Die Dreikammer-Wahl-Verhaltensaufgabe mit Zebrafisch als Modellsystem

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine Verhaltenskammer zur Beurteilung der kognitiven Leistung. Wir liefern Daten, die zeigen, dass sich Zebrafische nach dem Erwerb 8 Wochen später an die Aufgabe erinnern. Wir zeigen auch, dass hyperglykämische Zebrafische die kognitive Leistung verändert haben, was darauf hindeutet, dass dieses Paradigma auf Studien zur Beurteilung von Kognition und Gedächtnis anwendbar ist.

Zusammenfassung

Neurodegenerative Erkrankungen sind altersabhängig, schwächend und unheilbar. Jüngste Berichte haben auch Hyperglykämie mit Veränderungen des Gedächtnisses und / oder kognitiven Beeinträchtigungen korreliert. Wir haben eine kognitive Dreikammer-Wahlaufgabe modifiziert und entwickelt, die der bei Nagetieren für den Einsatz bei hyperglykämischen Zebrafischen ähnelt. Die Prüfkammer besteht aus einer zentral angeordneten Startkammer und zwei Wahlfächern auf beiden Seiten, wobei eine Untiefe von Artgenossen als Belohnung verwendet wird. Wir liefern Daten, die zeigen, dass sich Zebrafische nach dem Erwerb mindestens 8 Wochen später an die Aufgabe erinnern. Unsere Daten deuten darauf hin, dass Zebrafische robust auf diese Belohnung reagieren, und wir haben kognitive Defizite bei hyperglykämischen Fischen nach 4-wöchiger Behandlung identifiziert. Dieser Verhaltenstest kann auch auf andere Studien im Zusammenhang mit Kognition und Gedächtnis anwendbar sein.

Einleitung

Neurodegenerative Erkrankungen sind altersabhängig, schwächend und unheilbar. Diese Krankheiten nehmen an Prävalenz zu, was zu einem dringenden Bedarf an Verbesserungen und der Entwicklung neuer therapeutischer Strategien führt. Der Beginn und die Darstellung jeder Krankheit ist einzigartig, da einige sprachliche, motorische und autonome Gehirnregionen betreffen, während andere Lerndefizite und Gedächtnisverlust verursachen¹. Vor allem kognitive Defizite und/oder Beeinträchtigungen sind die häufigsten Komplikationen bei allen neurodegenerativen Erkrankungen². In der Hoffnung, Licht auf die zugrunde liegenden Mechanismen dieser neurodegenerativen Erkrankungen zu werfen, wurden viele verschiedene Modellsysteme (von einzelligen Organismen über Drosophila bis hin zu Wirbeltieren höherer Ordnung wie Nagetieren und Menschen) verwendet; die Mehrzahl der neurodegenerativen Erkrankungen bleibt jedoch unheilbar.

Lernen und Gedächtnis sind hochkonservierte Prozesse zwischen Organismen, da ständige Veränderungen der Umwelt eine Anpassung erfordern³. Eine Beeinträchtigung sowohl der Kognition als auch der synaptischen Plastizität wurde in mehreren Nagetiermodellen nachgewiesen. Insbesondere etablierte Verhaltenstests verwenden assoziatives Lernen, um kognitive Veränderungen nach verschiedenen Beeinträchtigungs-induzierten Krankheiten und Störungen zu beurteilen⁴. Darüber hinaus bewertet die Kontrastdiskriminierungsumkehr kognitive Defizite, da sie Lern- und Gedächtnisfunktionen höherer Ordnung beinhaltet und die Umkehrung von der Hemmung einer zuvor erlernten Assoziation abhängt. Die weit verbreitete Dreikammer-Wahlaufgabe klärt mögliche Defizite in Lern- und Gedächtnisbahnen des zentralen Nervensystems auf^5,6. In jüngster Zeit hat sich dieses Feld um Nicht-Säugetiermodelle wie Zebrafische (Danio rerio) erweitert, da mehrere Paradigmen für eine Reihe von Altersgruppen von Larven bis zu Erwachsenen^7,8entwickelt wurden .

Zebrafische bieten ein Gleichgewicht zwischen Komplexität und Einfachheit, das für die Beurteilung kognitiver Beeinträchtigungen mit Verhaltenstechniken von Vorteil ist. Erstens sind Zebrafische aufgrund ihrer geringen Größe und ihrer fruchtbaren fortpflanzungsfähigen Natur für ein Verhaltensscreening mit hohem Durchsatz anfällig. Zweitens besitzen Zebrafische eine Struktur, das laterale Pallium, das analog zum Hippocampus von Säugetieren ist, da es ähnliche neuronale Marker und Zelltypen^{hat 7}. Zebrafische sind auch in der Lage, räumliche Informationen zu erfassen und sich daran zu erinnern⁹ und sind wie Menschen tagaktiv¹⁰. Daher ist es nicht verwunderlich, dass Zebrafische immer häufiger als Modell für neurodegenerative Erkrankungen genutzt werden. Das Fehlen geeigneter Verhaltenstests hat es jedoch schwierig gemacht, das Zebrafischmodell für kognitive Bewertungen anzuwenden. Veröffentlichte Arbeiten mit Zebrafisch-spezifischen Verhaltenstests umfassen assoziative Lernaufgaben¹¹, Angstverhalten¹², Gedächtnis¹³, Objekterkennung¹⁴und Konditionierte-Ort-Präferenz^{15,16,17,18,19}. Obwohl es viele Entwicklungen in Bezug auf Zebrafisch-Verhaltenstests gegeben hat, müssen Gegenstücke für einige Tests kognitiver Funktionen bei Nagetieren noch für die Verwendung mit Zebrafischen entwickelt werden¹⁸.

Aufbauend auf früheren Studien aus unserem Labor haben wir eine kognitive Aufgabe bei Zebrafischen modelliert / entwickelt, basierend auf der Drei-Kammer-Wahlaufgabe, die mit Nagetieren verwendet wird, wobei soziale Interaktion als Belohnung verwendet wird. Darüber hinaus haben wir den assoziativen Lernaspekt der Verhaltensaufgabe erweitert und die Umkehrung der Kontrastdiskriminierung integriert, in der Hoffnung, diese Verhaltensaufgabe zur Beurteilung kognitiver Beeinträchtigungen weiterzuentwickeln. Dies ermöglichte es uns, sowohl den anfänglichen Erwerb von Diskriminierungslernen als auch die anschließende Hemmung dieses Lernens in der Umkehrphase zu untersuchen. In der aktuellen Studie zeigen wir, dass dieses Verfahren eine zuverlässige Methode zur Beurteilung der kognitiven Funktionen bei Zebrafischen nach 4 oder 8 Wochen Glukoseimmersion bietet.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der American University genehmigt (Protokoll # 1606, 19-02).

1. Tiere

1. Tierhaltung und -pflege
   1. Erhalten Sie erwachsene Wildtyp-Zebrafische (Danio rerio) im Alter von 4-11 Monaten als Embryonen und ziehen Sie sie im haus auf.
   2. Halten Sie die Fische in einem Aqua-Rack-System bei 28-29 °C auf einer 14-h hellen: 10-h dunklen Photoperiode.
   3. Füttern Sie die Fische zweimal täglich mit handelsüblichen Flocken und ergänzen Sie sie mit lebender Artemia.
   4. Wählen Sie Fische zufällig aus diesen Bestandstanks für Verhaltensexperimente.
2. Nach Abschluss des Experiments betäuben Sie die Tiere durch Eintauchen in 0,02% Tricain für 2 min oder bis es an motorischer Koordination und reduzierter Atmungsrate für spätere molekulare und / oder neurochemische Analysen mangelt.

2. Dreikammer-Wahlprüfkammer

HINWEIS: Diese Verhaltenstechnik wurde von Ruhl et al.²⁰modifiziert.

1. Kammerbau
   1. Ändern Sie die Verhaltenskammer²⁶– ein 40-L-Aquarium (50 x 30 x 30 cm³⁾– so, dass sie eine zentrale oder Startkammer (10 x 30 x 30 cm³⁾hat, die von zwei seitlichen Wahlkammern (jeweils 20 x 30 x 30 cm³⁾getrennt ist, Abbildung 1A).
   2. Konstruieren Sie die drei Fächer mit einem "U-förmigen" Aluminiumkanal, der mit Aquarienversiegelung an den inneren Glaswänden befestigt ist, um den Tank in drei Kammern zu trennen.
   3. Konstruieren Sie undurchsichtige Trennwände, 10 cm hoch, aus grauem PVC-Blech, die in die Aluminiumkanäle auf beiden Seiten passen. Machen Sie jeden Teiler aus 2 Teilen, die jeweils gleich groß sind: ein stationäres Bodenstück, das fest im Tank montiert ist, und ein bewegliches Oberteil, das sich in den Aluminiumschienen auf und ab bewegt.
   4. Kleben Sie extragroße Bindemittelclips auf die Oberseite der grauen PVC-Platten, um als Griffe zu fungieren.
   5. Zeichnen Sie mit einem permanenten Marker kleine horizontale Linien 10 cm über dem aufgeklebten grauen PVC-Rohr an der Außenseite des Tanks.
      HINWEIS: Diese Markierung ist der Punkt, an dem die obere graue PVC-Platte geöffnet wird, um den Zugang zu beiden Seiten zu ermöglichen.
   6. Fügen Sie dem Tank Steuerwasser (Systemwasser) auf einem Niveau von 25 cm von unten nach oben im Tank oder ~ 30 L hinzu. Stellen Sie Glasaquariumsheizungen vor dem Testen 24 Stunden lang in jeden Abschnitt der Kammer, um die Temperatur auf 28,5 ° C zu bringen.
      HINWEIS: Entfernen Sie die Heizungen zu Beginn der Verhaltenssitzung und führen Sie nach zwei Tagen Gebrauch einen vollständigen Wasseraustausch durch.
2. Diskriminierungs-Setup
   1. Platzieren Sie für jede Unterscheidungsaufgabe mit Velcro einzeln farbige Filzstücke (beige, schwarz oder weiß) auf der äußeren Rückseite, Seite und Unterseite der Auswahlkammern(Abbildung 1B–D).
      HINWEIS: Der zentralen Kammer sollte keine Hintergrundfarbe zugeordnet sein.
3. Als Belohnung erstellen Sie eine Gruppe von Artgenossen (Schwarm), indem Sie 4 erwachsene Zebrafische, die sonst nicht in der Studie verwendet werden, in einen kleinen, klaren Tank in der hinteren Ecke jeder Wahlkammer legen (Abbildung 1B-D).
   HINWEIS: Wählen Sie jeden Tag nach dem Zufallsprinzip Schwarmfische aus Bestandstanks, wobei mindestens ein Männchen und ein Weibchen das gleiche Alter und die gleiche Größe wie die Versuchsfische in jedem Schwarmbecken haben.

3. Verhaltensaufgaben

1. Akklimatisierung
   HINWEIS: Die Akklimatisierung an die Verhaltenskammer besteht aus drei Tagen Training; zwei Tage Gruppenakklimatisierung, gefolgt von einem Tag Einzeltraining.
2. Gruppenakklimatisierung
   1. Befestigen Sie den beigefarbenen (neutralen) Filzhintergrund an der Außenseite beider Wahlfächer und tauchen Sie in jedes der Wahlfächer einen lebenden Untiefentank ein (Abbildung 1B).
   2. Fügen Sie fünf bis sechs Zebrafische mit geöffneten Schiebetüren in die mittlere Startkammer ein und lassen Sie den Fisch 30 Minuten lang frei herumlaufen.
      HINWEIS: Der experimentelle Zebrafisch sollte in der Lage sein, mit diesen Schwarmfischen durch das Aquarium als Belohnung zu interagieren und Kontakte zu knüpfen, nachdem er während der Akklimatisierung in eines der beiden Wahlfächer eingedrungen ist. Es wird angenommen, dass ein Fisch eine der Seitenkammern betreten hat, wenn sein ganzer Körper in die Kammer eintritt.
   3. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit demselben Versuchsfisch für einen zweiten Tag (2 Tage Gruppenakklimatisierung).
      HINWEIS: Halten Sie nicht die gleichen Fischgruppen.
3. Individuelle Akklimatisierung
   1. Kammeraufbau: Befestigen Sie den beigefarbenen (neutralen) Filzhintergrund an der Außenseite beider Wahlfächer und tauchen Sie einen lebenden Untiefentank in beide Wahlfächer, wie bei der Gruppenakklimatisierung (Abbildung 1B, E).
      1. Legen Sie einen einzelnen Zebrafisch für 2 minuten mit geschlossenen Schiebetüren in die zentrale Startkammer und öffnen Sie nach 2 Minuten beide Türen gleichzeitig.
      2. Stellen Sie sicher, dass jeder Fisch insgesamt 10 Mal aus der zentralen Kammer durch eine Tür schwimmt, unabhängig von der Seite. Belohnen Sie den Fisch jedes Mal, wenn er eine der Seitenkammern betritt (1 Tag individuelle Akklimatisierung).
         HINWEIS: Wenn ein Fisch diese Aufgabe nicht 10 Mal innerhalb von 30 Minuten erledigen kann oder sich weigert, die Startkammer überhaupt zu verlassen, schließen Sie ihn von der Studie aus.
   2. Datenerfassung: Notieren Sie, wie oft der Fisch in beide Seiten schwimmt und wie lange es dauert, bis die Aufgabe abgeschlossen ist.
4. Erwerb
   HINWEIS: Nach der Akklimatisierung begann zebrafisch eine 3-tägige Akquisitionsaufgabe.
   1. Kammeraufbau: Befestigen Sie ein weißes Filzstück an der Außenseite eines Wahlfachs und ein schwarzes Filzstück an der Außenseite des anderen Wahlfachs (Abbildung 1C, F).
      HINWEIS: Wechseln Sie die Hintergrundfarbe jeder Seite täglich mit einem pseudozufälligen Zeitplan³⁷.
      1. Für die Dauer dieser Trainingsphase eine Schwarmbelohnung nur in einem der Wahlfächer platzieren; dies wird zur belohnten Seite.
      2. Um mit der Erfassung zu beginnen, legen Sie einen einzelnen Versuchsfisch für einen Zeitraum von 2 Minuten in die Startkammer, wobei die Auswahlfächer geschlossen sind.
      3. Öffnen Sie nach der 2-minütigen Akklimatisierung gleichzeitig beide Türen, um Zugang zu beiden Auswahlfächern zu erhalten, und starten Sie die Stoppuhr, um die Auswahllatenz zu beurteilen.
      4. Weisen Sie dem Fisch mit einem verzerrten Design nach dem Zufallsprinzip entweder eine schwarze oder weiße Präferenz zu (d. H. W + / B- oder B + / W-), was bedeutet, dass der Schwarm entweder im schwarzen (B +) oder weißen (W +) Wahlfach platziert wird.
   2. Kennzeichnen der Auswahlantwort
      1. Sobald der Fisch eine Wahl trifft, indem er eines der Seitenfächer betritt, stoppen Sie den Timer.
      2. Wenn der Fisch die bevorzugte Seite richtig wählt, schließen Sie sofort die Tür zwischen der zentralen Kammer und dieser Seite, um den Fisch für 1 Minute auf die bevorzugte Seite zu beschränken, und lassen Sie ihn durch Interaktion mit dem Untiefenbecken belohnen (Abbildung 1C, F). Bewerten Sie diese Studie mit "C" für "Richtig" (belohnt).
      3. Wenn der Fisch durch die falsche Tür schwimmt, transferieren Sie sie zurück in die zentrale Kammer, schließen Sie beide Türen und bewerten Sie den Versuch mit "I" für "falsch" (nicht belohnt).
      4. Wenn der Fisch nicht innerhalb von 2 Minuten nach dem Öffnen der Türen eine Entscheidung trifft, bewegen Sie den Fisch für 1 Minute auf die richtige Seite und bewerten Sie den Versuch mit "M" für "markiert" (kraftbelohnt).
      5. Wenn Sie Fische zurück in die Startkammer bringen/ bewegen, führen Sie die Fische vorsichtig in die zentrale Kammer mit einem Fischnetz als Hirtenwerkzeug.
         HINWEIS: Schöpfen Sie den Fisch nicht aus dem Wasser und ersetzen Sie ihn nicht in die Startkammer, da dies den Verhaltenstest beeinträchtigen könnte.
      6. Sobald der Fisch in die zentrale Kammer zurückkehrt, warten Sie 1 Minute, bevor Sie die Aufgabe erneut ausführen. Stellen Sie sicher, dass jeder Fisch die Aufgabe 8 Mal ausführt.
   3. Datenerfassung
      1. Notieren Sie für jeden Versuchsfisch die Zeit bis zur ersten Entscheidung (oder Wahllatenz) und die einzelnen Scores (C, I oder M) für jeden der 8 Akquisitionsversuche (Abschnitt 3.4.2) in der Reihenfolge.
      2. Berichten Sie, dass die Ergebnisse für diese Experimente als Gruppendurchschnitte für jede Studie an jedem Akquisitionstag gemeldet wurden.
      3. Sobald ein Fisch einen Versuch abgeschlossen hat, kategorisieren Sie ihn entweder als "hochleistungsfähigen" Fisch oder als "leistungsschwachen" Fisch.
         HINWEIS: Ein Fisch wurde als "leistungsstark" eingestuft, wenn er in mindestens 6 der insgesamt 8 Versuche für den Tag erfolgreich die richtige Seite des Tanks ausgewählt hat. Jeder Fisch, der dieses Kriterium nicht erfüllt, ist ein "Low Performer".
      4. Sobald sie identifiziert sind, beherbergen Sie leistungsstarke und leistungsschwache Fische separat.
      5. Kategorisieren Sie den Fisch an jedem der drei Tage der Akquisition als "high" oder "low" Performer, nachdem ein Fisch die Versuche abgeschlossen hat.
         HINWEIS: Am Ende des dritten Tages des Erwerbs bleiben Fische für die Dauer der Studie entweder als "hohe" oder "niedrige" Leistungen bestehen.
         HINWEIS: Einige Fische, die ursprünglich in der Gruppe "low performing" waren, lernen die Aufgabe am 2. oder 3. Erfassungstag. Wenn dies geschieht, kann der anfängliche "leistungsschwache" Fisch in die Gruppe "leistungsstark" verschoben werden. Bewegen Sie die Fische nach Tag 3 (dem Ende der Akquisition) nicht auf diese Weise zwischen den Gruppen.

4. Experimentelle Behandlung

1. Nach der Erwerbszeit, wenn die Fische die Fähigkeit demonstrieren, eine einfache Unterscheidungsaufgabe zwischen dem schwarzen und weißen Hintergrund zu lösen, beginnen Sie mit dem Behandlungsschema für den experimentellen Zebrafisch.
   HINWEIS: Um die Anwendbarkeit dieser Methode zu zeigen, zeigt diese Studie zwei experimentelle Designs:
   1. Längsschnittuntersuchung
      1. Bringen Sie die Versuchsfische für 8 Wochen in ihre Haltungsbecken zurück. Halten Sie die Fische in Standardtanks mit täglichem Wasserwechsel und füttern Sie sie zweimal täglich.
         HINWEIS: Führen Sie während dieser 8 Wochen in den Auffangbecken kein Verhaltenstraining durch.
      2. Führen Sie nach diesem Zeitraum eine Umkehrbewertung durch, um zu beurteilen, ob der Zebrafisch die Umkehraufgabe nach 8 Wochen ohne Training lösen kann.
   2. Hyperglykämie: Setzen Sie die experimentellen Gruppen 4 oder 8 Wochen lang Wasser (Umgang mit Stresskontrolle), Mannit (1%-3%, osmotische Kontrolle) oder Glukose (1% -3%)^{aus 22,23}.
      HINWEIS: Führen Sie während dieser 4 oder 8 Wochen kein Verhaltenstraining durch.

5. Umkehrung

HINWEIS: Nach experimenteller Manipulation (wie in Abschnitt 4.2) werden die Fische im letzten Teil des 3-Kammer-Wahlparadigmas getestet - Umkehrung. Dazu wird die belohnte Seite umgekehrt (im Vergleich zum Erwerb), so dass Fische, die zuvor mit einem Schwarm auf der weißen Seite belohnt wurden, nun mit einem Schwarm auf der schwarzen Seite belohnt werden und umgekehrt. Auf diese Weise beurteilt die Umkehrung, ob die Fische gelernt haben, wo sich die Belohnung (Schwarm) befindet, unabhängig von der Farbe des Hintergrunds.

1. Kammeraufbau
   1. Befestigen Sie schwarzen Filz an der Außenseite einer der Auswahlkammern und weißen Filz an der Außenseite der anderen, um sicherzustellen, dass die schwarzen und weißen Seiten die gleichen Seiten wie in den Akquisitionsversuchen sind (Abschnitt 3.4).
   2. Tauchen Sie den Untiefentank in die hintere Ecke der Seite, die das Gegenteil der zuvor belohnten Wahlkammer ist (Abbildung 1D, G).
      HINWEIS: Mit anderen Worten, Fische, die zuvor auf der weißen Seite belohnt wurden, werden jetzt auf der schwarzen Seite belohnt und umgekehrt.
   3. Testen Sie den Fisch einzeln gemäß Abschnitt 3.5. Beginnen Sie, indem Sie einen einzelnen Versuchsfisch für einen Zeitraum von 2 Minuten in die Startkammer legen und den Zugang zu den Auswahlfächern schließen.
   4. Öffnen Sie gleichzeitig beide Seiten der Kammer.
      HINWEIS: Führen Sie insgesamt 8 Studien pro Tag an drei aufeinanderfolgenden Behandlungstagen durch.
2. Kennzeichnen der Auswahlantwort
   1. Wenn der Fisch die bevorzugte Farbe richtig wählt, schließen Sie sofort die Tür zur zentralen Kammer für 1 Minute, damit der Fisch mit der Schwarmbelohnung interagieren kann. Bewerten Sie diese Studie mit "C" für "Richtig" (belohnt).
   2. Wenn der Fisch durch die falsche Tür schwimmt, bringen Sie ihn zurück in die zentrale Kammer, schließen Sie beide Türen und bewerten Sie diesen Versuch als "Ich" für "falsch" (nicht belohnt).
   3. Wenn der Fisch nicht innerhalb von 2 Minuten nach dem Öffnen der Türen eine Entscheidung trifft, bewegen Sie den Fisch auf die richtige Seite und bewerten Sie den Versuch mit "M" für "markiert" (kraftbelohnt).
3. Datenerfassung
   1. Notieren Sie für jeden experimentellen Zebrafisch die Auswahllatenz und die einzelnen Werte (C, I, M) in der Reihenfolge für jeden Versuch.
   2. Melden Sie die Ergebnisse für diese Experimente als Gruppendurchschnitte für jeden Zwei-Versuchsblock an jedem der 3 Umkehrtage.
   3. Halten Sie die Daten für Fische mit hoher und niedriger Leistung getrennt, um festzustellen, ob sie während der Umkehrung das gleiche Leistungsniveau aufweisen wie während der Erfassung.

Ergebnisse

Die Akklimatisierung an die Verhaltenskammer umfasst drei Tage Training: 2 Tage Gruppenakklimatisierung, gefolgt von 1 Tag individueller Akklimatisierung. Da wir einzelne Zebrafische jedoch nicht voneinander unterscheiden konnten, konnten wir nur während der individuellen Akklimatisierung Daten sammeln. Zu diesem Zeitpunkt brauchten Versuchstiere (n = 30), konditioniert mit einer schwarmbasierten Belohnung, durchschnittlich 125,11 s, um ihre erste Entscheidung zu treffen (Abbildung 2A) und ...

Diskussion

Obwohl die Menge und Vielfalt der neurowissenschaftlichen Forschung, die in den letzten 15 Jahren mit Zebrafischen durchgeführt wurde, enorm gewachsen ist^24,fehlen Verhaltenstests bei dieser Art im Vergleich zu Säugetiermodellsystemen^11,25,26. Hier zeigen wir, dass eine dreikammerige Auswahlaufgabe, die für den Einsatz mit Nagetieren entwickelt wurde, angepasst werden kann, um den Erwerb und die Umkehr...

Materialien

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