔버 건설
   1. 행동^{챔버(26)를}수정하여 40L 수족관(50 x 30 x 30cm^3)-중앙또는 시작 챔버(10 x 30 x 30cm^3)를가지도록, 두 개의 측면 선택 챔버(각 20 x 30 x 30cm^3,그림 1A)에서분리된다.
   2. 수족관 실란트가 있는 내부 유리 벽에 부착된 알루미늄 "U자형" 채널을 사용하여 3개의 구획을 구성하여 탱크를 3개의 챔버로 분리합니다.
   3. 양쪽의 알루미늄 채널에 맞는 회색 PVC 시트에서 10cm 높이의 불투명 한 칸막이를 구성합니다. 각 칸막이를 2개 조각으로 만들어 각 크기의 크기와 동일하게 만듭니다: 탱크 내에 영구적으로 장착된 고정된 바닥 조각과 알루미늄 트랙에서 위아래로 움직이는 움직이는 이동 가능한 탑 피스.
   4. 초대형 바인더 클립을 회색 PVC 시트 의 상단에 접착제로 고정하여 핸들 역할을 합니다.
   5. 영구 마커를 사용하여 탱크 바깥쪽에 부착된 회색 PVC 파이프 위에 10cm 높이의 작은 수평 선을 그립니다.
      참고: 이 표시는 양쪽에 액세스할 수 있도록 상단 회색 PVC 시트를 열 수 있는 지점입니다.
   6. 탱크에 제어(system) 물을 탱크의 바닥에서 위로 25cm 수준으로 추가하거나, ~ 30 L. 유리 수족관 히터를 챔버의 각 섹션에 24시간 동안 챔버의 각 섹션에 넣고 28.5°C로 온도를 가져오는 테스트를 한다.
      참고: 동작 세션이 시작될 때 히터를 제거하고 2일 사용 후 전체 물 교환을 수행합니다.
2. 차별 설정
   1. 각 차별 작업에 대해 벨크로(그림1B-D)를사용하여 선택 챔버의 바깥쪽, 측면 및 하단에 각각 색펠트 조각(베이지색, 검은색 또는 흰색)을 배치합니다.
      참고: 중앙 챔버에는 배경색과 관련된 배경색이 없어야 합니다.
3. 보상으로, 각 선택 챔버의 먼 뒷모서리에 작고 명확한 탱크에서 연구에서 달리 사용되지 않는 4 명의 성인 얼룩말 피시 (그림 1 B-D)를 배치하여 동특이성 (shoal)의 그룹을 만듭니다(도 1B-D).
   참고: 각 숄 탱크의 실험어와 같은 연령과 크기의 남성 1명과 암컷 1마리를 매일 스톡 탱크에서 무작위로 삽 물고기를 선택합니다.

3. 행동 작업

1. 적응
   참고: 행동 챔버에 적응하는 것은 3 일간의 훈련으로 구성됩니다. 그룹 적응의 이틀 다음 개별 훈련의 하루.
2. 그룹 적응
   1. 베이지색(중립)을 두 선택 구획의 외부에 배경이 부착하고, 각 선택구(도1B)에라이브 숄 탱크를 침수한다.
   2. 슬라이딩 도어가 모두 열려 있는 가운데 시작 챔버에 5-6개의 얼룩말어를 추가하고 물고기가 30분 동안 자유롭게 돌아다닐 수 있도록 합니다.
      참고 : 실험 적인 얼룩말 물고기는 적응 하는 동안 어느 선택 된 구획으로 교차 후 보상으로 탱크를 통해 이러한 shoal 물고기와 상호 작용 하 고 사교 수 있어야 합니다. 물고기는 전신이 챔버에 들어갈 때 측면 챔버 중 하나에 들어간 것으로 간주됩니다.
   3. 두 번째 날 (그룹 적응의 2 일)에 대한 동일한 실험 물고기와이 절차를 반복합니다.
      참고: 동일한 물고기 그룹을 유지하지 마십시오.
3. 개별 적응
   1. 챔버 설정: 베이지색(중립)을 선택 구획의 외부에 배경이 부착하고, 그룹적응(도 1B, E)과같이 선택 구획 모두에 라이브 숄 탱크를 침수한다.
      1. 슬라이딩 도어가 닫혀 있는 가운데 시작 챔버에 개별 얼룩말어를 2분 간 배치하고, 2분 후 두 문을 동시에 엽니다.
      2. 각 물고기가 어느 쪽에 관계없이 총 10 번 문을 통해 중앙 챔버에서 수영하는지 확인하십시오. 측면 챔버 중 하나에 들어갈 때마다 물고기를 보상하십시오 (개별 적응의 1 일).
         참고: 물고기가 30분 이내에 이 작업을 10번 완료할 수 없거나 시작 챔버를 전혀 떠나기를 거부하는 경우 연구에서 제외하십시오.
   2. 데이터 수집: 물고기가 어느 쪽으로 수영하는 횟수와 작업을 완료하는 데 걸리는 총 시간을 기록합니다.
4. 획득
   참고: 적응 후, 제브라피쉬는 3일 간의 인수 작업을 시작했습니다.
   1. 챔버 설정: 한 선택 구획의 외부에 흰색 펠트 피스를 부착하고 다른 선택 구획의 외부에 검은 펠트 조각을 부착합니다(그림1C, F).
      참고: 의사 랜덤^{스케줄(37)을}사용하여 매일 각 면의 배경색을 번갈아 가세요.
      1. 훈련의이 단계의 기간 동안, 만 선택 구획 중 하나에 배치 된 신발 보상을 배치; 이것은 보상측이 됩니다.
      2. 인수를 시작하려면 선택 구획이 닫히면서 2분 동안 시작 챔버에 실험용 물고기를 하나 만 배치합니다.
      3. 2분 순응 후, 두 도어를 동시에 열어 두 개의 선택 구획에 접근할 수 있으며 스톱워치를 시작하여 선택 대기 시간을 평가합니다.
      4. 편향된 디자인을 사용하여 물고기에게 흑백 기본 설정(즉, W+/B 또는 B+/W-)을 임의로 할당하여 숄이 검은색(B+) 또는 흰색(W+) 선택 구획에 배치됨을 의미합니다.
   2. 선택 응답 표시
      1. 물고기가 사이드 컴파트먼트 중 하나에 들어가서 선택하면 타이머를 중지하십시오.
      2. 물고기가 올바르게 선호하는 쪽을 선택하는 경우, 즉시 중앙 챔버와 그 측 사이의 문을 닫아 물고기를 선호하는 쪽으로 1 분 동안 제한하고, 상기 숄 탱크(도 1C, F)와상호 작용하여 보상을 받을 수 있도록한다. 이 시험을 "올바른"(보상)에 대해 "C"로 점수가 매려있습니다.
      3. 물고기가 잘못된 문을 통해 수영하는 경우, 중앙 챔버로 다시 전송, 두 문을 닫고, "잘못된"에 대한 "I"로 재판을 점수 (비 보상).
      4. 물고기가 문을 연 후 2 분 이내에 결정을내리지 않으면 물고기를 올바른 쪽으로 1 분 동안 이동하고 "표시"(강제 보상)에 대한 "M"로 재판을 점수.
      5. 물고기를 다시 출발실로 옮기고 옮길 때, 물고기를 양치기 도구로 사용하여 물고기를 중앙 챔버로 부드럽게 안내합니다.
         참고: 물고기가 물 밖으로 떠서 행동 분석에 영향을 줄 수 있으므로 시작 챔버로 교체하지 마십시오.
      6. 물고기가 중앙 챔버로 돌아오면 다시 작업을 수행하기 전에 1 분 동안 기다립니다. 각 물고기가 작업을 8번 수행하도록 합니다.
   3. 데이터 수집
      1. 각 실험어에 대해 8개의 취득 시험(섹션 3.4.2)에 대해 첫 번째 결정(또는 선택 대기 시간)과 개별 점수(C, I 또는 M)를 순서대로 기록합니다.
      2. 이러한 실험의 결과를 각 평가판에 대한 그룹 평균으로 보고하였다.
      3. 물고기가 시험을 마치면 "고성능" 물고기 또는 "성능이 낮은" 물고기로 분류합니다.
         참고: 하루에 8번의 총 시험 중 최소 6개에서 탱크의 올바른 면을 선택한 물고기는 "고성능"으로 간주되었습니다. 이 기준을 충족하지 않는 모든 물고기는 "낮은 연기자"입니다.
      4. 일단 확인되면, 집 높은 성능과 낮은 성능의 물고기별도로.
      5. 물고기가 시험을 마친 후, 수집 3 일 의 각각에 "높은"또는 "낮은"공연으로 물고기를 분류합니다.
         참고: 수집 사흘이 되면 생선은 연구 기간 동안 "높음" 또는 "낮은" 공연자로 유지됩니다.
         참고: 처음에는 '저조한' 그룹에 있던 일부 물고기가 2일 또는 3일에 작업을 학습합니다. 이 경우 초기 '저조한' 물고기가 '고성능' 그룹으로 이동할 수 있습니다. 3일째(인수 종료) 이후에는 그룹 간에 물고기를 이동하지 마십시오.

4. 실험적 치료

1. 획득 기간 이후에, 물고기가 흑백 배경 사이의 단순한 차별 작업을 해결할 수있는 능력을 입증할 때, 실험 제브라피시에 대한 치료 요법을 시작합니다.
   참고: 이 방법의 적용 가능성을 보여주기 위해 이 연구는 두 가지 실험 설계를 보여줍니다.
   1. 경도 연구
      1. 실험용 물고기를 8주 동안 들고 있는 탱크에 반품합니다. 매일 물이 바뀌는 표준 탱크에서 물고기를 유지하고 매일 두 번 먹입니다.
         참고: 홀딩 탱크에서 8주 동안 행동 훈련을 실시하지 마십시오.
      2. 이 기간 이후에 반전 평가를 수행하여 제브라피쉬가 훈련 없이 8주 후에 반전 과제를 해결할 수 있는지 여부를 평가합니다.
   2. 고혈당증: 실험군을 물(응력 조절 처리), 매니톨(1%-3%, 삼투성 조절), 또는 포도당(1%-3%)에 4또는 8주^22,23에노출한다.
      참고: 4주 또는 8주 동안행동교육을 실시하지 마십시오.

5. 반전

참고: 실험 조작(섹션 4.2과 같이)에 따라 물고기는 3챔버 선택 패러다임의 마지막 부분에서 테스트됩니다. 이를 위해, 보상 측은 이전에 흰색 측면에 신발로 보상 물고기가 지금 검은 면에 신발로 보상하고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다 등 (인수에 비해) 반전된다. 이러한 방식으로 반전은 배경의 색상에 관계없이 물고기가 보상(shoal)이 있는 위치를 배웠는지 여부를 평가합니다.

1. 챔버 설정
   1. 선택 챔버 중 하나의 외부에 펠트 검은 색을 부착하고 흰색은 다른 쪽으로 느꼈으며, 흑백 면이 인수 시험 (섹션 3.4)과 동일한 측면인지 확인합니다.
   2. 이전에 보상받은 선택챔버(도 1D, G)와반대되는 측면의 먼 뒤쪽 모서리에 있는 숄 탱크를 침수한다.
      참고 : 즉, 이전에 흰색 측면에 보상 물고기는 이제 검은 면에 보상하고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
   3. 3.5절과 같이 물고기를 개별적으로 테스트합니다. 시작 챔버에 실험어 1개를 2분 동안 배치하고 선택 구획에 대한 액세스를 차단합니다.
   4. 동시에 챔버의 양쪽을 엽니 다.
      참고: 3일 연속 치료일 동안 매일 총 8건의 시험을 완료합니다.
2. 선택 응답 표시
   1. 물고기가 원하는 색상을 올바르게 선택하면 즉시 중앙 챔버에 문을 닫고 1 분 동안 물고기를 밀어 넣습니다. 이 시험을 "올바른"(보상)에 대해 "C"로 점수가 매려있습니다.
   2. 물고기가 잘못된 문을 통해 수영하는 경우, 중앙 챔버로 다시 전송, 두 문을 닫고,이 시험을 점수 "잘못된"에 대한 (비 보상).
   3. 물고기가 문을 연 후 2 분 이내에 결정을내리지 않으면 물고기를 올바른 쪽으로 옮기고 "표시"(강제 보상)에 대한 "M"로 재판을 점수.
3. 데이터 수집
   1. 각 실험 제브라피쉬에 대해 각 시험마다 선택 대기 시간과 개별 점수(C, I, M)를 순서대로 기록합니다.
   2. 이러한 실험의 결과를 각 2심판 블록에 대해 3개의 반전 일별로 그룹 평균으로 보고합니다.
   3. 고성능 및 저성능 어류에 대한 데이터를 별도로 유지하여 획득 하는 동안과 동일한 수준의 성능이 반전되는 동안 성능을 표시했는지 여부를 결정합니다.

결과

행동 챔버에 적응하는 것은 훈련의 3 일을 포함: 그룹 적응의 2 일 다음 1 개인 적응의 일. 그러나 개별 제브라피쉬를 서로 구별할 수 없기 때문에 개별 적응 중에만 데이터를 수집할 수 있었습니다. 이때, 동물(n=30)은 삽계 보상을 이용하여 컨디셔닝하여, 첫 번째결정(그림 2A)과평균 725.34s(12분)의 평균을 받아 전체 개별 적응태스크(그림2B)를완료하였다. ?...

토론

지난 15년 동안 제브라피쉬를 이용한 신경과학 연구의 양과 다양성이 엄청나게 증가했지만, 포유류 모델^{시스템(11,25,26)에}비해 이 종에서는 행동적 실험이 부족하다. 여기서는 설치류와 함께 사용하기 위해 개발된 3챔버 선택 과제를 제브라피시에서 시각적 차별 학습의 획득 및 반전을 평가하기 위해 조정할 ?...

자료

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