Esgotamento do surfactante combinado com ventilação prejudicial resulta em um modelo reprodutível da Síndrome do Sofrimento Respiratório Agudo (ARDS)

Resumo

Uma combinação de lavagem surfactante usando soro fisiológico de 0,9% (35 mL/kg de peso corporal, 37 °C) e ventilação de alto volume de maré com peep baixo para causar lesão pulmonar induzida por ventilador moderado (VILI) resulta em síndrome experimental de angústia respiratória aguda (ARDS). Este método fornece um modelo de lesão pulmonar com baixa/limitada capacidade de recrutamento para estudar o efeito de várias estratégias de ventilação por longos períodos.

Resumo

Existem vários modelos animais para estudar os complexos mecanismos da síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS). Esses modelos incluem infusão pulmo-arterial de ácido oleico, infusão de endotoxinas ou bactérias, ligadura cecal e punção, vários modelos de pneumonia, modelos de isquemia/reperfusão pulmonar e, claro, modelos de esgotamento surfactante, entre outros. O esgotamento surfactante produz uma rápida e reprodutível deterioração da troca de gás pulmonar e hemodinâmica e pode ser induzido em suínos anestesiados usando lavages pulmonares repetidas com 0,9% de soro fisiológico (35 mL/kg de peso corporal, 37 °C). O modelo de esgotamento surfactante suporta investigações com monitoramento respiratório e hemodinâmico padrão com dispositivos clinicamente aplicados. Mas o modelo sofre de uma recrutamento relativamente alta e ventilação com altas pressões das vias aéreas pode reduzir imediatamente a gravidade da lesão reabrindo áreas pulmonares ateleáticas. Assim, este modelo não é adequado para investigações de regimes de ventilação que utilizam altas pressões das vias aéreas. Uma combinação de esgotamento surfactante e ventilação prejudicial com alto volume de maré/baixa pressão final positiva (alta TV/peep baixo) para causar lesão pulmonar induzida pelo ventilador (VILI) reduzirá a capacidade de recrutamento da lesão pulmonar resultante. As vantagens de uma indução oportuna e a possibilidade de realizar pesquisas experimentais em um ambiente comparável a uma unidade de terapia intensiva são preservadas.

Introdução

A mortalidade da síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS) permanece elevada com valores acima de 40%^1, apesar da pesquisa intensiva desde sua primeira descrição por Ashbough e Petty em 1967². Naturalmente, a investigação de novas abordagens terapêuticas é limitada na clínica devido a preocupações éticas e à falta de padronização das patologias subjacentes, condições ambientais e comeias, enquanto os modelos animais permitem a pesquisa sistemática em condições padronizadas.

Assim, a ARDS experimental foi induzida em animais de grande porte (por exemplo, suínos) ou pequenos animais (por exemplo, roedores) usando vários métodos como infusão pulmo-arterial de ácido oleico, infusão intravenosa (i.v.) de bactérias e endotoxinas, ou modelos de ligadura e punção cecal (CLP) causando ards induzido pela sepse. Além disso, são utilizadas lesões pulmonares diretas causadas por queimaduras e inalação de fumaça ou isquemia pulmonar/reperfusão pulmonar (I/R)³. Um modelo frequentemente usado de lesão pulmonar direta é o esgotamento surfactante com lavages pulmonares como descrito pela primeira vez por Lachmann et al. em cobaias⁴.

O esgotamento do surfactante é um método altamente reprodutível que resulta rapidamente em compromissos na troca de gás e hemodinâmica⁵. Uma grande vantagem é a possibilidade de aplicar o esgotamento do surfactante em grandes espécies que permitem pesquisa de suporte com ventiladores mecânicos, cateteres e monitores mecânicos clinicamente utilizados. No entanto, uma grande desvantagem do modelo de esgotamento surfactante é o recrutamento instantâneo de áreas pulmonares ateleáticas sempre que altas pressões das vias aéreas ou manobras de recrutamento, como posicionamento propenso, são aplicadas. Assim, o modelo não é adequado para investigar, por exemplo, ventilação automatizada com altos níveis de PEEP por^{vezes prolongadas 6}. Yoshida et al. descreveram uma combinação de esgotamento surfactante e ventilação com altas pressões inspiratórias das vias aéreas para induzir a ARDS⁷experimental, mas seu modelo requer uma manutenção elaborada da pressão parcial de oxigênio_(Pa O₂) em um corredor predefinido através de repetida amostragem de gás sanguíneo e ajuste da pressão de condução de acordo com uma tabela deslizante de pressão inspiratória e PEEP.

No geral, um modelo com uma ventilação prejudicial excessivamente agressiva ou um ajuste trabalhoso e repetido do regime de ventilação pode resultar em danos estruturais dos pulmões, o que é muito grave e resulta em falência múltipla subsequente de órgãos. Assim, este artigo fornece uma descrição detalhada de um modelo facilmente viável de esgotamento surfactante mais ventilação prejudicial com alta Tv/PEEP baixo para indução de ARDS experimental, que suporta pesquisas com parâmetros de ventilação clinicamente utilizados para períodos prolongados.

Protocolo

Os experimentos foram realizados no Departamento de Medicina Experimental, Charité - Medicina Universitária, Berlim, Alemanha (certificado de acordo com o EN DIN ISO 9001:2000) e foram aprovados pelas autoridades federais para pesquisa animal em Berlim, Alemanha, antes dos experimentos (G0229/18). Os princípios do cuidado laboratorial aos animais foram utilizados em todos os experimentos e estão de acordo com as diretrizes da Sociedade Europeia e Alemã de Ciências Animais Laboratoriais.

1. Animais de laboratório e bem-estar animal

1. Realize todos os experimentos em porcos machos profundamente anestesiados (German Landrace × Large White) de 3-4 meses de idade com um peso corporal (bw) de 30-40 kg.

2. Anestesia, intubação e ventilação mecânica

1. Não forneça alimentos secos por 12h antes da anestesia para evitar um estômago cheio dos porcos. Permita o acesso gratuito à água e palha/feno para minimizar o estresse.
2. Premedicar com injeção intramuscular de uma combinação de azaperona (3 mg/kg bw), atropina (0,03 mg/kg bw), cetamina (25 mg/kg bw) e xilazina (3,5 mg/kg bw) na musculatura do pescoço do porco, enquanto os animais ainda são mantidos em sua unidade de habitação para minimizar o estresse.
   NOTA: O treinamento diário de acariciar o pescoço do animal enquanto alimenta alguns cubos de açúcar antes do experimento e a aplicação da injeção enquanto alimenta cubos de açúcar de forma treinada facilitará uma premedidicação suave e reduzirá ainda mais o estresse.
   1. Coloque o animal em uma maca e cubra os olhos com um pano para transporte uma vez que um nível adequado de anestesia seja alcançado.
   2. Transfira o porco para o teatro cirúrgico e sempre garanta respiração espontânea suficiente.
   3. Pegue um cilindro de oxigênio, tubos de encaixe e máscara para fornecer oxigênio suplementar durante o transporte dos porcos, se as instalações habitacionais não estiverem adjacentes ao laboratório.
   4. Coloque o porco na posição propensa e pré-oxigenado com uma máscara que se encaixa no focinho do animal usando um alto fluxo de oxigênio (por exemplo, 10 L/min).
3. Use um cateter venoso periférico (geralmente 18 ou 20 G) para obter acesso venoso. Coloque o cateter venoso periférico em uma das veias da orelha após um procedimento de limpeza com trocas de álcool.
   1. Inicie uma infusão com uma solução cristalina equilibrada e garanta a colocação correta do cateter para posterior infusão de anestésicos.
   2. Infundir 500 mL de uma solução cristalina equilibrada como bolus i.v. seguido de infusão contínua de 4 mL/kg/h para suporte de fluido.
   3. Comece a monitorar a saturação periférica de oxigênio (SpO₂) protegendo o Medidor SpO₂em uma das orelhas ou na cauda.
4. Induzir anestesia injetando propofol (cerca de 5-10 mg/kg - a dose exata depende do efeito da premedicção e difere de animal para animal) para intubação orotraqueal.
   NOTA: A injeção prévia de um opioide facilitará ainda mais a intubação, mas requer ampla experiência para evitar uma apneia prematura do animal. Uma injeção de 100 μg de fentanil (citrato de fentanil, 100 μg/mL) pode ser repetida até que a taxa respiratória espontânea desacelere para cerca de 20/min antes de injetar propofol.
5. Entubar o animal com um tubo endotraqueal algemado (7,5 - 8,0 mm de ID) e um laringoscópio projetado para animais de grande porte (lâmina reta de cerca de 25 cm de comprimento).
   NOTA: A intubação é mais fácil na posição propensa, conforme descrito em detalhes por Theisen et al.⁸.
   1. Verifique a colocação do tubo endotraqueal observando a forma de onda típica de CO₂ durante a expiração no monitor de CO₂(capnógrafo).
   2. Use auscultação para verificar se há sons de respiração bilaterais iguais.
      NOTA: Os suínos podem ser ventilados mecanicamente com a compressão manual da caixa torácica de ambos os lados enquanto fornecem oxigênio com alto fluxo em caso de intubação falha ou retardada.
6. Ajuste a fração de oxigênio inspirado (F_IO₂) para 1.0, frequência respiratória para 15-20/min, volume de maré para 8-9 mL/kg bw, inspiração para razão de expiração (I:E) para 1:1.5, e aplique uma pressão final-expiratória positiva (PEEP) de 5 cmH₂O para iniciar a ventilação mecânica. Ajuste as configurações para atingir uma pressão parcial expiratória final de dióxido de carbono (P_etCO₂) de 35-40 mmHg e uma SpO₂ acima de 95%.
   1. Use uma infusão contínua de tiapentona (20 mg/kg/h) e fentanil (7 μg/kg/h) para manter a anestesia.
      NOTA: A dosagem necessária pode variar de animal para animal e entre configurações experimentais. É essencial manter uma profundidade suficiente de anestesia durante o curso do experimento para o bem-estar animal e razões científicas.
   2. Monitore o animal de perto para reações de estresse/dor (como aumento da frequência cardíaca, pressão arterial ou frequência respiratória) durante a instrumentação.
      NOTA: A instrumentação deve ser possível sem administrar um relaxante muscular se a profundidade da anestesia for suficiente.
   3. Administrar um relaxante muscular, por exemplo, brometo de pancurônio (0,15 mg/kg bw i.v. bolus, seguido de uma infusão contínua de 0,15 mg/kg bw/h ou repetidas injeções de bolus), se o relaxamento muscular for necessário para o experimento (por exemplo, antes de um esgotamento surfactante, antes de medidas de conformidade pulmonar de ventilação prejudicial).
7. Técnicas de instrumentação
   1. Transforme o animal na posição supina.
   2. Proteja o tubo endotraqueal e a linha intravenosa enquanto gira o animal.
   3. Retraia as pernas usando ataduras para esticar a pele acima dos locais de incisão planejados.
   4. Esterilize as áreas de operação com um desinfetante adequado da pele, como uma solução de álcool e iodo de 1%.
8. Cannulate a veia jugular externa com um cateter venoso central e, além disso, introduza a bainha introdutor do cateter arterial pulmonar (PAC) na mesma veia.
   1. Realize uma incisão de pele de 10 cm na linha que conecta a mandíbula e o esterno (lado esquerdo ou direito possível).
   2. Reavalie sempre a profundidade da anestesia e ajuste a dosagem, se necessário.
   3. Separe o tecido subcutâneo e o platysma com fórceps teciduais e tesoura cirúrgica até que os músculos braquiocefálicos e esternocefálicos sejam visíveis.
   4. Continue com um procedimento de corte brusco para separar a fáscia entre os músculos até que a veia jugular externa seja visível.
   5. Use a técnica Seldinger⁹ para cannular a veia jugular externa com o cateter venoso central e a bainha introdutora para posterior inserção do PAC.
      NOTA: Não dilate a veia com um dilatador, pois é feito em caso de uma abordagem percutânea. Isso rasgaria a veia. Feche com suturas padrão. Os tamanhos da baia dependem do tamanho do PAC escolhido. Uma baia introdutor de 6F (10 cm de comprimento) e um PAC de 75 cm de comprimento em suínos de 30-40 kg de peso corporal são tipicamente usados.
9. Cannulate a artéria femoral para monitoramento invasivo da pressão arterial.
   1. Identifique a dobra entre o músculo gracilis e sartorius da perna traseira (esquerda ou direita é possível) para colocar uma linha arterial.
      NOTA: A pulsação da artéria femoral deve ser facilmente palpável.
   2. Cannulate a artéria percutânea com a técnica Seldinger⁹.
   3. Use uma abordagem direta se a artéria não for facilmente palpatada.
      1. Corte a pele com uma incisão de 5 cm de comprimento e separe o tecido subcutâneo com fórceps teciduais e tesoura cirúrgica.
      2. Use um procedimento de corte contundente que separa a fáscia entre os músculos ao nível da artéria femoral.
         NOTA :D o não ferir os vasos safeno, realizando o procedimento de corte craniano deles.
      3. Enrole uma ligadura ao redor da artéria femoral para que o vaso possa ser fechado em caso de sangramento no local da punção. Evite este passo sempre que possível, pois compromete o fluxo sanguíneo para a perna traseira.
      4. Cannulate a artéria com a técnica Seldinger⁹.
10. Calibrar os transdutores contra a atmosfera (zero) e 200 mmHg (linha arterial) ou 50 mmHg (linha venosa central) e conectá-los ao cateter arterial e à linha venosa central para iniciar o monitoramento.
    1. Coloque os transdutores de pressão cerca de metade da altura do tórax na posição estimada do átrio direito.
11. Realize uma pequena incisão (4-5 cm) cortando a pele acima da bexiga para cateterização da bexiga urinária.
    1. Separe o tecido subcutâneo usando instrumentos contundentes.
    2. Coloque uma sutura de corda de bolsa (1-2 cm de diâmetro) na parede da bexiga.
       NOTA: As suturas não devem penetrar em todas as camadas da parede da bexiga, o que resultaria na perda de urina através das perfurações.
    3. Realize uma pequena incisão no meio da sutura e introduza o cateter urinário.
    4. Imediatamente, bloqueie o balão com 10 mL de água destilada e puxe o cateter em direção à parede da bexiga até que uma resistência à luz seja sentida.
    5. Feche a sutura de corda da bolsa ao redor do cateter. Feche a pele usando suturas padrão.

3. Introdução do cateter da artéria pulmonar (PAC)

1. Verifique a patência do balão do PAC com 0,5-1 mL de ar dependendo do tamanho do cateter e esvazie novamente o balão.
2. Conecte o PAC ao sistema transdutor de pressão e calibrar o transdutor contra a atmosfera (zero) e 100 mmHg.
3. Introduza o PAC através da baia introdutora com um balão deflacionado por 10-15 cm (dependendo do comprimento da baia).
   1. Infle o balão depois de deixar a baia e avance ainda mais o PAC enquanto monitora a pressão e as formas típicas de onda no monitor de pressão.
   2. Empurre o PAC para a frente enquanto as formas de onda típicas do átrio direito, ventrículo direito e artéria pulmonar aparecem e param de avançar o PAC quando a forma de onda da cunha capilar pulmonar (PCWP) é vista.
   3. Registo o PCWP no término e esvazie o balão (ver Figura 1 para as respectivas curvas).
      NOTA: Após a deflação do balão, a forma de onda PCWP deve desaparecer, e a forma de onda de pressão arterial pulmonar deve ser visível. Se a forma de onda de pressão arterial pulmonar não puder ser vista, o cateter é provavelmente inserido muito longe em uma artéria pulmonar e atingiu uma posição de cunha automática. Isso resulta em uma oclusão permanente de um vaso pulmonar e deve ser corrigido puxando o cateter de volta até que a forma de onda de pressão arterial pulmonar reapareçam, evitando complicações, por exemplo, ruptura do vaso pulmonar¹⁰. Os cateteres PAC são frequentemente acidentalmente avançados em veias hepáticas através da veia de caval inferior em porcos. Assim, se o sinal de pressão do ventrículo direito não for atingido após cerca de 30 - 50 cm, puxe o cateter para trás e comece tudo de novo.

4. Técnica de termodiluição da artéria pulmonar para medições hemodinâmicas

1. Meça a saída cardíaca (CO) com a técnica de termodiluição¹¹.
   1. Conecte o ormistor e um fluxo através da habitação ao respectivo lúmen do PAC.
   2. Em seguida, conecte o monitor hemodinâmico com a porta de temperatura distal do PAC (tampa vermelha).
   3. Ajuste o monitor hemodinâmico ao modo necessário compensando o tamanho do cateter, o comprimento do cateter, o volume injetado e a temperatura da solução salina injetada.
   4. Injete o volume apropriado de 0,9% salino o mais rápido possível (geralmente 5 ou 10 mL de soro fisiológico de 0,9% com uma temperatura de 4 °C).
   5. Aguarde até que a medição seja concluída.
2. Randomize cinco medidas em rápida sucessão ao longo do ciclo respiratório do ventilador.
   1. Exclua os valores mais altos e mais baixos e use os três valores restantes para calcular a média.
   2. Note este valor médio como a saída cardíaca.
   3. Meça o PCWP depois inflando o balão do cateter e esvazie-o após a medição.
   4. Use a pressão arterial média (MAP), pressão arterial pulmonar (PAP), pressão venosa central (CVP), PCWP e o CO para todos os cálculos hemodinâmicos adicionais.
      NOTA: O volume de soro fisiológico, bem como a temperatura, devem ser inseridos no monitor antes das medições. O soro fisiológico normal deve ser mantido na mesma temperatura (geralmente <5 °C) para medições corretas. O tamanho e o comprimento do cateter também devem ser inseridos. Alguns monitores requerem a entrada de um fator de correção.
   5. Para estudos que envolvam medidas exatas de equilíbrio eletrólito, utilize 5% de solução de glicose em vez de 0,9% salina.
3. Certifique-se de gravar todos os parâmetros. Faça amostras de sangue venosas simultâneas e mistas pouco antes ou depois das medições de CO para permitir o cálculo do desvio intra-pulmonar da direita para a esquerda.
   1. Registo todas as configurações e medidas respiratórias necessárias para completar o conjunto de dados, por exemplo, pico, platô e pressão expiratória final.
      NOTA: A indução de anestesia, intubação e instrumentação completa pode exigir 1,5h dependendo da experiência e número dos investigadores.

5. Esgotamento do surfactante

1. Ventilar o animal com um F_IO₂ de 1.0.
   1. Desconecte o animal do ventilador.
2. Encha os pulmões com soro fisiológico pré-armado de 0,9% (37 °C, 35 mL/kg) com um funil conectado ao tubo endotraqueal.
   1. Para isso, levante o funil cerca de 1 m acima do animal.
      NOTA: A pressão hidrostática alocará o soro fisiológico em todas as seções pulmonares.
   2. Pare imediatamente de encher quando o MAP diminuir abaixo de <50 mmHg.
3. Abaixe o funil para o nível do solo para drenar o fluido de lavagem. Reconecte o animal ao ventilador para oxigenação.
4. Aguarde até que o animal se recupere e repita a lavagem o mais rápido possível, se necessário.
   NOTA: A necessidade de uma nova lavagem é definida pela razão_Pa O₂/F_IO_2.
   1. Pegue uma amostra de gás arterial após 5 minutos após cada lavado.
   2. A repetição das lavages até a relação_Pa O₂/F_IO₂ (índice Horowitz) diminui abaixo de 100 mmHg por pelo menos 5 min em F_IO₂ 1.0 e PEEP > 5 cmH₂O.
      NOTA: A taxa respiratória deve ser ajustada durante o período de lavages para manter o pH arterial acima de 7,25, a fim de evitar a descompensação hemodinâmica.
5. Esteja ciente de que este modelo animal é baseado em uma combinação de esgotamento surfactante e VILI.
   NOTA: As lavagens serão interrompidas após a relação_Pa O₂/F_IO₂ permanece abaixo de 100 por 5 min NÃO após 60 min, conforme publicado anteriormente para um modelo de lavagem surfactante sem VILI⁵.
   1. Comece com alta ventilação de TV/peep baixa depois que o_alvoP a O₂/F_IO₂ foi atingido.
      NOTA: Caso contrário, um esgotamento surfactante excessivamente agressivo combinado com o VILI resultará em falência múltipla de órgãos e comprometerá o experimento. A duração do esgotamento do surfactante varia entre os animais, uma vez que um_Pa O₂/F_I2 definido é direcionado. Pode levar de 45 min a 1,5 h.

6. Ventilação prejudicial com alto volume de maré/PEEP baixo (TV alta/peep baixo)

1. Mantenha um F_IO₂ de 1.0.
2. Coloque o ventilador em um modo de ventilação garantido por pressão.
3. Aumente o limiar de alarme para pressão inspiratória de pico para 60 mbar.
   NOTA: O ventilador deve aplicar uma pressão inspiratória de até 60 mbar, mas não mais alto.
4. Reduza a taxa respiratória para 12/min e defina a inseminação da relação de expiração (I:E) para 1:1,5 (resultando em um tempo de inspiração de 2 s e tempo de expiração de 3 s).
5. Aumente o volume da maré lentamente até 17 mL/kg bw ao longo de pelo menos 2 minutos.
   1. Não aumente ainda mais o volume da maré se uma pressão inspiratória de 60 mbar for atingida.
      NOTA: A pressão inspiratória limitada pode resultar em volume de maré abaixo de 17 mL/kg de peso corporal, dependendo da lesão pulmonar após a lavagem do surfactante. Um aumento repentino no volume da maré pode resultar em barotrauma ou descompensação hemodinâmica. Portanto, é de extrema importância aumentar os volumes das marés lentamente ao longo de vários minutos.
6. Reduza o PEEP para 2 mbar.
7. Ventile o animal por até 2h (consulte a Figura 2 para as configurações do ventilador e a curva de fluxo).
   NOTA: A ventilação com grandes volumes de marés resultará em boa oxigenação do animal, mas a inflação cíclica quase completa e a deflação resultam em lesões estruturais dos pulmões. Danos estruturais não podem ser revertidos com manobras de recrutamento, posicionamento propenso, peep alto, etc. A lesão resultante deve ser tolerada durante toda a investigação. Um tempo de ventilação de TV/peep mais curto pode ser necessário dependendo do seguinte experimento e duração da investigação.

7. Fim do experimento e eutanásia

1. Certifique-se de que todas as medidas do protocolo experimental, que seguirá a indução da lesão pulmonar, sejam realizadas.
2. Injete fentanil (pelo menos 0,5 mg) adicionalmente à anestesia contínua e espere pelo menos 5 minutos. Injete tiopental (pelo menos 1000 mg) seguido rapidamente por pelo menos 60 mmol de potássio usando a linha central.

Resultados

A_relaçãoP a O₂/F_IO₂diminuiu durante a lavagem do surfactante em todos os animais(Figura 3). A hipoxemia resultante, hipercapnia e atelectasia causaram um aumento na pressão arterial pulmonar. Os detalhes das lavages pulmonares já estão descritos em outros lugares⁶.

O esgotamento do surfactante foi repetido até que a relação_Pa O₂/F_IO₂ permaneceu a...

Discussão

Este artigo descreve a indução de ARDS experimental em suínos combinando esgotamento surfactante por lavages pulmonares repetidas e ventilação com grandes volumes de maré, peep baixo e inflação/deflação completa dos pulmões. Essa combinação causa uma deterioração reprodutível e comparável na troca de gás e o compromisso hemodinâmico resultante, mas limita a recrutamento dos pulmões. Assim, esse modelo imita a ARDS clínica com baixa capacidade de recrutamento e permite a investigação de novos regime...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Evita Infinity V500	Dräger		intensive care ventilator
Flow through chamber thermistor	Baxter	93-505	for measuring cardiac output
Leader Cath Set	Vygon	1,15,805	arterial catheter
Mallinckrodt Tracheal Tube Cuffed	Covidien	107-80	8.0 mm ID
MultiCath3	Vygon	1,57,300	3 lumen central venous catheter, 20 cm length
Percutaneus Sheath Introducer Set	Arrow	SI-09600	introducer sheath for pulmonary artery catheter of 4-6 Fr., 10 cm length
Swan-Ganz True Size Thermodilution Catheter	Edwards	132F5	pulmonary artery catheter, 75 cm length
urinary catheter			no specific model requiered
Vasofix Braunüle 20G	B Braun	4268113B	peripheral vein catheter
Vigilance I	Edwards		monitor