Usando o sistema GAL4-UAS para genética funcional em Anopheles gambiae

Resumo

O sistema bipartite GAL4-UAS é uma ferramenta versátil para modificação da expressão genética de forma espástica controlada que permite a análise genética funcional em Anopheles gambiae. Os procedimentos descritos para o uso deste sistema são uma estratégia de clonagem semi-padronizada, sexagem e triagem de pupas para marcadores de proteína fluorescente e fixação de embriões.

Resumo

O sistema bipartite GAL4-UAS é uma ferramenta versátil e poderosa para análise genética funcional. A essência do sistema é cruzar linhas transgênicas de "driver" que expressam o fator de transcrição de leveduras GAL4 de forma específica do tecido, com linhas transgênicas de "responder" carregando uma construção de interferência genética/RNA candidata cuja expressão é controlada por Sequências de Ativação Upstream (UAS) que ligam GAL4. Na prole resultante, o gene ou a construção silenciante é, portanto, expressa de forma espesso prescrita, permitindo que os fenótipos resultantes sejam avaliados e a função genética inferida. O sistema binário permite flexibilidade em abordagens experimentais para tela fenótipos gerados pela expressão transgênica em múltiplos padrões específicos do tecido, mesmo que os custos severos de aptidão sejam induzidos. Adaptamos este sistema para Anopheles gambiae, o principal vetor de malária na África.

Neste artigo, fornecemos alguns dos procedimentos comuns utilizados durante a análise GAL4-UAS. Descrevemos as linhas An. gambiae GAL4-UAS já geradas, bem como a clonagem de novas construções de respondente para a regulação e o knockdown rnai. Especificamos um guia passo a passo para o sexing de pupas de mosquito para estabelecer cruzes genéticas, que também inclui a prole de triagem para seguir a herança de marcadores genéticos fluorescentes que marcam as inserções do motorista e do respondente. Também apresentamos um protocolo para limpar embriões de An. gambiae para estudar o desenvolvimento embrionário. Finalmente, introduzimos possíveis adaptações do método para gerar linhas de driver através da inserção CRISPR/Cas9 de genes alvo.

Introdução

O sistema bipartite GAL4-UAS é o cavalo de trabalho da caracterização funcional de genes no organismo modelo de insetos Drosophila melanogaster1,2,3. Para usar o sistema GAL4-UAS, as linhas de driver transgênicas, expressando o fator de transcrição da levedura GAL4 sob controle de uma sequência regulatória, são cruzadas com linhas de resposta carregando um gene de interesse ou interferência de RNA (RNAi) construída controlada por uma Sequência de Ativação Upstream (UAS) reconhecida pela GAL4. A descendência dessa cruz expressa o transgene de interesse em um padrão espítetempo ditado pelo promotor que controla a expressão GAL4 (Figura 1). Fenótipos exibidos por descendentes de cruzes de respondente condutor podem ser avaliados para elucidar a função dos genes candidatos. Embora d. melanogaster tenha sido usado para examinar genes de outros organismos4,5,6,7, o sistema GAL4-UAS foi agora adaptado para uso em insetos de importância médica e agrícola para fornecer análise direta nas espécies de interesse 8,9,10,11,12,13,14.

No mosquito africano da malária, Anopheles gambiae, o sistema GAL4-UAS foi testado pela primeira vez pela co-transfecção da linha ^celular9. Construções múltiplas foram avaliadas para eficiência em diferentes combinações de pairwise e descobriram que 14 UAS repetidas com um pequeno intron artificial (UAS-14i) exibiam a maior gama de potencial de ativação quando usado com um painel de drivers GAL4. Para demonstrar a funcionalidade in vivo, essas construções foram então usadas para criar duas linhas transgênicas de An. gambiae separadas pela Transformação ^PiggyBac8: uma linha de driver que transporta GAL4 conduzida por um promotor específico midgut, e uma linha de resposta contendo tanto a luciferase quanto os genes de proteína fluorescente amarela aprimorada (eYFP) sob regulação das sequências UAS. A atividade de luciferase específica intestinal e a fluorescência na prole indicaram que o sistema era eficiente em Anopheles. Desde então, foram criadas linhas de condutores expressando transgenes em outros tecidos importantes para a capacidade vetorial e resistência a inseticidas, incluindo oenocitos15 e hemócitos16, e em um padrão próximo ao ^{onipresente10}. Numerosas linhas de UAS também foram geradas para avaliar genes considerados envolvidos no metabolismo e sequestração mediada resistência a inseticidas, síntese de hidrocarbonetos cuticulares e para marcar fluorescente diferentes tipos de células e tecidos (Tabela 1). Para as linhas de resposta, a integração direcionada ao local do transgene é agora realizada pelo ΦC31 catalisado troca de ^cassete17,18 para corrigir o contexto genômico dos genes regulados pela UAS. Dessa forma, a expressão transgênica é normalizada em relação à localização de inserção genômica, permitindo uma comparação mais precisa dos efeitos fenotípicos de diferentes genes candidatos.

As linhas de respondente criadas até o momento são projetadas para expressar o transgene em níveis elevados ou reduzir a expressão genética através da interferência de RNA (RNAi). Normalmente, os clones cDNA são fundidos à sequência UAS para gerar plasmídeos de expressão adequados, porém sequências genômicas completas também são viáveis assumindo que eles não são muito grandes para clonagem. Para gerar construções de silenciamento, utilizamos três métodos diferentes para obter sequências invertidas tandem adequadas que formam o dsRNA que estimula o RNAi. Estes incluíram PCR de fusão, PCR assimétrico e síntese comercial de construções de grampos de cabelo. Comum a cada método é a inclusão de uma sequência intron entre as sequências invertidas para fornecer estabilidade de clonagem. Plasmids de resposta nos quais um gene de interesse/construção RNAi pode ser inserido foram ^{desenvolvidos15}. Esses plasmídeos também carregam os locais de attB ΦC31 necessários para rmce (descrito em Adolfi acompanhando o artigo jove que descreve a técnica RCME em detalhes). Protocolos que abrangem as etapas importantes necessárias ao selecionar a sequência para inserção em um desses plasmídeos para superexpressão estão incluídos neste manuscrito. Além disso, dois protocolos para criação de construção de grampos rnai são descritos e ilustrados.

Ao criar novas linhas, a identificação de indivíduos transgênicos raros é crucial para procriar para estabelecer e manter colônias transgênicas. Mais importante para o sistema GAL4-UAS, é necessário distinguir as linhas de respondente e motorista para estabelecer cruzes e identificar descendentes individuais que carregam ambos transgenes. Isso é conseguido usando diferentes genes de marcadores selecionáveis dominantes ligados às fitas do motorista e do respondente. Mais comumente estes são genes marcadores fluorescentes que são claramente distinguíveis usando filtros ópticos (por exemplo, eYFP, eCFP, dsRed). É importante que os marcadores sejam expressos em um padrão espíte conhecido e confiável, pois isso facilita a identificação de anormalidades e contaminação. A expressão genética do marcador fluorescente é rotineiramente regulada pelo promotor 3xP3 sintético, que causa expressão específica de gânglios oculares e ventral em todas as etapas do desenvolvimento de An. gambiae19. Marcadores fluorescentes controlados por 3xP3 estão incluídos em todos os plasmídeos de transformação descritos neste artigo. Um protocolo detalhando os métodos comuns usados para tela fluorescente Uma. gambiae pupae GAL4-UAS está incluído aqui.

Um dos elementos-chave do sistema GAL4-UAS é a necessidade de cruzar as linhas de driver e responder marcadas diferencialmente. Para fazer este macho e fêmeas de cada linha deve ser separado antes do acasalamento. Os adultos são facilmente distinguíveis pela visão, no entanto, para estabelecer cruzes genéticas é sensato separar os sexos antes do surgimento de adultos para garantir que o acasalamento não tenha ocorrido. A diferença geral de tamanho entre macho e fêmea An. gambiae pupae é muito variável para ser um método eficiente e confiável de determinação ^sexual20. Em vez disso, diferenças morfológicas claras na genitália externa fornecem uma base confiável para o sexing em An. gambiae. Neste artigo, descrevemos um método confiável para sexar An. gambiae pupae para configurar cruzes apropriadas.

Figura 1 - Representação diagramática do processo para o uso do sistema bipartite GAL4-UAS em Anopheles gambiae. (A) Os principais componentes de um vetor de exemplo (pSL-attB-UAS14-gyp[3xp3-eYFP]) são retratados, detalhando os locais de restrição disponíveis (EcoRI, NheI, XhoI e NcoI) dentro dos múltiplos locais de clonagem que são adequados para uso para inserir a construção de grampos ou sequência de codificação para o interesse genético. A estrutura da linha de acoplamento também é retratada. (B) A etapa de travessia é ilustrada indicando o uso de machos da linha de motorista (transportando condutor gal4 por um promotor de interesse e eCFP conduzido pelo promotor 3xP3) e fêmeas da linha de resposta (carregando o gene de interesse ou construção de grampos controlado por um promotor da UAS e um marcador eYFP controlado pelo promotor 3xP3). (C) Uma representação diagramática da expressão de condução GAL4 do gene de interesse na prole da cruz em B e uma lista de alguns dos fenótipos típicos que são avaliados. Abreviaturas: Multiple Cloning Site (MCS), Recombinase mediated cassette exchange (RMCE), Upstream Activator Sequence (UAS), proteína fluorescente amarela aprimorada (eYFP), proteína fluorescente ciano aprimorada (eCFP). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

É o uso de cruzes que fornece a natureza bipartite do sistema GAL4-UAS, que tem vantagens distintas sobre abordagens mais lineares. Por exemplo, muitas mais combinações de linhas de driver e respondente podem ser avaliadas do que seria viável se uma nova linha transgênica tivesse que ser gerada e mantida para cada combinação promotor/gene. Mais importante, permite a análise de genes que produzem fenótipos letais ou estéreis quando sua expressão é perturbada, que são difíceis de criar/manter em um sistema linear. Tais fenótipos letais podem se manifestar em todos os estágios de desenvolvimento, dependendo da função genética e expressão espacial, mas são mais frequentemente observados durante o desenvolvimento embrionário. Visualizar o desenvolvimento de embriões de mosquitos requer a limpeza da chorão opaca que reveste os ovos. Seguindo os métodos descritos em Trpiš (1970)²¹ e Kaiser et al. (2014)²², descrevemos os protocolos que usamos para corrigir embriões, mantendo a integridade estrutural e o branqueamento para limpar a endochorion que permite visualização e imagem microscópicas.

Protocolo

1. Projeto e construção de construções da UAS

1. Projeto e montagem de vetores para expressão genética do candidato
   1. Determine a sequência a ser usada para a regulação genética do candidato.
      1. Sequencifique o cDNA/gDNA da tensão de interesse e compare-o com a sequência publicada para verificar sua identidade e identificar possíveis SNPs e locais de restrição para digestão diagnóstica.
      2. Certifique-se de que o primer dianteiro usado para amplificação genética cobre a sequência nativa de Kozak e iniciar o códon, quando apropriado. Um primer com ~10 bp ligando upstream do códon inicial englobará a sequência Kozak.
      3. Inclua o códon de parada no fragmento amplificado a partir do primer reverso na maioria das circunstâncias. Use sequências de terminação de 3' fornecidas nos vetores plasmídeos descritos ou amplie a partir de sequências genômicas genéticas do candidato.
      4. Ordene sequências comerciais com viés específico de codon, se desejar.
   2. Use procedimentos de subcloamento padrão para inserir genéticos em vetores plasmídeos da UAS, por exemplo, pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP]¹⁵ (Figura 1) tanto para a regulação quanto para construções RNAi.
   3. Produzir mosquitos transgênicos criados usando o câmbio mediado de recombinação ΦC31110,17,18,23.
2. Criação de construções de grampos RNAi: amplificação de etapa única utilizando ^PCR15,24 assimétrica
   1. Extrair DNA genômico (gDNA) da fêmea adulta An. gambiae carregando o gene candidato desejado usando o método ^Livak25.
      1. Projete o primer para a frente para ligar ao exon alvo aos 5' do fragmento desejado direcionado para o intron vizinho. Projete a extremidade de 3' de uma primer de ponte para ligar ao final do exon anterior para amplificar o intron. O final de 5' é complementar a um pequeno fragmento do exon alvo imediatamente após o intron.
   2. Execute uma reação assimétrica de PCR como está descrito em Xiao (2006)²⁴ (Figura 2).
   3. Clone o produto PCR purificado em um vetor adequado que carrega o promotor da UAS (por exemplo, pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP]¹⁵).
      NOTA: Enzimas dentro do local de clonagem múltipla que são apropriadas para pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP] ^clonagem15 e os próximos passos necessários estão indicados na Figura 1. O digestor de enzima única é essencial, pois apenas um local de restrição é adicionado. A desfosforilação do plasmídeo melhorará a eficiência da clonagem.
3. Construção de construções de grampos RNAi: Fusion PCR de cDNA e gDNA15
   1. Extrair DNA genômico (gDNA) da fêmea adulta An. gambiae carregando o gene candidato desejado usando o método ^Livak25.
      1. Inclua gDNA em uma reação pcr para amplificar a área alvo das sequências exon e intron juntos (Figura 2).
      2. Projete a extremidade de 3' do primer dianteiro para vincular à sequência de exon de alvo reverso para amplificar em direção à sequência intron alvo e o final de 5' para carregar um local de restrição para facilitar a clonagem.
      3. O primer reverso de design (1) para ligar ao final de 5' do intron e a saliência final de 5' carrega as primeiras bases da sequência dianteira do exon vizinho. Esta saliência é usada na fusão PCR.
      4. Purifique o produto de reação desejado.
   2. Extrair RNA, remover DNA usando DNase e preparar cDNA de fêmea adulta An. gambiae carregando o gene candidato desejado seguindo os protocolos do fabricante.
   3. Use cDNA em uma reação pcr para amplificar a área alvo apenas do exon (Figura 2).
      1. Projete primer para a frente (2) para que a extremidade de 3' se ligue no final de 3' da sequência de exon alvo complementar e a extremidade de 5' do primer carrega um local de restrição para uso na clonagem.
         NOTA: O primer dianteiro de 1.3.1.2 pode ser usado novamente nesta segunda reação. No entanto, isso significará que um único digestor enzimádido é essencial. O uso de um segundo primer para a frente com um local de restrição diferente permitirá uma digestão dupla, o que pode aumentar a eficiência da clonagem.
      2. Projeto primer reverso (2) - a extremidade de 3' se liga ao final de 5' do exon vizinho amplificando o exon alvo. A extremidade de 5' se liga ao final de 3' da vertente introns para a frente. Esta saliência é usada na fusão PCR.
      3. Purifique o produto de reação desejado.
   4. Inclua os produtos da etapa 1.3.1 e 1.3.2 como modelos para uma reação de FUSÃO PCR usando concentrações padrão com primers Forward 1 e 2. Purificar o produto desejado.
   5. Digerir o produto purificado para gerar as saliências para clonagem. Clone em um vetor adequado a jusante do promotor da UAS. Enzimas apropriadas para pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP] ^clonagem15 e os próximos passos necessários estão indicados na Figura 1.

Figura 2 - Representação diagramática da criação de construtos RNAi para inserção em pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP] por dois métodos: (A) PcR assimétrico de passo único (adaptado de Xiao. Y H et al (2006) e (B) fusão de múltiplos passos PCR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. An. gambiae pupae screening

1. Coleção de pupas para caracterização microscópica
   NOTA: Ao longo desses protocolos, a água refere-se à água destilada suplementada com 0,01% de sal da lagoa.
   1. Áris de árdoos mosquitos usando protocolos padrão (por exemplo, MR426) para estágio pupal.
      ATENÇÃO: Tome cuidado para não ferir pupas durante todo esse processo.
   2. Colete pupas em uma placa plana clara adequada para uso com um estereomicroscope (por exemplo, uma placa de Petri de plástico de 100 x 15 mm, evitando as bordas).
      NOTA: Para coletar pupas, usamos uma pipeta Pasteur de plástico de 3 mL com cerca de 10 mm cortadas da extremidade para ampliar a extremidade e evitar lesões aos mosquitos. A triagem e o sexing podem ser concluídos em indivíduos, no entanto, isso é muito lento. Recomenda-se realizar triagem e sexagem em grupos de 50-200 pupas (o tamanho do grupo possível é limitado pelo tamanho do prato utilizado e está sujeito à preferência pessoal). Se um grande número estiver sendo rastreado, a eficiência pode ser aumentada alinhando primeiro pupas de 4 a 5 profundas em linhas, e movendo o alvo pupae para fora desta linha.
   3. Usando uma pipeta Pasteur, remova cuidadosamente quase toda a água ao redor da pupa. Deixe água suficiente ao redor de pupas para que eles sejam efetivamente immotile, mas podem ser movidos facilmente com uma escova fina. Se eles se tornam difíceis de mover, então adicione mais água.
      NOTA: Quando a água suficiente é removida, a pupae deita-se ao seu lado, permitindo a visualização dos olhos para detecção de fluorescência e identificação de genitálias dimórficas (Figura 4DE).
      ATENÇÃO: Certifique-se de que a pupae não desfilcate. Se apenas um volume muito pequeno de água for deixado, ele pode reduzir ainda mais com o calor da lâmpada do microscópio e quando dividido entre piscinas de pupas. Água adicional às vezes deve ser adicionada durante o processo usando uma pipeta Pasteur de 3 mL para o grupo desejado(s).
2. Identificação de marcadores fluorescentes em pupas
   NOTA: O uso de um estereoscópio de baixa ampliação permite uma triagem de campo amplo, a classificação pode ser feita em um microscópio composto invertido, mas tem que ser feita individualmente.
   1. Ao procurar um marcador fluorescente é primeiro crucial conhecer os padrões esperados de expressão e herança. Considere o seguinte:
      1. Cor(s): determinar qual filtro(s) visualizar a expressão.
      2. Padrão de expressão espacial: Entenda onde e em que estágio da vida você espera ver a expressão.
      3. Razão de diferentes fenótipos: estabelecer qual percentual da população deve carregar os marcadores de interesse.
   2. Realizar triagem fluorescente na escuridão, pois mesmo a baixa luz pode interferir na resolução da fluorescência. No entanto, use uma lâmpada ao lado do estereoscópio quando a luz for necessária para outras manipulações.
      ATENÇÃO: Certifique-se de que o espaço de trabalho ao redor do estereoscópio fluorescente esteja limpo antes de desligar as luzes.
   3. Ligue a lâmpada fluorescente e deixe aquecer para o período recomendado pelo fabricante (Normalmente 10-15 min). Selecione o filtro necessário no estereóscópio fluorescente e verifique se há um feixe de luz colorido visível que é direcionado para o centro da placa de palco. Se isso não for visível ou for muito fraco, a lâmpada fluorescente pode não ter aquecido totalmente, o obturador está fechado ou a óptica do microscópio não está bem alinhada.
   4. Usando luz branca, centralize a pupa no campo de visão e leve-as ao foco. Esta ampliação pode precisar ser alterada ao alternar entre diferentes filtros, dependendo da intensidade da fluorescência.
   5. O uso de um pincel de detalhamento fino garante que a pupa examinada não se sobreponha.
   6. Desligue a luz branca do estereóscópio e use o foco fino para colocar a área da pupae carregando o fenótipo de interesse em foco. O padrão fluorescente deve ser visível. Exemplos de fluorescência controlada pelo promotor 3xP3 são fornecidos na Figura 3.
      1. Use a menor ampliação na qual o fenótipo fluorescente esperado pode ser distinguido de forma confiável de indivíduos sem fluoresceno.
      2. Para cepas com fluorescência brilhante use uma luz de campo brilhante de baixa intensidade também durante a triagem, se o sinal fluorescente ainda estiver claramente identificável.
      3. Quando concluído a triagem primária, escaneie rapidamente populações sob outros filtros para detectar contaminação potencial.
         ATENÇÃO: Certifique-se de que há uma distância clara entre os grupos de pupas classificadas para evitar a contaminação pelo movimento pupa. Esteja ciente de que o tamanho dos grupos mudará à medida que as pupas são sexadas e que as distâncias podem parecer maiores quando se olha sob ampliação. Tome cuidado especial quando as piscinas não estiverem dentro do campo de visão.

Figura 3 - Anopheles gambiae pupae expressando marcadores fluorescentes impulsionados pelo promotor 3xP3 (A) eYFP, (B) dsRed e (C) eCFP. Ampliação: A=16X, B,C=20X.

3. Sexing Pupae
   1. Colete pupae. Remova o excesso de água, mas forneça o suficiente para que as pás anais se partam ligeiramente da genitália para auxiliar na visualização e caracterização morfológica (Figura 4D,E).
   2. Se alguma pupa/e não estiver do seu lado, use um pincel de pintura de detalhamento fino para girar suavemente a pupa e mover as pás anais para que a genitália externa possa ser identificada.
   3. Pupas separadas à base de genitália externa distinta; os machos têm um tubo longo que extrudes do segmento dorsal final aproximadamente metade do comprimento das pás anais (Figura 4B). Os genitais externos da pupa fêmea são consideravelmente mais curtos e bifurcados (Figura 4A).
      NOTA: Na ocasião, se o ^4º exoesqueleto larval instar permanecer ligado ou a genitália externa estiver danificada (Figura 4C), a identificação confiante do sexo é mais difícil. Quando o sexo de uma pupa não é claro, é melhor descartá-lo. Se o indivíduo deve ser mantido, a pupa deve ser permitida a emergir isoladamente e seu sexo determinado usando características morfológicas adultas. É provável que, se sua genitália estiver danificada, o indivíduo pode não acasalar com sucesso.
   4. Faça uma piscina para cada sexo na extremidade oposta do prato para a piscina nãoexada, movendo pupas identificadas através do prato usando um pincel de pintura de detalhe fino. Rotule a parte inferior do prato onde as duas piscinas estarão reunidas para identificá-las mais tarde.
   5. Quando o sexing e a triagem fluorescente são necessários, realize a triagem fluorescente primeiro, já que é o processo mais rápido dos dois.

Figura 4 - Sexing Anopheles gambiae pupae. Pupas individuais indicando a genitália externa de (A) uma fêmea (B) um macho e (C) um indivíduo que não pode ser facilmente identificado devido ao descolamento incompleto do exoesqueleto larval. Imagens ampliadas abaixo destacando a genitália externa. Pupae com ♀ (fêmea) e ♂ (macho) indicando a genitália externa da pupa com (D) ~50% da pupa submersa em água e com (E) toda a água removida destacando a diferença na facilidade de visualização da genitália externa. Ampliação: A,B,C=40x, D,E=30x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Confirmação sexual como adultos
   1. Até que uma taxa de erro muito baixa tenha sido demonstrada, confirme o sexo de pupas por morfologia adulta após o surgimento. Separado pupas sexadas em grupos de 10 ou menos em um tubo claro de 20 mL com alguns mL de água, selando com uma bola de algodão de lã, rotulada com o sexo esperado e permitem emergir durante a noite.
      NOTA: Como os adultos são transferidos na manhã seguinte, não é necessário fornecer alimentos a adultos emergentes.
   2. Confirme o sexo de adultos emergiu usando características morfológicas no dia seguinte.
   3. Se algum macho estiver presente nas coleções femininas, descarte as fêmeas, caso o acasalamento já tenha ocorrido.
   4. Se alguma fêmea estiver presente na coleção masculina, remova as fêmeas e mantenha os machos para travessia.
5. Configuração de cruzamentos do sistema GAL4-UAS
   1. Aspire o número desejado de adultos do sexo masculino e feminino dos tubos na etapa 2.4 em uma gaiola ou balde pequeno configurado da maneira padrão para a criação de An. gambiae.
      NOTA: Tome cuidado para não danificar os adultos durante esta transferência.
   2. Use aproximadamente 50 fêmeas com um número igual de machos, quando ~2000 adultos são necessários da prole.
      NOTA: Quando uma cruz deve ser alimentada várias vezes para gerar vários lotes até 200 de cada sexo pode ser configurado em gaiolas de 30cm x 30cm x 30cm. Quando apenas um pequeno número de fêmeas (<20) estão disponíveis para a cruz, adicionamos ~4x o número de machos para aumentar a probabilidade de acasalamento bem sucedido.
   3. Alimentam as fêmeas cruzadas e a prole traseira para o estágio apropriado, seguindo os protocolos ^padrão26, para realizar avaliação fenotípica (por exemplo, resistência a inseticidas, capacidade vetorial e ensaios de custo fitness).
   4. Quando o efeito materno da expressão transgênica é provável, configurar cruzes recíprocas das linhas de motorista e respondente e avaliar o fenótipo esperado.
      NOTA: Cruzes utilizando populações 'heterozigous' ou mistas de linhas de motorista e respondente, produzem progênero com cada um dos 4 genótipos possíveis. Isso fornece controles selvagens, somente uas e GAL4, bem como as transheterozygotes GAL4-UAS com as quais analisar o fenótipo. Se populações homozigas forem cruzadas, configure cruzes adicionais para fornecer controles apropriados para comparar fenótipos. A prole deve ser examinada como acima separando progêneres que carregam tanto ou apenas marcador, bem como negativos, para avaliação fenotípica.
6. Estabelecendo populações homozigiosas a partir de linhas geradas através do RCME carregando marcadores fluorescentes alternativos
   NOTA: É essencial que o marcador fluorescente de ambas as linhas esteja presente no mesmo local genômico e eles sejam completamente distinguíveis.
   1. Estabeleceu uma cruz parental de aproximadamente 200 adultos com número igual de machos de uma linha e fêmeas de uma linha após a triagem para selecionar indivíduos que exibem fluorescência correta e sexo, como descrito acima. Cerca de uma semana depois, o sangue alimenta a cruz usando protocolos ^{estabelecidos26}.
      1. Crie a prole F1 para pupas usando protocolos padrão e colete pupas como descrito anteriormente.
   2. Tela para fluorescência selecionando aqueles que carregam ambos os marcadores parentais (transheterozigous). Montar um intercross de F1 com essas pupas.
   3. Uma semana depois, o sangue alimenta as fêmeas da F-1 e a prole traseira para o estágio pupal seguindo protocolos padrão.
   4. Trie o pupae F2 selecionando aqueles que exibem APENAS um dos marcadores. Estes serão homozigosos para a inserção. Apenas 25% da prole será homozigosa para cada inserção, de modo a garantir que descendentes suficientes sejam criados para fornecer uma gaiola de estoque (400-500).
      NOTA: A seleção da prole transheterozigous deve ser totalmente rigorosa caso contrário, o processo se torna contaminado, e a homozigosidade completa pode não ser alcançada. Verifique duas vezes todas as progêneres selecionadas para o intercross de F1.

3. Um. Protocolo de limpeza de embriões de gambiae

1. Alimentação e manutenção de sangue
   1. Rear An. gâmbias para adultos seguindo protocolos padrão (por exemplo, MR4).
   2. Ração sanguínea de 5 a 7 dias de idade mulheres adultas, garantindo que a maioria esteja totalmente engorgada.
      ATENÇÃO: Ao longo deste protocolo, trabalhar rapidamente é essencial para garantir que os ovos não sejam permitidos a dessecar.
2. Colocação de ovos induzidos
   1. 3 dias após a alimentação sanguínea coletar ovos através de colocação induzida.
   2. Reúna a câmara de oviposition.
      1. Encha o pote de oviposição com água a uma profundidade de aproximadamente 5 mm. Conecte a panela a uma extremidade de um tubo de polipropileno de 50 mL, previamente cortado com uma serra de corte para que ambas as extremidades estejam abertas. (Usamos um disco plástico para uma panela (Figura 5); no entanto, a tampa original do tubo pode ser usada em seu lugar).
      2. Cubra a outra extremidade do tubo de polipropileno cortado com material (mangueira/meia) ou seções de luva de látex presas com uma faixa elástica, para que os adultos possam ser introduzidos, mas não podem escapar (Figura 5). Outros projetos alternativos de câmara de oviposição existem e podem ser ^usados26.
   3. Introduza cuidadosamente 10-15 fêmeas (sangue alimentado na etapa 3.1.2) à câmara de oviposição. Cubra a câmara de oviposição para produzir escuridão e deixe por 20 minutos.
      ATENÇÃO: Evite mover o pote de oviposition uma vez que os ovos tenham sido colocados para evitar encalhe e dessecação de ovos.
   4. Retire cuidadosamente o tubo de polipropileno de 50 mL da panela de oviposição, garantindo não liberar os mosquitos. Ovos brancos devem ser visíveis. Verifique se foram suficientes para fins proscritos. Repita se necessário.
   5. Cubra a panela (para proteção da poeira) e deixe os ovos amadurecerem até o estágio de desenvolvimento de interesse.
   6. Use um pincel de tinta de detalhamento fino para pegar ovos da panela e colocá-los na água em um bloco de vidro escavado de 40 ^mm2.

Figura 5 - Exemplo de câmara de oviposition (A) desmontada para destacar os componentes e (B) montados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

3. Fixação de embriões
   ATENÇÃO: Realize todas as etapas de fixação (etapa 3.3) em um capô de fumaça devido ao uso de formaldeído.
   1. Prepare a solução da FAA conforme descrito em Kaiser et al. (2014)²². A FAA compreende 3,6 M de formaldeído, 0,87 M de ácido acético e 8,5 M de etanol absoluto feito até volume com água destilada (_dH2O).
      1. Para 10 mL de FAA combine 2,68 mL de 13,42 M formaldeído, 4,96 mL de 17,14 M de etanol e 0,5 mL de ácido acético de 17,4 M com 1,86 mL de _H2O destilado. Fixative pode ser mantido por pelo menos 3 meses em um recipiente de vidro bem selado, mantido em um armário químico designado.
   2. Remova cuidadosamente a água do bloco de vidro com uma micropipette e cubra os ovos em 500 μL de FAA e oscile suavemente (~25 RPM) em um agitador orbital à temperatura ambiente por 30 minutos. Nenhuma mudança de cor é visível neste momento.
   3. Enxágüe bem os ovos com água destilada. Realize a lavagem 15 vezes para remover todos os traços de formaldeído. Usando uma micropipette de 1000 μL, adicione e remova 1 mL de _dH2O de cada vez, garantindo não danificar os ovos ao fazê-lo.
   4. Armazene águas residuais de enxágues em um recipiente designado para descarte de formaldeído para descarte de acordo com as diretrizes de segurança.
   5. Neste ponto, os ovos fixos podem ser armazenados a 4 °C durante a noite em água para mantê-los hidratados.
4. Branqueamento de embriões
   ATENÇÃO: Realize todas as etapas de branqueamento (passo 4) em um capô de fumaça devido à possível liberação de gás cloro quando hipoclorito de sódio e ácido acético forem combinados.
   1. Prepare a solução de branqueamento (solução Trpiš - descrita em Trpiš (1970)²¹ e modificada de acordo com Kaiser et al. (2014)²²). A solução trpiš é hipoclorito de sódio de 0,59 M e ácido acético de 0,35 M dissolvido em _H2O destilado.
      1. Para um ovolume de 10 mL de solução Trpiš, combine 2,68 mL de hipoclorito de sódio de 2,2 M e 0,2 mL de ácido acético de 17,4 M com 7,12 mL de _H2O destilado.
         NOTA:A solução Trpiš pode ser armazenada por pelo menos 3 meses em um recipiente de vidro bem selado e mantida em um armário químico seguro. A solução pode precisar ser vórtice após o armazenamento e deve ser sempre aberta em um capô de fumaça em caso de liberação de gás cloro.
   2. Cubra os ovos fixos com 1 mL de solução Trpiš e incubar em temperatura ambiente por 30 minutos. Os ovos começarão a desenvolver manchas pálidas após cerca de 5 minutos de incubação, chegando eventualmente a uma cor branca leitosa uma vez limpa.
   3. Enxágüe os ovos como na etapa 3.3.3 para remover a solução Trpiš.
   4. Armazene águas residuais em um recipiente de resíduos designado e descarte com excesso de água pelo ralo.
5. Armazenamento
   1. Armazene em 500 μL de _dH2O e mantenha entre 2-8 °C por alguns dias. Remova a maior parte da água cuidadosamente antes da visualização e imagem em massa, mas evite a dessecação dos ovos deixando um pequeno volume de água no vidro do relógio. Isso não vai interromper a fotografia dos ovos. Ovos individuais podem ser colocados no slide do microscópio para imagens de ampliação mais altas.

Resultados

A expressão 3xP3 de eYFP, dsRed e eCFP fornece identificação confiável e facilmente distintiva de indivíduos que possuem os genes marcadores que produzem expressão nos olhos e gúlia ventral de An. gambiae pupae (Figura 3). A morfologia diferencial observada na genitália externa masculina e feminina utilizada para o sexo e um exemplo de pupae não identificável são destacadas na Figura 4. A remoção de toda a água da pupae aumenta a ...

Discussão

Entender a função genética do mosquito é vital para desenvolver novas abordagens para controlar anofelinos e impactar a transmissão da malária. O sistema GAL4-UAS descrito é um sistema versátil e poderoso para análise funcional de genes candidatos e até hoje usamos o sistema para examinar a base genética da resistência a inseticidas17 e produção de hidrocarbonetos cuticulares15,23, bem como para marcar fluorescentemente diferentes populações de células do

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 x 15 mm plastic Petri dish	SLS	2175546	Pack of 10
1000 µL Gilson Pipette	Gilson	F144059P
20/25 mL Universal Tubes	Starlab	E1412-3020	Pack of 400
3 mL Pasteur Pipettes	SLS	G612398	Greiner Pasteur pipette 3 mL sterile individually wrapped
50 mL Falcon Tubes	Fisher Scientific	11512303
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	BP2818-500	500 mL
Acetic Acid	SLS	45726-1L-F	1 L
Cages	SLS	E6099	30x30x30 with screen port
Fine Paint Brushes	Amazon	UKDPB66	KOLAMOON 9 Pieces Detail Painting Brush Set Miniture Brushes for Watercolor, Acrylic Painting, Oil Painting (Wine Red)
Fish food	Amazon		Tetra Min Fish Food, Complete Food for All Tropical Fish for Health, Colour and Vitality, 10 L
Formaldehyde Solution	Sigma Aldrich	F8775
Mouth Aspirator	John Hock	612
Pond Salt	Amazon		Blagdon Guardian Pond Tonic Salt, for Fish Health, Water Quality, General Tonic, pH Buffer, 9.08 kg, treats 9,092 L
Pupae Pots	Cater4you	SP8OZ	250 pots with lids
Small Plastic Buckets	Amazon		2.5 L White Plastic Pail Complete with White Lid (Pack of 10)
Sodium Hypochlorite	Fisher Scientific	S25552