表面活性剂耗竭与有害通风相结合导致急性呼吸窘迫综合症 （ARDS） 的可重复模型

摘要

使用 0.9% 盐水（35 mL/kg 体重，37 °C）和高潮汐量通风与低 PEEP 相结合，导致中度呼吸机诱发肺损伤 （VILI） 导致实验性急性呼吸窘迫综合征 （ARDS）。该方法提供了肺损伤模型，具有低/有限可招募性，可长期研究各种通气策略的效果。

摘要

存在各种动物模型来研究急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的复杂病理学。这些模型包括油酸的脉动动脉输注、内毒素或细菌的输注、腹腔结膜和穿刺、各种肺炎模型、肺缺血/再灌注模型，当然还有表面活性剂耗竭模型等。表面活性剂耗竭可产生肺气交换和血液动力学的快速、可重复的恶化，可在麻醉猪中诱导，使用重复肺熔岩，盐水为 0.9%（35 mL/kg 体重，37 °C）。表面活性剂耗竭模型支持使用临床应用设备进行标准呼吸和血液动力学监测的调查。但是，该模型具有相对较高的可招募性，具有较高的气道压力的通风可以通过在电肺区域重新开放立即降低伤害的严重程度。因此，此模型不适合对使用高气道压力的呼吸机系统进行调查。表面活性剂耗竭和有害通风与高潮汐量/低正端过压（高电视/低PEEP）相结合，导致呼吸机引起的肺损伤（VILI），将降低由此产生的肺损伤的可招募性。及时上岗的好处和在可与重症监护室相媲美的环境中进行实验研究的可能性得到保留。

引言

急性呼吸窘迫综合症（ARDS）的死亡率仍然很高，价值超过40%1，尽管自^1967年第一次描述阿什博和佩蒂以来进行了深入的研究。当然，由于伦理问题和基础病理、环境条件和联合药物缺乏标准化，临床上对新疗法的调查有限，而动物模型则使标准化条件下能够进行系统研究。

因此，实验性ARDS已经诱导在大动物（如猪）或小动物（如啮齿动物）使用各种方法，如脉动动脉输液的油酸，静脉注射（i.v.）输液的细菌和内毒素，或头孢结和穿刺（CLP）模型导致败血症诱发的ARDS。此外，使用烧伤和吸入烟雾或肺缺血/再灌注（I/R）造成的直接肺损伤^3。一个常用的直接肺损伤模型是表面活性剂耗竭与肺熔岩，首先描述由拉赫曼等人在豚鼠^4。

表面活性剂耗竭是一种高度可重复的方法，可在气体交换和血液动力学⁵中迅速产生折衷。一个主要优势是有可能在大物种中应用表面活性剂耗竭，从而支持临床使用的机械呼吸机、导管和监测器的研究。然而，表面活性剂耗竭模型的一个主要缺点是，每当应用高气道压力或招聘策略（如易定位）时，即时招募电肺区域。因此，该模型不适合调查，例如，自动通风与高 PEEP 水平长时间⁶。Yoshida等人描述了表面活性剂耗竭和通风与高吸气道压力的组合，以诱导实验性ARDS^7，但他们的模型需要通过反复的血气采样和根据吸气压力和PEEP的滑动表对预定义走廊的部分氧气压力（P_aO_2）进行精心维护。

总体而言，过度攻击性有害通风或反复调整通风系统可能会导致肺部结构损伤，这种损伤过于严重，并导致随后的多个器官衰竭。因此，本文详细描述了一个易于可行的表面活性剂耗竭模型，以及具有高电视/低 PEEP 的有害通风模型，用于诱导实验性 ARDS，该模型支持长期使用临床通风参数的研究。

研究方案

实验在德国柏林查理特大学医学实验医学系进行（根据EN DIN ISO 9001:2000认证），并在实验（G0229/18）之前得到德国柏林联邦动物研究当局的批准。实验室动物护理原则用于所有实验，并符合欧洲和德国实验室动物科学学会的准则。

1. 实验室动物和动物福利

1. 在3-4个月大的深麻醉雄猪（德国兰德拉斯×大白猪）进行所有实验，体重（bw）为30-40公斤。

2. 麻醉、管状和机械通气

1. 在麻醉前12小时不要提供干粮，以免猪胃饱。允许免费获得水和稻草/干草，以尽量减少压力。
2. 预药与肌肉注射的组合阿扎佩龙（3毫克/千克bw），阿托平（0.03毫克/千克bw），氯胺酮（25毫克/千克bw）和西拉津（3.5毫克/千克bw）到猪的颈部肌肉组合，而动物仍然保存在他们的住房设施，以尽量减少压力。
   注:在实验前喂几块糖块时抚摸动物的脖子，在训练有素的方式喂糖块时注射，每天训练，将促进平稳的预药，并进一步减轻压力。
   1. 将动物放在担架上，一旦达到适当的麻醉水平，用布遮住眼睛进行运输。
   2. 将猪转移到手术室，并始终确保足够的自发呼吸。
   3. 如果住房设施不与实验室相邻，则取一个氧气瓶、安装管子和面罩，在运送猪时提供补充氧气。
   4. 将猪置于易发位置，并用适合动物鼻子的面膜（例如，10升/分钟）进行预氧。
3. 使用外周静脉导管（通常为 18 或 20 G）获得静脉访问。通过酒精交换进行擦拭手术后，将周围静脉导管放入其中一个耳静脉中。
   1. 开始输液与平衡的晶体溶液，并确保导管正确放置，以便随后输液麻醉剂。
   2. 将 500 mL 的平衡晶体溶液注入 bolus i.v.，然后连续输注 4 mL/kg/h 以获得液体支持。
   3. 开始监测周围氧饱和度 （SpO_2）通过固定 SpO₂传感器在耳朵或尾巴之一。
4. 通过注射异丙酚（约5-10毫克/千克 - 确切的剂量取决于预药的效果，并因动物而异）进行口服插管，从而诱导麻醉。
   注:之前注射阿片类药物将促进进一步的管管，但需要充足的经验，以避免动物过早呼吸暂停。注射100微克芬太尼（芬太尼柠檬酸盐，100微克/mL），直到自发呼吸速率减慢至约20/分钟，然后注射异丙酚。
5. 用袖口内窥镜（7.5 - 8.0 mm ID）和专为大型动物设计的喉镜（约25厘米长的直刃）为动物进行管。
   注:在 Theisen 等人详细描述的易发位置，灌管是最容易^的。
   1. 通过在 CO 2_监视器（卡彭图） 上观察 CO₂到期期间的典型波形来验证内窥管的位置。
   2. 使用消声检查等于双边呼吸的声音。
      注:猪可以机械通风，从两侧手动压缩肋骨笼，同时提供氧气与高流量的情况下，失败或延迟的管。
6. 将受启发氧（F_IO_2）的分数设定为1.0，呼吸器频率设定为15-20/分钟，潮汐体积设定为8-9 mL/kg bw，激发到过期比（I:E）为1:1.5，并施加5cmH₂O的正端过期压力（PEEP），开始机械通风。调整设置，以达到 35-40 mmHg 的二氧化碳 （P_和CO_2）的最终到期部分压力和 95% 以上的 SpO₂ 目标。
   1. 使用连续的硫酮（20毫克/千克/小时）和芬太尼（7微克/千克/小时）输液，以保持麻醉。
      注意:必要的剂量可能因动物而异，也因实验环境而异。在实验过程中，由于动物福利和科学原因，必须保持足够的麻醉深度。
   2. 在仪器测试期间密切监测动物的压力/疼痛反应（如心率、血压或呼吸速率的升高）。
      注意:如果麻醉深度足够，无需施用肌肉松弛剂，仪器就可能。
   3. 如果实验需要肌肉放松（例如，在表面活性剂耗尽之前，在有害的肺符合性测量之前），则持续输注 0.15 毫克/千克 bw/h 或重复注射肺素松弛剂。
7. 仪器仪表技术
   1. 把动物变成苏平的位置。
   2. 在转动动物时固定内窥视管和即 v 线。
   3. 用绷带缩回腿部，将皮肤拉伸到计划切口上方。
   4. 使用适当的皮肤消毒剂（如酒精和碘 1% 溶液）对手术区域进行消毒。
8. 用中央静脉导管将外部壶静脉调节，并将肺动脉导管 （PAC） 的引入器护套引入同一静脉。
   1. 在连接骨和胸骨（左侧或右侧）的线上进行 10 厘米的皮肤切口。
   2. 如有必要，请始终重新评估麻醉深度并调整剂量。
   3. 用组织钳和手术剪刀将皮下组织和鸭嘴兽分开，直到肉胸和胸骨肌肉可见。
   4. 继续进行钝切切程序，将肌肉之间的筋膜分离，直到外部壶静脉可见。
   5. 使用塞尔丁格技术⁹ 与中央静脉导管和引入器护套一起将外部壶静脉与中央静脉静脉结合，以便以后插入 PAC。
      注意:不要用提条器拉伸静脉，因为在采用皮下方法时会这样做。这将撕裂静脉。靠近标准缝合线。护套的大小取决于所选 PAC 的大小。通常使用 6F 介绍护套（10 厘米长）和 5F PAC，长度为 75 厘米，猪体重为 30-40 公斤。
9. 可以调节股动脉，进行侵入性血压监测。
   1. 确定后腿的格拉西利斯和萨托里乌斯肌肉之间的褶皱（左或右是可能的），以放置动脉线。
      注:股动脉的脉动应该很容易明显。
   2. 用塞尔丁格技术⁹来皮下地使动脉通气。
   3. 如果动脉不容易被帕口，则使用直接方法。
      1. 用5厘米长的切口切开皮肤，用组织钳和手术剪刀分离皮下组织。
      2. 使用钝切切程序将肌肉之间的筋膜分离到股动脉的水平。
         注意:D不要通过执行切割程序来伤害这些血管。
      3. 在股动脉周围循环一个连结，以便在穿刺部位出血时可以关闭血管。尽可能避免这一步，因为它会危及后腿的血流。
      4. 用塞尔丁格技术⁹来调节动脉。
10. 校准传感器对大气（零）和200毫米汞管（动脉线）或50毫米汞管（中央静脉线），并将它们连接到动脉导管和中央静脉线开始监测。
    1. 将压力传感器置于右中庭的估计位置，大约是胸腔高度的一半。
11. 执行一个小（4-5厘米）切口切开膀胱上方的皮肤，以藏匿泌尿膀胱。
    1. 使用钝器分离皮下组织。
    2. 在膀胱壁上放置一个钱包串缝合线（直径1-2厘米）。
       注:缝合线不应穿透膀胱壁的所有层，这将导致尿液通过穿刺流失。
    3. 在缝合线中间进行小切口，并引入尿导管。
    4. 立即用10ml升蒸馏水阻挡气球，将导管拉向膀胱壁，直到感觉到光阻。
    5. 关闭导管周围的钱包串缝合线。使用标准缝合线关闭皮肤。

3. 肺动脉导管的介绍

1. 根据导管的大小，用 0.5-1 mL 的空气检查 PAC 气球的气质，并再次放气气球。
2. 将 PAC 连接到压力传感器系统，并校准传感器与大气 （零） 和 100 mmHg。
3. 通过引入器护套引入 PAC，其气球放气长度为 10-15 厘米（取决于护套长度）。
   1. 气球离开护套后充气，并进一步推进PAC，同时监测压力和压力监测器上典型的波形。
   2. 当看到肺毛细子楔形压力 （PCWP） 波形时，将 PAC 向前推，当典型右中庭、右心室和肺动脉出现并停止推进 PAC 时。
   3. 在期末记录 PCWP 并放气气球（请参阅图 1 以了解相应的曲线）。
      注:气球通缩后，PCWP波形必须消失，肺动脉压力波形必须可见。如果看不到肺动脉压力波形，导管很可能插入肺动脉太远，并已到达自动楔形位置。这导致肺血管永久闭塞，必须通过拉回导管来纠正，直到肺动脉压力波形重新出现，从而避免并发症，例如肺血管¹⁰的破裂。PAC导管通常通过猪的劣质腔静脉意外地进入肝脏静脉。因此，如果在大约 30 - 50 厘米后无法达到正确的心室压力信号，则将导管拉回来，然后重新开始。

4. 血液测量的肺动脉热分化技术

1. 使用热分化技术¹¹测量心脏输出 （CO）。
   1. 将热病和流经房屋连接到 PAC 的相应流明。
   2. 接下来，将血液动力学监测器与 PAC 的相向温度端口（红帽）连接起来。
   3. 调整血液动力学监测器，以必要的模式补偿导管大小，导管长度，注射体积和注射盐水溶液的温度。
   4. 尽快注射0.9%的盐水（通常为5或10mL，0.9%的盐水，温度为4°C）。
   5. 等待测量完成。
2. 在呼吸机的呼吸周期内连续随机进行五次测量。
   1. 删除最高值和最低值，并使用其余三个值来计算平均值。
   2. 请注意，此平均值为心脏输出。
   3. 测量PCWP后，通过充气导管气球，并在测量后放气。
   4. 使用平均动脉压力 （MAP）、肺动脉压力 （PAP）、中央静脉压力 （CVP）、PCWP 和 CO 进行所有进一步的血液学计算。
      注:在测量之前，必须输入盐水体积和温度。为了正确测量，正常盐水必须保持在相同的温度（通常为 5°C <） 。导管的大小和长度也必须输入。某些监视器需要输入更正因子。
   5. 对于涉及电解质平衡精确测量的研究，请使用 5% 葡萄糖溶液而不是 0.9% 盐水。
3. 确保记录所有参数。在 CO 测量之前或之后同时采集动脉和混合静脉血样，以便计算肺内从右到左分流。
   1. 记录所有需要的呼吸设置和测量，以完成数据集，例如峰值、高原和末期压力。
      注:麻醉、管管和全仪器的诱导可能需要1.5小时，这取决于调查人员的经验和人数。

5. 表面活性剂消耗

1. 用 F_IO₂ 的 1.0 给动物通风。
   1. 断开动物与呼吸机的连接。
2. 用预温的 0.9% 盐水（37 °C，35 mL/kg）填充肺部，并配以连接到内窥管的漏斗。
   1. 为此，将漏斗抬高约1米以上的动物。
      注:静水压力将盐水分配到所有肺部。
   2. 当 MAP 降低到 <50 mmHg 以下时，立即停止加注。
3. 将漏斗下到地面以排出厕所液。将动物重新连接到呼吸机以进行氧化。
4. 等待，直到动物休养，并尽快重复厕所，如果需要的话。
   注:进一步厕所的必要性由 P_aO₂/F_IO₂ 比率定义。
   1. 每次厕所后 5 分钟后采集动脉血气样本。
   2. 重复熔岩，直到P_aO₂/F_IO₂ 比率（霍洛维茨指数）降低到100 mmHg以下至少5分钟在F_IO₂ 1.0和PEEP>5厘米H₂O。
      注:在熔岩期间必须调整呼吸速率，使动脉pH值保持在7.25以上，以防止血位下降。
5. 请注意，此动物模型基于表面活性剂耗竭和 VILI 的组合。
   注:熔岩将停止后，P_aO₂/F_IO₂ 比率保持低于100 5分钟不是60分钟后，以前公布的没有VILI⁵的表面活性剂洗涤模型。
   1. 在达到目标 P_aO 2 / F_IO₂后，开始高电视/低 PEEP 通风。
      注意:否则，过度攻击性的表面活性剂耗竭与VILI相结合将导致多个器官衰竭，并损害实验。表面活性剂耗竭的持续时间因动物而异，因为定义的 P_aO₂/F_IO₂ 是目标。可能需要 45 分钟到 1.5 小时。

6. 具有高潮汐量/低窥视（高电视/低窥视）的有害通风

1. 保持 F_IO₂ 的 1.0。
2. 将呼吸机设置在音量保证、压力控制的通风模式上。
3. 将峰值吸气压力的报警阈值提高到 60 mbar。
   注:呼吸机应施加高达60 mbar的吸气压力，但不应更高。
4. 将呼吸速率降低到 12/分钟，并将灵感到期 （I:E） 比率设置为 1:1.5（导致灵感时间为 2 秒，到期时间为 3 秒）。
5. 在至少 2 分钟内将潮汐体积缓慢提升至 17 mL/kg bw。
   1. 如果达到 60 mbar 的吸气压力，则不要进一步增加潮汐量。
      注:有限的吸气压力可能导致潮汐体积低于17 mL/kg体重，这取决于表面活性剂洗净后的肺损伤。潮汐量的突然增加可能导致巴罗特拉马或血液调节分解。因此，在几分钟内缓慢增加潮汐量至关重要。
6. 将 PEEP 降低到 2 mbar。
7. 给动物通风长达 2 小时（请参阅 图 2 的呼吸机设置和流量曲线）。
   注:高潮汐量的通风会导致动物良好的氧合，但周期性几乎完全的通货膨胀和通货紧缩会导致肺部的结构性损伤。结构性损害不能通过招聘策略、易定位、高 PEEP 等来扭转。在整个调查过程中，必须容忍由此造成的伤害。根据以下实验和调查持续时间，可能需要更短的高电视/低 PEEP 通风时间。

7. 实验结束和安乐死

1. 确保对实验方案的所有测量，将遵循肺损伤的诱导，进行。
2. 将芬太尼（至少0.5毫克）注射到持续麻醉中，等待至少5分钟。注射硫化物（至少1000毫克）迅速后，使用中央线至少60毫米的钾。

结果

P_aO₂/F_IO₂- 比率在所有动物表面活性剂洗涤期间下降 （图 3）。由此产生的缺氧、高血症和缺血导致肺动脉压力增加。肺熔岩的细节已经描述了其他地方^6。

表面活性剂耗竭重复，直到 P_aO₂/F_IO₂ 比率保持在 100 mmHg 以下，尽管机械通风的 PEEP 为 5 mbar 至少 5 分钟。之后，通风?...

讨论

本文描述了实验性ARDS在猪结合表面活性剂消耗的重复肺熔岩和通风与高潮汐量，低PEEP，和肺的完全通货膨胀/通缩的诱导。这种组合导致气体交换的可重复和可比恶化，并由此产生的血液同位素妥协，但限制了肺部的可招募性。因此，该模型模仿临床ARDS低可招募性，并允许调查新的通风系统。

协议有一些限制。首先，反复的熔岩导致临床（人类）ARDS的一些组织病理学特性，...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Evita Infinity V500	Dräger		intensive care ventilator
Flow through chamber thermistor	Baxter	93-505	for measuring cardiac output
Leader Cath Set	Vygon	1,15,805	arterial catheter
Mallinckrodt Tracheal Tube Cuffed	Covidien	107-80	8.0 mm ID
MultiCath3	Vygon	1,57,300	3 lumen central venous catheter, 20 cm length
Percutaneus Sheath Introducer Set	Arrow	SI-09600	introducer sheath for pulmonary artery catheter of 4-6 Fr., 10 cm length
Swan-Ganz True Size Thermodilution Catheter	Edwards	132F5	pulmonary artery catheter, 75 cm length
urinary catheter			no specific model requiered
Vasofix Braunüle 20G	B Braun	4268113B	peripheral vein catheter
Vigilance I	Edwards		monitor