Uso del sistema GAL4-UAS para genética funcional en Anopheles gambiae

Resumen

El sistema bipartito GAL4-UAS es una herramienta versátil para la modificación de la expresión génica de forma espaciotemporal controlada que permite el análisis genético funcional en Anopheles gambiae. Los procedimientos descritos para el uso de este sistema son una estrategia de clonación semi-estandarizada, sexado y cribado de pupas para marcadores de proteínas fluorescentes y fijación embrionaria.

Resumen

El sistema bipartito GAL4-UAS es una herramienta versátil y potente para el análisis genético funcional. La esencia del sistema es cruzar líneas transgénicas "conductoras" que expresan el factor de transcripción de levadura GAL4 de una manera específica del tejido, con líneas transgénicas "respondedoras" que llevan una construcción candidata de interferencia de gen / ARN cuya expresión está controlada por secuencias de activación ascendentes (UAS) que se unen a GAL4. En la progenie subsiguiente, el gen o la construcción silenciadora se expresa de una manera espaciotemporal prescrita, lo que permite ensayar los fenotipos resultantes e inferir la función génica. El sistema binario permite flexibilidad en los enfoques experimentales para detectar fenotipos generados por la expresión transgénica en múltiples patrones específicos de tejidos, incluso si se inducen costos severos de aptitud física. Hemos adaptado este sistema para Anopheles gambiae, el principal vector de malaria en África.

En este artículo, proporcionamos algunos de los procedimientos comunes utilizados durante el análisis GAL4-UAS. Describimos las líneas GAL4-UAS de An. gambiae ya generadas, así como la clonación de nuevas construcciones de respuesta para la regulación ascendente y el derribo de ARNi. Especificamos una guía paso a paso para el sexado de pupas de mosquitos para establecer cruces genéticos, que también incluye la detección de la progenie para seguir la herencia de marcadores genéticos fluorescentes que etiquetan las inserciones del conductor y del respondedor. También presentamos un protocolo para la limpieza de embriones de An. gambiae para estudiar el desarrollo embrionario. Finalmente, introducimos posibles adaptaciones del método para generar líneas conductoras a través de la inserción CRISPR/Cas9 de GAL4 aguas abajo de los genes diana.

Introducción

El sistema bipartito GAL4-UAS es el caballo de batalla de la caracterización funcional de genes en el organismo modelo de insectos Drosophila melanogaster1,2,3. Para utilizar el sistema GAL4-UAS, las líneas conductoras transgénicas, que expresan el factor de transcripción de levadura GAL4 bajo control de una secuencia reguladora, se cruzan con líneas de respuesta que llevan un gen de interés o construcción de interferencia de ARN (RNAi) controlada por una secuencia de activación ascendente (UAS) reconocida por GAL4. La progenie de este cruce expresa el transgén de in....

Protocolo

1. Diseño y construcción de construcciones de UAS

1. Diseño y montaje de vectores para la expresión génica candidata
   1. Determinar la secuencia que se utilizará para la regulación ascendente de genes candidatos.
      1. Secuenciar el ADNc/ADNc a partir de la cepa de interés y compararlo con la secuencia publicada para verificar su identidad e identificar posibles SNP y sitios de restricción para la digestión diagnóstica.
      2. Asegúrese de que el cebador delantero utilizado para la amplificación de genes cubra la secuencia nativa de Kozak y el codón de inicio, cuando corresponda. Una imprimación con ~ 10 pb de unió....

Resultados

La expresión 3xP3 de eYFP, dsRed y eCFP proporciona una identificación confiable y fácilmente distinguible de individuos que poseen los genes marcadores que producen expresión en los ojos y los ganglios ventrales de las pupas de An. gambiae (Figura 3). La morfología diferencial observada en los genitales externos masculinos y femeninos utilizados para el sexado y un ejemplo de pupas no identificables se destacan en la Figura 4. La eliminac.......

Discusión

Comprender la función genética de los mosquitos es vital para desarrollar nuevos enfoques para controlar Anopheles e impactar la transmisión de la malaria. El sistema GAL4-UAS descrito es un sistema versátil y potente para el análisis funcional de genes candidatos y hasta la fecha hemos utilizado el sistema para examinar las bases genéticas de la resistencia a ^{insecticidas17} y la producción de hidrocarburos ^{cuticulares15,23}.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 x 15 mm plastic Petri dish	SLS	2175546	Pack of 10
1000 µL Gilson Pipette	Gilson	F144059P
20/25 mL Universal Tubes	Starlab	E1412-3020	Pack of 400
3 mL Pasteur Pipettes	SLS	G612398	Greiner Pasteur pipette 3 mL sterile individually wrapped
50 mL Falcon Tubes	Fisher Scientific	11512303
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	BP2818-500	500 mL
Acetic Acid	SLS	45726-1L-F	1 L
Cages	SLS	E6099	30x30x30 with screen port
Fine Paint Brushes	Amazon	UKDPB66	KOLAMOON 9 Pieces Detail Painting Brush Set Miniture Brushes for Watercolor, Acrylic Painting, Oil Painting (Wine Red)
Fish food	Amazon		Tetra Min Fish Food, Complete Food for All Tropical Fish for Health, Colour and Vitality, 10 L
Formaldehyde Solution	Sigma Aldrich	F8775
Mouth Aspirator	John Hock	612
Pond Salt	Amazon		Blagdon Guardian Pond Tonic Salt, for Fish Health, Water Quality, General Tonic, pH Buffer, 9.08 kg, treats 9,092 L
Pupae Pots	Cater4you	SP8OZ	250 pots with lids
Small Plastic Buckets	Amazon		2.5 L White Plastic Pail Complete with White Lid (Pack of 10)
Sodium Hypochlorite	Fisher Scientific	S25552