使用GAL4-UAS系统在冈比亚按蚊的功能遗传学中

摘要

二分GAL4-UAS系统是一种多功能工具，用于以受控的时空方式修饰基因表达，从而允许在 冈比亚按蚊中进行功能性遗传分析。使用该系统所描述的程序是半标准化的克隆策略，性别化和蛹荧光蛋白标志物的筛选以及胚胎固定。

摘要

二分GAL4-UAS系统是功能性遗传分析的多功能且功能强大的工具。该系统的本质是穿越以组织特异性方式表达酵母转录因子GAL4的转基因"驱动"系，转基因"响应者"系携带候选基因/RNA干扰构建体，其表达由结合GAL4的上游激活序列（UAS）控制。在随后的后代中，基因或沉默构建体因此以规定的时空方式表达，从而能够测定所得的表型并推断基因功能。二元系统使实验方法能够灵活地筛选由多种组织特异性模式的转基因表达产生的表型，即使引起严重的适应性成本。我们针对非洲主要疟疾病媒冈 比亚按蚊调整了这一系统。

在本文中，我们提供了GAL4-UAS分析期间使用的一些常用过程。我们描述了已经生成的 An. gambiae GAL4-UAS谱系，以及用于上调和RNAi敲低的新响应器结构的克隆。我们指定了蚊子蛹的分步指南，以建立遗传杂交，其中还包括筛选后代以跟踪标记驾驶员和响应者插入的荧光基因标记的遗传。我们还提出了一个清除 冈比亚锥胚胎 以研究胚胎发育的协议。最后，我们介绍了该方法的潜在适应性，通过CRISPR / Cas9插入靶基因下游的GAL4来产生驱动系。

引言

二分GAL4-UAS系统是昆虫模式生物果蝇^中基因功能表征的主力1^，2，3。为了使用GAL4-UAS系统，在调节序列的控制下表达酵母转录因子GAL4的转基因驱动系与携带目的基因或RNA干扰（RNAi）构建体的响应系交叉，该响应系由GAL4识别的上游激活序列（UAS）控制。该杂交的后代以由控制GAL4表达的启动子决定的时空模式表达感兴趣的转基因（图1）。可以评估驾驶员 - 响应者杂交后代显示的表型，以阐明候选基因的功能。虽然D. melanogaster已被用于检查来自其他生物的基因^{4，5，6，7}，但GAL4-UAS系统现已适应用于具有医学和农业重要性的昆虫，以提供对感兴趣的物种^{的直接分析8，9，10，}

研究方案

1. 无人机系统结构的设计和建造

1. 候选基因表达载体的设计和组装
   1. 确定用于候选基因上调的序列。
      1. 从感兴趣的菌株中对cDNA / gDNA进行测序，并将其与已发表的序列进行比较，以验证其身份并确定潜在的SNP和限制性位点，以进行诊断消化。
      2. 确保用于基因扩增的前向引物覆盖天然Kozak序列，并在适当的情况下启动密码子。起始密码子上游约10 bp结合的引物将包含Kozak序列。
      3. 在大多数情况下，在从反向引物扩增的片段中包括终止密码子。使用所描述的质粒载体中提供的3'终止序列，或从候选基因基因组序列中扩增。
      4. 如果需要，订购具有特定密码子偏倚的商业序列。
   2. 使用标准亚克隆程序将基因盒插入UAS质粒载体中，例如pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP]¹⁵（图1），用于上调和RNAi构建。
   3. 生产使用ΦC31重组介导的盒式交换产生的转基因蚊子^10，17，18

结果

eYFP，dsRed和eCFP的3xP3表达提供了可靠，易于区分的个体，这些个体具有在冈比亚蛹的眼睛和腹侧神经节中产生表达的标记基因（图3）。 图 4 突出显示了在用于的男性和女性外生殖器中观察到的差异形态以及无法识别的蛹的示例。从蛹中去除所有水分会增加性交难度，因为肛门桨模糊了生殖器的可视化（图4D，E<.......

讨论

了解蚊子的基因功能对于开发控制按蚊和影响疟疾传播的新方法至关重要。所描述的GAL4-UAS系统是一种多功能且功能强大的系统，用于候选基因的功能分析，迄今为止，我们已使用该系统来检查杀虫剂抗性¹⁷和角质层碳氢化合物生产的遗传基础^15，23，以及荧光标记不同的蚊子细胞群⁸.到目前为止，已经通过限制?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 x 15 mm plastic Petri dish	SLS	2175546	Pack of 10
1000 µL Gilson Pipette	Gilson	F144059P
20/25 mL Universal Tubes	Starlab	E1412-3020	Pack of 400
3 mL Pasteur Pipettes	SLS	G612398	Greiner Pasteur pipette 3 mL sterile individually wrapped
50 mL Falcon Tubes	Fisher Scientific	11512303
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	BP2818-500	500 mL
Acetic Acid	SLS	45726-1L-F	1 L
Cages	SLS	E6099	30x30x30 with screen port
Fine Paint Brushes	Amazon	UKDPB66	KOLAMOON 9 Pieces Detail Painting Brush Set Miniture Brushes for Watercolor, Acrylic Painting, Oil Painting (Wine Red)
Fish food	Amazon		Tetra Min Fish Food, Complete Food for All Tropical Fish for Health, Colour and Vitality, 10 L
Formaldehyde Solution	Sigma Aldrich	F8775
Mouth Aspirator	John Hock	612
Pond Salt	Amazon		Blagdon Guardian Pond Tonic Salt, for Fish Health, Water Quality, General Tonic, pH Buffer, 9.08 kg, treats 9,092 L
Pupae Pots	Cater4you	SP8OZ	250 pots with lids
Small Plastic Buckets	Amazon		2.5 L White Plastic Pail Complete with White Lid (Pack of 10)
Sodium Hypochlorite	Fisher Scientific	S25552