La tâche comportementale de choix à trois chambres utilisant le poisson-zèbre comme système modèle

Résumé

Nous présentons une chambre comportementale conçue pour évaluer les performances cognitives. Nous fournissons des données montrant qu’une fois acquis, le poisson-zèbre se souvient de la tâche 8 semaines plus tard. Nous montrons également que les poissons-zèbres hyperglycémiques ont modifié les performances cognitives, ce qui indique que ce paradigme est applicable aux études évaluant la cognition et la mémoire.

Résumé

Les maladies neurodégénératives dépendent de l’âge, sont débilitantes et incurables. Des rapports récents ont également corrélé l’hyperglycémie avec des changements dans la mémoire et / ou des troubles cognitifs. Nous avons modifié et développé une tâche cognitive de choix à trois chambres similaire à celle utilisée avec les rongeurs pour une utilisation avec le poisson-zèbre hyperglycémique. La chambre d’essai se compose d’une chambre de départ située au centre et de deux compartiments de choix de chaque côté, avec un banc de congénères utilisé comme récompense. Nous fournissons des données montrant qu’une fois acquis, le poisson-zèbre se souvient de la tâche au moins 8 semaines plus tard. Nos données indiquent que le poisson-zèbre répond de manière robuste à cette récompense, et nous avons identifié des déficits cognitifs chez les poissons hyperglycémiques après 4 semaines de traitement. Ce test comportemental peut également être applicable à d’autres études liées à la cognition et à la mémoire.

Introduction

Les maladies neurodégénératives dépendent de l’âge, sont débilitantes et incurables. La prévalence de ces maladies augmente, ce qui entraîne un besoin urgent d’améliorer et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. L’apparition et la présentation de chaque maladie sont uniques, car certaines affectent les régions du langage, du moteur et du cerveau autonome, tandis que d’autres provoquent des déficits d’apprentissage et des pertes de mémoire¹. Plus particulièrement, les déficits cognitifs et/ou les déficiences sont les complications les plus répandues dans toutes les maladies neurodégénératives². Dans l’espoir de faire la lumière sur les mécanismes sous-jacents impliqués dans ces maladies neurodégénératives, l’utilisation de nombreux systèmes modèles différents (y compris des organismes unicellulaires à la drosophiles aux vertébrés d’ordre supérieur tels que les rongeurs et les humains) a été utilisée; cependant, la majorité des maladies neurodégénératives restent incurables.

L’apprentissage et la mémoire sont des processus hautement conservés parmi les organismes, car les changements constants de l’environnement nécessitent une adaptation³. L’altération de la cognition et de la plasticité synaptique a été démontrée dans plusieurs modèles de rongeurs. Plus précisément, les tests comportementaux bien établis utilisent l’apprentissage associatif pour évaluer les changements cognitifs à la suite de diverses maladies et troubles induits par les déficiences⁴. De plus, l’inversion de la discrimination de contraste évalue les déficits cognitifs car elle implique des fonctions d’apprentissage et de mémoire d’ordre supérieur, et l’inversion dépend de l’inhibition d’une association précédemment apprise. La tâche de choix à trois chambres largement utilisée élucide les déficits possibles dans les voies d’apprentissage et de mémoire du système nerveux central^5,6. Récemment, ce domaine s’est élargi pour inclure des modèles non mammifères, tels que le poisson-zèbre (Danio rerio), car plusieurs paradigmes ont été développés pour une gamme d’âges allant des larves aux adultes^7,8.

Le poisson-zèbre offre un équilibre de complexité et de simplicité qui est avantageux pour l’évaluation des troubles cognitifs avec des techniques comportementales. Tout d’abord, les poissons-zèbres se prêtent à un dépistage comportemental à haut débit en raison de leur petite taille et de leur nature reproductrice prolifique. Deuxièmement, le poisson-zèbre possède une structure, le pallium latéral, qui est analogue à l’hippocampe des mammifères car il a des marqueurs neuronaux et des types de cellules similaires⁷. Les poissons-zèbres sont également capables d’acquérir et de mémoriser des informations spatiales⁹ et, comme les humains, sont diurnes¹⁰. Par conséquent, il n’est pas surprenant que les poissons-zèbres soient utilisés comme modèle pour les maladies neurodégénératives avec une fréquence croissante. Cependant, l’absence de tests comportementaux appropriés a rendu difficile l’application du modèle du poisson-zèbre pour les évaluations cognitives. Les travaux publiés utilisant des tests comportementaux spécifiques au poisson-zèbre comprennent les tâches d’apprentissage associatif¹¹, le comportement anxieux¹², la mémoire 13 , la reconnaissance d’objets¹⁴et la préférence de lieu conditionné^{15,16,17,18,19}. Bien qu’il y ait eu de nombreux développements en ce qui concerne les tests comportementaux du poisson-zèbre, des homologues pour certains tests des fonctions cognitives chez les rongeurs n’ont pas encore été développés pour une utilisation avec le poisson-zèbre¹⁸.

En nous appuyant sur des études antérieures de notre laboratoire, nous avons modélisé / développé une tâche cognitive chez le poisson-zèbre basée sur la tâche de choix à trois chambres utilisée avec les rongeurs en utilisant l’interaction sociale comme récompense. De plus, nous avons développé l’aspect d’apprentissage associatif de la tâche comportementale et incorporé l’inversion de la discrimination de contraste dans l’espoir de développer davantage cette tâche comportementale pour évaluer les troubles cognitifs. Cela nous a permis d’examiner à la fois l’acquisition initiale de l’apprentissage de la discrimination et l’inhibition ultérieure de cet apprentissage dans la phase d’inversion. Dans la présente étude, nous démontrons que cette procédure a fourni une méthode fiable pour évaluer le fonctionnement cognitif chez le poisson-zèbre après une immersion dans le glucose pendant 4 ou 8 semaines.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’American University (protocole # 1606, 19-02).

1. Animaux

1. Élevage et entretien des animaux
   1. Obtenez des poissons-zèbres adultes de type sauvage (Danio rerio) âgés de 4 à 11 mois en tant qu’embryons et élevez-les en interne.
   2. Maintenir le poisson dans un système de rack aquatique à une–29 °C sur une photopériode de 14 h de lumière:10 h d’obscurité.
   3. Nourrissez le poisson deux fois par jour avec des flocons commerciaux et complétez avec Artemiavivant.
   4. Choisissez des poissons au hasard dans ces réservoirs de stockage pour des expériences comportementales.
2. À la fin de l’expérience, anesthésier les animaux par immersion dans 0,02% de tricaïne pendant 2 min ou jusqu’à ce qu’il y ait un manque de coordination motrice et une fréquence respiratoire réduite pour des analyses moléculaires et / ou neurochimiques ultérieures.

2. Chambre d’essai de choix à trois chambres

NOTE: Cette technique comportementale a été modifiée à partir de Ruhl et al.²⁰.

1. Construction de la chambre
   1. Modifier la chambre comportementale²⁶— un aquarium de 40 L (50 x 30 x 30 cm^3)—pour avoir une chambre centrale ou de départ (10 x 30 x 30 cm^3),séparée de deux chambres de choix latérales (chacune 20 x 30 x 30 cm^3, Figure 1A).
   2. Construisez les trois compartiments à l’aide d’un canal en aluminium en forme de « U » fixé aux parois vitrées intérieures avec un scellant d’aquarium, pour séparer le réservoir en trois chambres.
   3. Construisez des séparateurs opaques, de 10 cm de haut, en feuille de PVC gris qui s’intègrent dans les canaux en aluminium de chaque côté. Faites chaque séparateur en 2 pièces, chacune de taille égale: une pièce inférieure fixe montée en permanence dans le réservoir et une pièce supérieure pouvant être rangée de haut en bas dans les rails en aluminium.
   4. Collez des clips de liant extra-larges sur le dessus des feuilles de PVC gris pour faire office de poignées.
   5. À l’aide d’un marqueur permanent, tracez de petites lignes horizontales à 10 cm au-dessus du tuyau en PVC gris collé à l’extérieur du réservoir.
      REMARQUE: Cette marque est le point auquel la feuille de PVC gris supérieure sera ouverte pour permettre l’accès de chaque côté.
   6. Ajouter de l’eau de contrôle (système) au réservoir à un niveau de 25 cm du bas vers le haut du réservoir, ou ~ 30 L. Placez des radiateurs d’aquarium en verre dans chaque section de la chambre pendant 24 h avant le test pour porter la température à 28,5 ° C.
      REMARQUE: Retirez les appareils de chauffage au début de la séance de comportement et effectuez un échange d’eau complet après deux jours d’utilisation.
2. Configuration de la discrimination
   1. Pour chaque tâche de discrimination, placez individuellement des morceaux de feutre colorés (beige, noir ou blanc) sur le dos extérieur, le côté et le bas des chambres de choix à l’aide de velcro(Figure 1B-D).
      REMARQUE: La chambre centrale ne doit pas avoir de couleur d’arrière-plan associée.
3. En récompense, créez un groupe de congénères (haut-fond) en plaçant 4 poissons-zèbres adultes, qui ne seront pas autrement utilisés dans l’étude, dans un petit réservoir clair dans le coin arrière de chaque chambre de choix(Figure 1B-D).
   REMARQUE: Choisissez des poissons de haut-fond au hasard dans les réservoirs de stockage chaque jour, avec au moins un mâle et une femelle du même âge et de la même taille que les poissons expérimentaux dans chaque aquarium de haut-fond.

3. Tâches comportementales

1. Acclimatation
   NOTE: L’acclimatation à la chambre de comportement consiste en trois jours de formation; deux jours d’acclimatation en groupe suivis d’une journée d’entraînement individuel.
2. Acclimatation en groupe
   1. Fixez le fond en feutre beige (neutre) à l’extérieur des deux compartiments de choix et immergez un réservoir de haut-fond vivant dans chacun des compartiments de choix(Figure 1B).
   2. Ajoutez cinq à six poissons-zèbres à la chambre de départ centrale avec les deux portes coulissantes ouvertes et laissez les poissons errer librement pendant 30 minutes.
      REMARQUE: Le poisson-zèbre expérimental devrait être en mesure d’interagir et de socialiser avec ces poissons de haut-fond à travers l’aquarium en récompense après avoir traversé l’un ou l’autre compartiment de choix pendant l’acclimatation. Un poisson est considéré comme faisant son entrée dans l’une des chambres latérales lorsque tout son corps pénètre dans la chambre.
   3. Répétez cette procédure avec le même poisson expérimental pour un deuxième jour (2 jours d’acclimatation en groupe).
      REMARQUE: Ne gardez pas les mêmes groupes de poissons.
3. Acclimatation individuelle
   1. Configuration de la chambre : Fixez le fond en feutre beige (neutre) à l’extérieur des deux compartiments de choix et immergez un réservoir de haut-fond vivant dans les deux compartiments de choix, comme dans l’acclimatation de groupe(Figure 1B, E).
      1. Placez un poisson-zèbre individuel dans la chambre de départ centrale pendant 2 minutes avec les portes coulissantes fermées et, après la période de 2 minutes, ouvrez les deux portes simultanément.
      2. Assurez-vous que chaque poisson nage de la chambre centrale à travers une porte pour un total de 10 fois, quel que soit le côté. Récompensez le poisson chaque fois qu’il entre dans l’une des chambres latérales (1 jour d’acclimatation individuelle).
         REMARQUE: Si un poisson est incapable d’accomplir cette tâche 10 fois dans une période de 30 minutes ou refuse de quitter la chambre de départ, excluez-le de l’étude.
   2. Acquisition de données : Enregistrez le nombre de fois que le poisson nage de chaque côté et le temps total qu’il faut pour terminer la tâche.
4. Acquisition
   REMARQUE: Après l’acclimatation, le poisson-zèbre a commencé une tâche d’acquisition de 3 jours.
   1. Configuration de la chambre : Fixez une pièce de feutre blanc à l’extérieur d’un compartiment de choix et une pièce de feutre noir à l’extérieur de l’autre compartiment de choix(Figure 1C,F).
      REMARQUE: Alternez la couleur d’arrière-plan de chaque côté tous les jours à l’aide d’un calendrier^{pseudo-aléatoire 37}.
      1. Pendant toute la durée de cette phase d’entraînement, placez un haut-fond-récompense placé uniquement dans l’un des compartiments de choix; cela devient le côté récompensé.
      2. Pour commencer l’acquisition, placez un seul poisson expérimental dans la chambre de départ pendant une période de 2 minutes avec les compartiments de choix fermés.
      3. Après l’acclimatation de 2 minutes, ouvrez simultanément les deux portes, donnant accès aux deux compartiments de choix, et démarrez le chronomètre pour évaluer la latence du choix.
      4. À l’aide d’une conception biaisée, attribuez au hasard au poisson une préférence en noir ou en blanc (c.-à-d. W+/B- ou B+/W-), ce qui signifie que le haut-fond est placé dans le compartiment de choix noir (B+) ou blanc (W+).
   2. Indiquant la réponse de choix
      1. Une fois que le poisson fait un choix en entrant dans l’un des compartiments latéraux, arrêtez la minuterie.
      2. Si le poisson choisit correctement le côté préféré, fermez immédiatement la porte entre la chambre centrale et ce côté pour limiter le poisson au côté préféré pendant 1 min, et laissez-le être récompensé en interagissant avec le réservoir de haut-fond(Figure 1C, F). Notez cet essai comme « C » pour « Correct » (récompensé).
      3. Si le poisson traverse la mauvaise porte, transférez-la dans la chambre centrale, fermez les deux portes et notez l’essai comme « I » pour « incorrect » (non récompensé).
      4. Si le poisson ne prend pas de décision dans les 2 minutes suivant l’ouverture des portes, déplacez le poisson du bon côté pendant 1 min et notez l’essai comme « M » pour « marqué » (récompense de force).
      5. Lorsque vous transférez /déplacez le poisson dans la chambre de départ, guidez doucement le poisson dans la chambre centrale à l’aide d’un filet à poisson comme outil de berger.
         REMARQUE: Ne retirez pas le poisson de l’eau et ne le remplacez pas dans la chambre de départ, car cela pourrait affecter le test comportemental.
      6. Une fois que le poisson retourne dans la chambre centrale, attendez 1 min avant d’effectuer à nouveau la tâche. Assurez-vous que chaque poisson effectue la tâche 8 fois.
   3. Acquisition de données
      1. Pour chaque poisson expérimental, enregistrez le temps jusqu’à la première décision (ou la latence de choix) et les scores individuels (C, I ou M) pour chacun des 8 essais d’acquisition (section 3.4.2) dans l’ordre.
      2. Rapportez que les résultats de ces expériences ont été rapportés sous forme de moyennes de groupe pour chaque essai à chaque jour d’acquisition.
      3. Une fois qu’un poisson a terminé un essai, classez-le comme un poisson « très performant » ou un poisson « peu performant ».
         REMARQUE: Un poisson était considéré comme « très performant » s’il choisissait avec succès le bon côté de l’aquarium dans au moins 6 des 8 essais totaux de la journée. Tout poisson qui ne répond pas à ce critère est un « peu performant ».
      4. Une fois identifiés, abritez séparément les poissons les plus performants et les poissons les moins performants.
      5. Classez le poisson comme étant « très performant » ou « faible » à chacun des trois jours suivant l’acquisition, après qu’un poisson a terminé les essais.
         REMARQUE : À la fin du troisième jour d’acquisition, les poissons demeurent « très performants » ou « faibles » pendant toute la durée de l’étude.
         REMARQUE: Certains poissons qui faisaient initialement partie du groupe « peu performant » apprennent la tâche le jour d’acquisition 2 ou 3. Lorsque cela se produit, le poisson initial « peu performant » peut être déplacé dans le groupe « très performant ». Ne déplacez pas le poisson entre les groupes de cette manière après le jour 3 (la fin de l’acquisition).

4. Traitement expérimental

1. Après la période d’acquisition, lorsque le poisson démontre sa capacité à résoudre une simple tâche de discrimination entre le fond noir et blanc, commencez le schéma thérapeutique du poisson-zèbre expérimental.
   NOTE: Pour montrer l’applicabilité de cette méthode, cette étude montre deux plans expérimentaux:
   1. Étude longitudinale
      1. Renvoyer les poissons expérimentaux dans leurs bassins de rétention pendant 8 semaines. Maintenez les poissons dans des réservoirs standard avec des changements d’eau quotidiens et nourrissez-les deux fois par jour.
         REMARQUE: N’effectuez aucune formation comportementale pendant ces 8 semaines dans les réservoirs de rétention.
      2. Effectuez une évaluation de l’inversion après cette période pour évaluer si le poisson-zèbre peut résoudre la tâche d’inversion après 8 semaines sans formation.
   2. Hyperglycémie: Exposer les groupes expérimentaux à l’eau (contrôle du stress de manipulation), au mannitol (1% à 3%, contrôle osmotique) ou au glucose (1% à 3%) pendant 4 ou 8 semaines^22,23.
      REMARQUE: N’effectuez aucun entraînement comportemental pendant ces 4 ou 8 semaines.

5. Inversion

REMARQUE: Après une manipulation expérimentale (comme à la section 4.2), les poissons sont testés dans la dernière partie du paradigme de choix à 3 chambres - l’inversion. Pour ce faire, le côté récompensé est inversé (par rapport à l’acquisition) de sorte que les poissons précédemment récompensés par un haut-fond sur le côté blanc sont maintenant récompensés par un haut-fond sur le côté noir et vice versa. De cette façon, l’inversion évalue si les poissons ont appris où se trouve la récompense (haut-fond), quelle que soit la couleur de l’arrière-plan.

1. Configuration de la chambre
   1. Attachez le feutre noir à l’extérieur de l’une des chambres de choix et le feutre blanc à l’extérieur de l’autre, en vous assurant que les côtés noir et blanc sont les mêmes que dans les essais d’acquisition (section 3.4).
   2. Immergez le réservoir de haut-fond dans le coin arrière du côté qui est à l’opposé de la chambre de choix précédemment récompensée(Figure 1D, G).
      REMARQUE: En d’autres termes, les poissons précédemment récompensés du côté blanc sont maintenant récompensés du côté noir et vice versa.
   3. Tester le poisson individuellement comme au point 3.5. Commencez par placer un seul poisson expérimental dans la chambre de départ pendant une période de 2 minutes et fermez l’accès aux compartiments de choix.
   4. Ouvrez simultanément les deux côtés de la chambre.
      REMARQUE : Effectuez un total de 8 essais chaque jour pendant trois jours de traitement consécutifs.
2. Indiquant la réponse de choix
   1. Si le poisson choisit correctement la couleur préférée, fermez immédiatement la porte de la chambre centrale pendant 1 min, ce qui permet au poisson d’interagir avec la récompense du haut-fond. Notez cet essai comme « C » pour « Correct » (récompensé).
   2. Si le poisson traverse la mauvaise porte, transférez-la dans la chambre centrale, fermez les deux portes et notez cet essai comme « I » pour « incorrect » (non récompensé).
   3. Si le poisson ne prend pas de décision dans les 2 minutes suivant l’ouverture des portes, déplacez le poisson du bon côté et notez l’essai comme « M » pour « marqué » (récompense de force).
3. Acquisition de données
   1. Pour chaque poisson-zèbre expérimental, enregistrez la latence de choix et les scores individuels (C, I, M), dans l’ordre, pour chaque essai.
   2. Rapportez les résultats de ces expériences en tant que moyennes de groupe pour chaque bloc de deux essais sur chacun des 3 jours d’inversion.
   3. Conservez les données des poissons à haut et à faible rendement séparément pour déterminer s’ils affichent le même niveau de performance lors de l’inversion que lors de l’acquisition.

Résultats

L’acclimatation à la chambre de comportement implique trois jours d’entraînement: 2 jours d’acclimatation en groupe suivis d'1 jour d’acclimatation individuelle. Cependant, comme nous ne pouvions pas distinguer les poissons-zèbres individuels les uns des autres, nous n’avons pu collecter des données que lors de l’acclimatation individuelle. À cette époque, les animaux de laboratoire (n = 30), conditionnés à l’aide d’une récompense basée sur le haut-fond, ont mis en moyenne 125,11 s pour parvenir...

Discussion

Bien qu’il y ait eu une croissance énorme de la quantité et de la variété de la recherche en neurosciences effectuée à l’aide de poissons-zèbres au cours des 15 dernières années^24,les tests comportementaux manquent chez cette espèce par rapport aux systèmes de modèles de mammifères^11,25,26. Ici, nous montrons qu’une tâche de choix à trois chambres développée pour une utilisation ave...

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