L'attività comportamentale di scelta a tre camere utilizzando Zebrafish come sistema modello

Riepilogo

Presentiamo una camera comportamentale progettata per valutare le prestazioni cognitive. Forniamo dati che dimostrano che una volta acquisiti, i pesci zebra ricordano l'attività 8 settimane dopo. Mostriamo anche che i pesci zebra iperglicemici hanno alterato le prestazioni cognitive, indicando che questo paradigma è applicabile agli studi che valutano la cognizione e la memoria.

Abstract

Le malattie neurodegenerative sono dipendenti dall'età, debilitanti e incurabili. Recenti rapporti hanno anche correlato l'iperglicemia con cambiamenti nella memoria e / o nel deterioramento cognitivo. Abbiamo modificato e sviluppato un compito cognitivo a scelta a tre camere simile a quello utilizzato con i roditori per l'uso con il pesce zebra iperglicemico. La camera di prova è composta da una camera di partenza posizionata centralmente e due scomparti scelti su entrambi i lati, con una secca di conspecifici utilizzati come ricompensa. Forniamo dati che dimostrano che una volta acquisiti, i pesci zebra ricordano l'attività almeno 8 settimane dopo. I nostri dati indicano che il pesce zebra risponde in modo robusto a questa ricompensa e abbiamo identificato deficit cognitivi nei pesci iperglicemici dopo 4 settimane di trattamento. Questo test comportamentale può anche essere applicabile ad altri studi relativi alla cognizione e alla memoria.

Introduzione

Le malattie neurodegenerative sono dipendenti dall'età, debilitanti e incurabili. Queste malattie stanno aumentando in prevalenza, con conseguente urgente necessità di migliorare e sviluppare nuove strategie terapeutiche. L'insorgenza e la presentazione di ogni malattia è unica, poiché alcune influenzano le regioni del cervello del linguaggio, motorie e autonome, mentre altre causano deficit di apprendimento e perdita di memoria¹. In particolare, i deficit cognitivi e / o la compromissione sono le complicanze più diffuse in tutte le malattie neurodegenerative². Nella speranza di far luce sui meccanismi sottostanti coinvolti in queste malattie neurodegenerative, è stato impiegato l'uso di molti diversi sistemi modello (compresi organismi unicellulari a Drosophila a vertebrati di ordine superiore come roditori e umani); tuttavia, la maggior parte delle malattie neurodegenerative rimane incurabile.

L'apprendimento e la memoria sono processi altamente conservati tra gli organismi poiché i cambiamenti costanti nell'ambiente richiedono l'adattamento³. La compromissione sia della cognizione che della plasticità sinaptica è stata dimostrata in diversi modelli di roditori. In particolare, saggi comportamentali consolidati utilizzano l'apprendimento associativo per valutare i cambiamenti cognitivi a seguito di varie malattie e disturbi indotti da compromissione⁴. Inoltre, l'inversione della discriminazione del contrasto valuta i deficit cognitivi perché coinvolge funzioni di apprendimento e memoria di ordine superiore e l'inversione dipende dall'inibizione di un'associazione precedentemente appresa. Il compito di scelta a tre camere ampiamente utilizzato chiarisce i possibili deficit nei percorsi di apprendimento e memoria del sistema nervoso centrale^5,6. Recentemente, questo campo si è ampliato per includere modelli non mammiferi, come il pesce zebra (Danio rerio), in quanto sono stati sviluppati diversi paradigmi per una gamma di età dalle larve agli adulti^7,8.

Zebrafish fornisce un equilibrio di complessità e semplicità che è vantaggioso per la valutazione dei deficit cognitivi con tecniche comportamentali. In primo luogo, i pesci zebra sono suscettibili di screening comportamentale ad alto rendimento date le loro piccole dimensioni e la prolifica natura riproduttiva. In secondo luogo, il pesce zebra possiede una struttura, il pallio laterale, che è analogo all'ippocampo dei mammiferi in quanto ha marcatori neuronali e tipi di cellule simili⁷. I pesci zebra sono anche in grado di acquisire e ricordare informazioni spaziali⁹ e, come gli umani, sono diurni¹⁰. Pertanto, non sorprende che i pesci zebra vengano utilizzati come modello per le malattie neurodegenerative con frequenza crescente. Tuttavia, l'assenza di test comportamentali appropriati ha reso difficile l'applicazione del modello zebrafish per le valutazioni cognitive. Il lavoro pubblicato utilizzando saggi comportamentali specifici per zebrafish include compiti di apprendimento associativo¹¹, comportamento ansioso¹², memoria¹³, riconoscimento degli oggetti¹⁴e preferenza del luogo condizionato^{15,16,17,18,19}. Sebbene ci siano stati molti sviluppi rispetto ai saggi comportamentali del pesce zebra, le controparti per alcuni test delle funzioni cognitive nei roditori devono ancora essere sviluppate per l'uso con zebrafish¹⁸.

Basandoci su studi precedenti del nostro laboratorio, abbiamo modellato / sviluppato un compito cognitivo nel pesce zebra basato sul compito di scelta a tre camere utilizzato con i roditori usando l'interazione sociale come ricompensa. Inoltre, abbiamo ampliato l'aspetto dell'apprendimento associativo del compito comportamentale e incorporato l'inversione della discriminazione del contrasto nella speranza di sviluppare ulteriormente questo compito comportamentale per valutare il deterioramento cognitivo. Questo ci ha permesso di esaminare sia l'acquisizione iniziale dell'apprendimento della discriminazione sia la successiva inibizione di tale apprendimento nella fase di inversione. Nel presente studio, dimostriamo che questa procedura ha fornito un metodo affidabile per valutare il funzionamento cognitivo nel pesce zebra dopo l'immersione in glucosio per 4 o 8 settimane.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'American University (protocollo # 1606, 19-02).

1. Animali

1. Allevamento e manutenzione degli animali
   1. Ottenere pesci zebra selvatici adulti (Danio rerio) di età compresa tra 4 e 11 mesi come embrioni e allevarli internamente.
   2. Mantenere il pesce in un sistema di rack acquatico a 28-29 °C su un fotoperiodo scuro di 14 ore di luce: 10 ore di buio.
   3. Nutrire il pesce due volte al giorno con fiocchi commerciali e integrare con Artemiaviva .
   4. Scegli il pesce in modo casuale da questi serbatoi di riserva per esperimenti comportamentali.
2. Al termine dell'esperimento, anestetizzare gli animali per immersione in tricaina allo 0,02% per 2 minuti o fino a quando non vi è una mancanza di coordinazione motoria e una ridotta frequenza respiratoria per successive analisi molecolari e / o neurochimiche.

2. Camera di prova a scelta a tre camere

NOTA: Questa tecnica comportamentale è stata modificata da Ruhl et al.²⁰.

1. Costruzione della camera
   1. Modificare la camera comportamentale²⁶— un acquario da 40 L (50 x 30 x 30 cm³) — per avere una camera centrale o di partenza (10 x 30 x 30 cm³), separata da due camere laterali a scelta (ciascuna 20 x 30 x 30 cm³, Figura 1A).
   2. Costruisci i tre scomparti utilizzando un canale in alluminio "a forma di U" fissato alle pareti di vetro interne con sigillante per acquari, per separare il serbatoio in tre camere.
   3. Costruisci divisori opachi, alti 10 cm, in lamiera di PVC grigio che si adatta ai canali di alluminio su entrambi i lati. Realizza ogni divisore da 2 pezzi, ciascuno di dimensioni uguali: un pezzo inferiore fisso montato permanentemente all'interno del serbatoio e un pezzo superiore mobile che si muove su e giù nei binari in alluminio.
   4. Incolla le clip leganti extra-large sulla parte superiore dei fogli di PVC grigio per fungere da maniglie.
   5. Utilizzando un pennarello permanente, disegnare piccole linee orizzontali 10 cm sopra il tubo in PVC grigio aderente all'esterno del serbatoio.
      NOTA: questo segno è il punto in cui verrà aperto il foglio di PVC grigio superiore per consentire l'accesso a entrambi i lati.
   6. Aggiungere acqua di controllo (sistema) al serbatoio a un livello di 25 cm dal basso verso l'alto del serbatoio, o ~ 30 L. Posizionare i riscaldatori per acquari in vetro in ogni sezione della camera per 24 ore prima del test per portare la temperatura a 28,5 °C.
      NOTA: rimuovere i riscaldatori all'inizio della sessione di comportamento ed eseguire uno scambio d'acqua completo dopo due giorni di utilizzo.
2. Configurazione della discriminazione
   1. Per ogni attività di discriminazione, posizionare individualmente i pezzi di feltro colorati (beige, nero o bianco) sul retro esterno, sul lato e sul fondo delle camere di scelta utilizzando Velcro (Figura 1B-D).
      NOTA: alla camera centrale non deve essere associato alcun colore di sfondo.
3. Come ricompensa, creare un gruppo di conspecifici (shoal) posizionando 4 pesci zebra adulti, che altrimenti non saranno utilizzati nello studio, in una piccola vasca chiara nell'angolo più lontano di ogni camera di scelta (Figura 1B-D).
   NOTA: Scegli il pesce branco in modo casuale dalle vasche di stoccaggio ogni giorno, con almeno un maschio e una femmina della stessa età e dimensione del pesce sperimentale in ogni vasca di branco.

3. Attività comportamentali

1. Acclimatazione
   NOTA: L'acclimatazione alla camera di comportamento consiste in tre giorni di allenamento; due giorni di acclimatazione di gruppo seguiti da un giorno di allenamento individuale.
2. Acclimatazione di gruppo
   1. Attaccare lo sfondo in feltro beige (neutro) all'esterno di entrambi i compartimenti scelti e immergere un serbatoio di banchi vivi in ciascuno dei compartimenti scelti (Figura 1B).
   2. Aggiungi cinque-sei pesci zebra alla camera di partenza centrale con entrambe le porte scorrevoli aperte e lascia che il pesce vaghi liberamente per 30 minuti.
      NOTA: Il pesce zebra sperimentale dovrebbe essere in grado di interagire e socializzare con questi pesci da branco attraverso l'acquario come ricompensa dopo aver attraversato in entrambi i compartimenti di scelta durante l'acclimatazione. Si ritiene che un pesce sia entrato in una delle camere laterali quando tutto il suo corpo entra nella camera.
   3. Ripetere questa procedura con lo stesso pesce sperimentale per un secondo giorno (2 giorni di acclimatazione di gruppo).
      NOTA: Non tenere gli stessi gruppi di pesci.
3. Acclimatazione individuale
   1. Configurazione della camera: fissare lo sfondo in feltro beige (neutro) all'esterno di entrambi i compartimenti scelti e immergere un serbatoio di banchi vivi in entrambi i compartimenti scelti, come nell'acclimatazione di gruppo (Figura 1B, E).
      1. Posizionare un singolo pesce zebra nella camera di partenza centrale per 2 minuti con le porte scorrevoli chiuse e, dopo il periodo di 2 minuti, aprire entrambe le porte contemporaneamente.
      2. Assicurati che ogni pesce nuoti dalla camera centrale attraverso una porta per un totale di 10 volte, indipendentemente da quale lato. Premia il pesce ogni volta che entra in una delle camere laterali (1 giorno di acclimatazione individuale).
         NOTA: se un pesce non è in grado di completare questo compito 10 volte entro un periodo di 30 minuti o si rifiuta di lasciare la camera di partenza, escluderlo dallo studio.
   2. Acquisizione dati: registra il numero di volte in cui il pesce nuota su entrambi i lati e il tempo totale necessario per completare l'attività.
4. Acquisizione
   NOTA: dopo l'acclimatazione, zebrafish ha iniziato un'attività di acquisizione di 3 giorni.
   1. Configurazione della camera: collegare un pezzo di feltro bianco all'esterno di un compartimento di scelta e un pezzo di feltro nero all'esterno dell'altro scomparto di scelta (Figura 1C, F).
      NOTA: alternare il colore di sfondo di ciascun lato ogni giorno utilizzando una pianificazione pseudocasuale³⁷.
      1. Per tutta la durata di questa fase di addestramento, posiziona una secca-ricompensa posizionata solo in uno dei compartimenti scelti; questo diventa il lato premiato.
      2. Per iniziare l'acquisizione, posizionare un singolo pesce sperimentale nella camera di partenza per un periodo di 2 minuti con i compartimenti scelti chiusi.
      3. Dopo l'acclimatazione di 2 minuti, apri contemporaneamente entrambe le porte, dando accesso a entrambi i compartimenti scelti, e avvia il cronometro per valutare la latenza di scelta.
      4. Utilizzando un design distorto, assegna in modo casuale al pesce una preferenza in bianco o nero (ad esempio, W + / B - o B + / W-), il che significa che la secca è posizionata nel compartimento di scelta nero (B +) o bianco (W +).
   2. Denotare la risposta della scelta
      1. Una volta che il pesce fa una scelta entrando in uno degli scomparti laterali, ferma il timer.
      2. Se il pesce sceglie correttamente il lato preferito, chiudere immediatamente la porta tra la camera centrale e quel lato per limitare il pesce al lato preferito per 1 minuto e consentirne la ricompensa interagendo con la vasca della secca (Figura 1C, F). Segna questa prova come "C" per "Corretto" (premiato).
      3. Se il pesce nuota attraverso la porta errata, trasferiscilo di nuovo nella camera centrale, chiudi entrambe le porte e segna la prova come "I" per "scorretto" (non ricompensato).
      4. Se il pesce non prende una decisione entro 2 minuti dall'apertura delle porte, sposta il pesce sul lato corretto per 1 minuto e segna la prova come "M" per "marcato" (ricompensato con la forza).
      5. Quando si trasferisce / sposta il pesce nella camera di partenza, guidare delicatamente il pesce nella camera centrale usando una rete da pesca come strumento di pastorizia.
         NOTA: non estrarre il pesce dall'acqua e sostituirlo nella camera di partenza in quanto ciò potrebbe influire sul test comportamentale.
      6. Una volta che il pesce ritorna nella camera centrale, attendere 1 minuto prima di eseguire nuovamente l'attività. Assicurati che ogni pesce esegua l'attività 8 volte.
   3. Acquisizione dati
      1. Per ogni pesce sperimentale, registrare il tempo alla prima decisione (o latenza di scelta) e i singoli punteggi (C, I o M) per ciascuno degli 8 studi di acquisizione (sezione 3.4.2) in ordine.
      2. Riportare i risultati di questi esperimenti sono stati riportati come medie di gruppo per ogni prova in ogni giorno di acquisizione.
      3. Una volta che un pesce ha completato una prova, classificalo come un pesce "ad alte prestazioni" o un pesce "a basse prestazioni".
         NOTA: Un pesce è stato considerato "ad alte prestazioni" se ha scelto con successo il lato corretto del serbatoio in almeno 6 delle 8 prove totali per il giorno. Qualsiasi pesce che non soddisfa questo criterio è un "basso esecutore".
      4. Una volta identificato, ospita separatamente pesci ad alte prestazioni e a basso rendimento.
      5. Classificare il pesce come "alto" o "basso" in ciascuno dei tre giorni di acquisizione, dopo che un pesce ha completato le prove.
         NOTA: Alla fine del terzo giorno di acquisizione, i pesci rimangono come performer "alti" o "bassi" per tutta la durata dello studio.
         NOTA: alcuni pesci che inizialmente erano nel gruppo "a basso rendimento" imparano il compito il giorno di acquisizione 2 o 3. Quando ciò accade, il pesce iniziale "a basse prestazioni" può essere spostato nel gruppo "ad alte prestazioni". Non spostare il pesce tra i gruppi in questo modo dopo il giorno 3 (la fine dell'acquisizione).

4. Trattamento sperimentale

1. Dopo il periodo di acquisizione, quando i pesci dimostrano la capacità di risolvere un semplice compito di discriminazione tra lo sfondo bianco e nero, iniziano il regime di trattamento per il pesce zebra sperimentale.
   NOTA: per mostrare l'applicabilità di questo metodo, questo studio mostra due progetti sperimentali:
   1. Studio longitudinale
      1. Restituire il pesce sperimentale ai loro serbatoi di detenzione per 8 settimane. Mantieni il pesce in vasche standard con cambi d'acqua giornalieri e nutrili due volte al giorno.
         NOTA: non condurre alcun allenamento comportamentale durante queste 8 settimane nei serbatoi di detenzione.
      2. Eseguire la valutazione dell'inversione dopo questo periodo per valutare se il pesce zebra può risolvere il compito di inversione dopo 8 settimane senza allenamento.
   2. Iperglicemia: Esporre i gruppi sperimentali all'acqua (controllo dello stress da manipolazione), mannitolo (1%-3%, controllo osmotico) o glucosio (1%-3%) per 4 o 8 settimane^22,23.
      NOTA: non condurre alcun allenamento comportamentale durante queste 4 o 8 settimane.

5. Inversione

NOTA: A seguito di manipolazione sperimentale (come nella sezione 4.2), i pesci vengono testati nella parte finale del paradigma di scelta a 3 camere: l'inversione. Per fare questo, il lato ricompensato è invertito (rispetto all'acquisizione) in modo tale che i pesci precedentemente premiati con un branco sul lato bianco sono ora ricompensati con un branco sul lato nero e viceversa. In questo modo, l'inversione valuta se i pesci hanno imparato dove si trova la ricompensa (secca), indipendentemente dal colore dello sfondo.

1. Configurazione della camera
   1. Attaccare il feltro nero all'esterno di una delle camere scelte e il feltro bianco all'esterno dell'altra, assicurandosi che i lati in bianco e nero siano gli stessi lati delle prove di acquisizione (sezione 3.4).
   2. Immergere il serbatoio della secca nell'angolo posteriore del lato che è l'opposto della camera di scelta precedentemente premiata (Figura 1D, G).
      NOTA: In altre parole, i pesci precedentemente premiati sul lato bianco sono ora premiati sul lato nero e viceversa.
   3. Testare il pesce singolarmente come al punto 3.5. Inizia posizionando un singolo pesce sperimentale nella camera di partenza per un periodo di 2 minuti e chiudi l'accesso ai compartimenti scelti.
   4. Aprire contemporaneamente entrambi i lati della camera.
      NOTA: Completare un totale di 8 prove al giorno per tre giorni consecutivi di trattamento.
2. Denotare la risposta della scelta
   1. Se il pesce sceglie correttamente il colore preferito, chiudere immediatamente la porta della camera centrale per 1 minuto, consentendo al pesce di interagire con la ricompensa della secca. Segna questa prova come "C" per "Corretto" (premiato).
   2. Se il pesce nuota attraverso la porta sbagliata, trasferiscilo di nuovo nella camera centrale, chiudi entrambe le porte e segna questa prova come "I" per "scorretto" (non ricompensato).
   3. Se il pesce non prende una decisione entro 2 minuti dall'apertura delle porte, sposta il pesce sul lato corretto e segna la prova come "M" per "marcato" (ricompensato con la forza).
3. Acquisizione dati
   1. Per ogni pesce zebra sperimentale, registrare la latenza di scelta e i singoli punteggi (C, I, M), in ordine, per ogni prova.
   2. Riporta i risultati di questi esperimenti come medie di gruppo per ogni blocco di due prove in ciascuno dei 3 giorni di inversione.
   3. Tenere separati i dati per i pesci ad alte e basse prestazioni per determinare se mostrano lo stesso livello di prestazioni durante l'inversione come durante l'acquisizione.

Risultati

L'acclimatazione alla camera comportamentale comporta tre giorni di allenamento: 2 giorni di acclimatazione di gruppo seguiti da 1 giorno di acclimatazione individuale. Tuttavia, poiché non siamo riusciti a distinguere i singoli pesci zebra l'uno dall'altro, siamo stati in grado di raccogliere dati solo durante l'acclimatazione individuale. A quel tempo, gli animali da esperimento (n = 30), condizionati usando una ricompensa basata sulla secca, impiegavano una media di 125,11 s per raggiungere la loro prima decisione (<...

Discussione

Sebbene ci sia stata un'enorme crescita della quantità e della varietà della ricerca neuroscientifica eseguita utilizzando il pesce zebra negli ultimi 15 anni^24,mancano saggi comportamentali in questa specie rispetto ai sistemi modello di mammiferi^11,25,26. Qui, mostriamo che un compito di scelta a tre camere sviluppato per l'uso con i roditori può essere adattato per valutare l'acquisizione e l'invers...

Materiali

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