傷害性換気と組み合わせた界面活性剤の枯渇は急性呼吸窮迫症候群(ARDS)の再現可能なモデルをもたらす

要約

0.9%生理液量(35mL/kg体重、37°C)を用いた界面活性剤洗浄と、中程度の人工呼吸器誘発肺傷害(VILI)を引き起こす低いPEEPによる高潮量換気の組み合わせは、実験的急性呼吸窮迫症候群(ARDS)をもたらす。この方法は、長期にわたる様々な換気戦略の効果を研究するための低/限られた採用能力を有する肺損傷のモデルを提供する。

要約

急性呼吸窮迫症候群(ARDS)の複雑な病態機構を研究するために、様々な動物モデルが存在する。これらのモデルには、オレイン酸の肺動脈注入、内毒素または細菌の注入、cecalライゲーションおよび穿刺、様々な肺炎モデル、肺虚血/再灌流モデル、そしてもちろん界面活性剤枯渇モデルなどが含まれる。サーファクタントの枯渇は、肺ガス交換と血液力学の急速で再現性の悪化を生じ、0.9%の生理食動物(35 mL/kg体重、37°C)で繰り返される肺洗浄を使用して麻酔豚で誘導することができます。界面活性剤の枯渇モデルは臨床応用された装置の標準的な呼吸および血行力学的モニタリングと調査を支える。しかし、このモデルは比較的高い採用可能性に苦しんでおり、高い気道圧力で換気を行うことで、直ちに局所肺領域を再開することで怪我の重症度を軽減することができます。したがって、このモデルは、高気道圧力を使用する人工呼吸器のレジームの調査には適していません。界面活性剤の枯渇と高潮量/低陽性終気流圧(高いTv/低PEEP)との有害換気の組み合わせにより、人工呼吸器による肺損傷(VILI)を引き起こすことにより、肺損傷の採用性が低下します。タイムリーな誘導の利点と集中治療室に匹敵する設定で実験研究を行う可能性は保存されます。

概要

急性呼吸窮迫症候群(ARDS)の死亡率は、1967年のAshboughとPettyによる最初の記述以来、集中的な研究にもかかわらず、40%1を超える値で高いまま^{である2。}当然のことながら、新しい治療アプローチの調査は、倫理的な懸念と基礎となる病理、周囲の状態、および共同薬の標準化の欠如のためにクリニックで制限されていますが、動物モデルは標準化された条件下で体系的な研究を可能にします。

したがって、実験的なARDSは、オレイン酸の肺動脈注入、細菌および内毒素の静脈内注入、またはセプシス誘発性ARDSを引き起こすcecalライゲーションおよび穿刺(CLP)モデルのような様々な方法を用いて、大型動物(例えば、ブタ)または小動物(例えば、げっ歯類)に誘導された。また、火傷や煙の吸入や肺虚血/再灌流(I/R)による直接肺損傷が^3.直接肺損傷の1つの頻繁に使用されるモデルは、モルモット⁴で最初に述べられているように肺洗浄による界面活性剤の枯渇である。

界面活性剤の枯渇は、ガス交換およびヘモダイナミクス⁵において急速に妥協をもたらす非常に再現性の高い方法である。大きな利点は、臨床的に使用される機械式人工呼吸器、カテーテル、モニターでのサポート研究を可能にする大規模な種で界面活性剤の枯渇を適用する可能性です。しかし、界面活性剤枯渇モデルの大きな欠点は、高気道圧力や位置決めなどの採用工作が適用されるたびに、気楽な肺領域の即時募集である。したがって、モデルは、例えば、長期化時間⁶の高いPEEPレベルを有する自動換気を調査するのに適していない。吉田らは、実験ARDS⁷を誘導するために界面活性剤の枯渇と換気と高い吸気性気道圧の組み合わせを説明したが、そのモデルでは、血液ガスのサンプリングを繰り返し、圧及びPEEPの摺動テーブルに従った駆動圧力の調整を繰り返し、事前定義された廊下で酸素の分圧(P_aO2)の精巧な維持を必要とする。

全体的に、過度に積極的な有害な換気または骨の折れる、換気の繰り返し調整を持つモデルは、肺の構造的損傷をもたらし、これはあまりにも深刻であり、その後の多臓器不全をもたらす。したがって、この記事では、長期間にわたって臨床的に使用される換気パラメータを用いた研究を支援する実験的ARDSの誘導のための高いTv/低PEEPによる界面活性剤枯渇と有害な換気の簡単に実現可能なモデルの詳細な説明を提供します。

プロトコル

実験は、実験に先立って、ドイツ・ベルリンの大学医学部(EN DIN ISO 9001:2000に準拠)で実施され、実験前にドイツ・ベルリンの動物研究に関して連邦当局によって承認されました(G0229/18)。実験動物の治療の原則は、すべての実験で使用され、実験動物科学の欧州およびドイツ協会のガイドラインに従っています.

1. 実験動物及び動物福祉

1. 体重(bw)30~40kgの深麻酔をした雄豚(ドイツ陸地×大白)の3~4ヶ月ですべての実験を行います。

2. 麻酔、挿管、および機械的換気

1. 豚の完全な胃を避けるために麻酔の前に12時間乾燥食品を提供しないでください。ストレスを最小限に抑えるために水とわら/干し草への自由なアクセスを許可します。
2. アザペロン(3mg/kg bw)、アトロピン(0.03mg/kg bw)、ケタミン(25mg/kg bw)、キシラジン(3.5mg/kg bw)を豚の首筋に組み合わせた筋肉注射を用いたプレメディケーションは、動物がストレスを最小限に抑えるために住宅施設に保管されている。
   注:実験の前にいくつかの砂糖キューブを供給しながら、動物の首をかわいがって、訓練された方法で糖キューブを供給しながら注入を適用する毎日のトレーニングは、滑らかな前投薬を容易にし、さらにストレスを軽減します。
   1. 動物を担架に乗せ、十分なレベルの麻酔に達したら、輸送用の布で目を覆います。
   2. 豚を外科劇場に移し、常に十分な自然呼吸を保障する。
   3. 住宅施設が実験室に隣接していない場合は、酸素ボンベ、フィッティングチューブ、およびマスクを取って、豚を輸送しながら補助酸素を提供します。
   4. 高い酸素(例えば、10 L/分)を使用して動物の鼻に合うマスクで豚を起こしやすい位置に置き、前酸素化します。
3. 静脈アクセスを得るために末梢静脈カテーテル(通常18または20 G)を使用してください。アルコール交換で拭き取り手順を行った後、末梢静脈カテーテルを耳静脈の1つに入れる。
   1. バランスのとれた結晶溶液で注入を開始し、麻酔薬のその後の注入のためのカテーテルの正しい配置を確認します。
   2. 500 mLのバランスのとれた結晶溶液をボーラス i.v. として注入し、続いて流体サポートのために 4 mL/kg/h の連続注入を行います。
   3. 耳または尾部の1つでSpO₂-Sensorを固定して、末梢酸素飽和度(SpO₂₎のモニタリングを開始します。
4. プロポフォール(約5〜10mg/kg - 正確な用量は、前投薬の効果に依存し、動物から動物に異なる)耳通管挿管のために注入することによって麻酔を誘発する。
   注:オピオイドの事前注射はさらに挿管を容易にしますが、動物の早期無呼吸を避けるために十分な経験が必要です。プロポフォールを注入する前に、100μgのフェンタニル(クエン酸フェンタニル、100 μg/mL)の注入を、自発呼吸速度が約20/分まで遅くなるまで繰り返し行います。
5. カフ付き気管チューブ(7.5-8.0 mm ID)と大型動物用に設計された喉頭鏡(長さ約25cmのストレートブレード)で動物を挿管します。
   注:挿管は、Theisenらら8によって詳細に説明されているように、起こりやすい位置で最も^{簡単です。}
   1. _CO2-モニター(カプノグラフ)での満了時に_CO2の典型的な波形を観察することにより、気管内チューブの配置を確認します。
   2. 等しい二国間の呼吸音をチェックするためにオースカルテーションを使用してください。
      注:ブタは、挿管に失敗または遅延した場合に高流量の酸素を供給しながら、両側からリブケージの手動圧縮で機械的に換気することができます。
6. インスパイアされた酸素の分率(F_IO₂₎を1.0に、呼吸数を15-20/minに、潮量を8-9 mL/kg bwに、賞味比(I:E)から1:1.5にインスピレーションを与え、5cmH₂Oの正の終気圧(PEEP)を適用して機械換気を開始します。設定を調整して、35~40 mmHgの二酸化炭素(P et CO2)の終値分圧(P_etCO2)と95%以上のSpO₂をターゲットにします。
   1. 麻酔を維持するために、チオプトン(20mg/kg/h)とフェンタニル(7 μg/kg/h)の連続i.v.注入を使用してください。
      注:必要な投与量は、動物から動物、および実験設定によって異なる場合があります。動物の福祉と科学的理由から、実験の過程で十分な深さの麻酔を維持することが不可欠です。
   2. 動物のストレス/痛みの反応(心拍数、血圧、呼吸数の増加など)を細かく監視します。
      注:麻酔の深さが十分である場合は、筋弛緩剤を投与せずに計装が可能である必要があります。
   3. 筋肉弛緩剤を投与し、例えば、臭化パンクロニウム(0.15mg/kg bw i.v.bolus、0.15 mg/kg bw/hまたは繰り返しボーラス注射の連続注入)を投与する。実験に筋肉弛緩が必要な場合(例えば、界面活性剤枯渇前、有害な腹腔肺コンプライアンスの前)。
7. インストルメンテーションテクニック
   1. 動物をサピーヌの位置に変えます。
   2. 気管チューブとi.v.ラインを動物を回しながら固定します。
   3. 包帯を使用して脚を引き込み、計画された切開部位の上に皮膚を伸ばします。
   4. アルコールやヨウ素1%溶液などの適切な皮膚消毒剤で手術領域を殺菌します。
8. 中心静脈カテーテルを用いて外的頸静脈をカニューレートし、加えて、肺動脈カテーテル(PAC)の導入者シースを同じ静脈に導入する。
   1. 下顎骨と胸骨(可能な左右)を結ぶライン上で10cmの皮膚切開を行う。
   2. 常に麻酔の深さを再評価し、必要に応じて投与量を調整します。
   3. 皮下組織とカモノマを、腕頭筋と切菌筋が見えるまで、組織鉗子と外科用はさみで分離する。
   4. 鈍い切り取り手順を続けて、外部頸静脈が見えるまで筋肉間の筋膜を分離します。
   5. セルディンガー技術⁹ を使用して、後でPACを挿入するために、中央静脈カテーテルと導入者シースで外部頸静脈をカンニュール化する。
      注:経皮的なアプローチの場合に行われるように、拡張器で静脈を拡張しないでください。これは静脈を引き裂くだろう。標準的な縫合糸で閉じます。シースのサイズは、選択したPACのサイズによって異なります。体重30〜40kgの豚では、6F導入者シース(長さ10cm)と長さ75cmの5F PACが一般的に使用される。
9. 侵襲的血圧モニタリングのために大腿動脈をカニューレクトする。
   1. 後肢のグラシリスとサルトリウス筋(左または右)の間の折り目を特定し、動脈線を配置する。
      注:大腿動脈の脈動は容易に触知可能であるべきである。
   2. セルディンガーテクニック⁹で動脈を経皮的にカンヌレートする。
   3. 動脈が容易に触診されない場合は、直接アプローチを使用してください。
      1. 長さ5cmの切開で皮膚を切り抜き、皮下組織を組織鉗子と手術用はさみで分離する。
      2. 筋肉間の筋膜を大腿動脈のレベルに分離する鈍いカットダウン手順を使用してください。
         注:D oそれらの切り捨て手順頭蓋を行うことによって、伏在血管を傷つけていない。
      3. 大腿動脈の周りに合字をループし、穿刺部位で出血した場合に血管を閉じることができるようにする。後ろ足への血流を損なうため、可能な限りこのステップは避けてください。
      4. セルディンガーテクニック⁹で動脈をカンニュレートします。
10. 大気(ゼロ)と200mmHg(動脈線)または50mmHg(中央静脈線)に対してトランスデューサを校正し、動脈カテーテルと中央静脈線に接続してモニタリングを開始します。
    1. 右心房の推定位置に胸郭の高さの約半分の高さの圧力トランスデューサを置きます。
11. 膀胱のカチラ化のために膀胱の上の皮膚を切り裂く小さな(4〜5cm)切開を行う。
    1. 鈍い器械を使用して皮下組織を分離する。
    2. 財布ひも縫合糸(直径1~2cm)を膀胱の壁に入れる。
       注:縫合糸は、穿刺を通して尿の損失をもたらす膀胱壁のすべての層を貫通すべきではありません。
    3. 縫合糸の途中で小さな切開を行い、尿カテーテルを導入します。
    4. すぐに、10 mLの蒸留水でバルーンをブロックし、カテーテルを膀胱壁に向かって引っ張り、耐光性が感じられるまで引っ張ります。
    5. カテーテルの周りの財布ひも縫合糸を閉じます。標準的な縫合糸を使用して皮膚を閉じます。

3. 肺動脈カテーテル(PAC)の導入

1. カテーテルの大きさに応じて、空気の0.5〜1 mLでPACのバルーンのステイシーを確認し、バルーンを再び収縮させます。
2. PACを圧力トランスデューサシステムに接続し、大気(ゼロ)と100 mmHgに対してトランスデューサを較正します。
3. 10-15 cmの膨らんだ気球(シースの長さによって異なる)との入装器の外装を通してPACを導入する。
   1. 外装後にバルーンを膨らませ、圧力と圧力モニタの典型的な波形を監視しながらPACをさらに前進させます。
   2. 右心房、右心室、肺動脈の典型的な波形が現れる間にPACを前方に押し出し、肺毛細管のくさび圧力(PCWP)波形が見られるとPACを進めるのをやめます。
   3. PCWP を終了期限切れに記録し、バルーンを収縮させます(それぞれのカーブについては 図 1 を参照)。
      注意:バルーンのデフレ後、PCWP波形が消え、肺動脈圧波形が見える必要があります。肺動脈圧波形が見えない場合、カテーテルは肺動脈に挿入されすぎて、自動くさび位置に達している可能性が最も高い。これは、肺血管の永久的な閉塞をもたらし、肺動脈圧波形が再び現れるまでカテーテルを引き戻すことによって修正しなければならない、例えば、肺血管¹⁰の破裂。PACカテーテルは、しばしば誤って豚の下の騎兵静脈を介して肝臓静脈に進行する。したがって、右心室の圧力信号が約30〜50cm後に到達しない場合は、カテーテルを引き戻し、最初からやり直します。

4. 血行力学的測定のための肺動脈熱希釈技術

1. 熱希釈技術¹¹を用いて心拍出量(CO)を測定する。
   1. PACのそれぞれのルーメンにハウジングを通してサーミスタと流れを接続します。
   2. 次に、血行力モニターを PAC の遠位温度ポート(赤キャップ)に接続します。
   3. 血行性モニターを、カテーテルのサイズ、カテーテルの長さ、注入された容積、および注入された生理食音溶液の温度に対する必要なモードの補償に合わせて調整します。
   4. 適切な量の0.9%生理液をできるだけ早く注入します(通常、5または10 mLの0.9%生理液量、温度4°C)。
   5. 測定が完了するまで待ちます。
2. 人工呼吸器の呼吸サイクルで5つの測定を立て続けにランダム化します。
   1. 最大値と最小値を削除し、残りの 3 つの値を使用して平均を計算します。
   2. この平均値は心拍出量として注意してください。
   3. その後、カテーテルバルーンを膨らませてPCWPを測定し、測定後に膨らまします。
   4. 平均動脈圧(MAP)、肺動脈圧(PAP)、中枢静脈圧(CVP)、PCWP、およびCOを使用して、さらにすべての血行力学的計算を行います。
      注:生理音の体積と温度は、測定前にモニタに入力する必要があります。正しい測定のために通常の生理食糸は同じ温度(通常<5°C)に保たれている。カテーテルのサイズと長さも入力する必要があります。一部のモニタでは、補正係数の入力が必要です。
   5. 電解質バランスの正確な測定を含む研究のために、0.9%生理食前の代わりに5%のグルコース溶液を使用してください。
3. すべてのパラメーターを記録するようにしてください。CO測定の直前または直後に同時に動脈と混合静脈血液サンプルを採取し、肺内右から左のシャントの計算を可能にする。
   1. ピーク、高原、終気圧など、データセットを完了するために必要なすべての呼吸設定と測定を記録します。
      注:麻酔、挿管、および完全な計装の誘導は、研究者の経験と数に応じて1.5時間を必要とする場合があります。

5. 界面活性剤の枯渇

1. 1.0のF_IO₂ で動物を換気します。
   1. 動物を人工呼吸器から取り外します。
2. 肺に前温0.9%の生理液(37°C、35 mL/kg)を気管内チューブに接続された漏斗で満たします。
   1. このために、動物の上に約1mの漏斗を上げます。
      注:静水圧は、すべての肺セクションに生理塩水を割り当てます。
   2. MAPが<50 mmHg以下に減少した場合は、すぐに充填を停止します。
3. 漏斗を地面に下げて、洗浄液を排出します。酸素を補給するために人工呼吸器に動物を再接続します。
4. 動物が回復するまで待ち、必要に応じてできるだけ早く洗浄を繰り返します。
   注: さらなる洗浄の必要性は、P_aO₂/F_IO₂ 比によって定義されます。
   1. 各洗浄に続いて5分後に動脈血液ガスサンプルを採取する。
   2. Pa O2/F_IO₂比(ホロウィッツ指数)がF_IO21.0で少なくとも5分間100mmHg以下になるまで溶出>繰り_{返します。}
      注:血行力低下を防ぐために、呼吸数は、7.25以上の動脈pHを維持するために、洗浄の期間中に調整する必要があります。
5. この動物モデルは界面活性剤の枯渇とVILIの組み合わせに基づいていることに注意してください。
   注:洗浄は、VilI 5を使用しない界面活性剤の洗浄のモデルのために以前に公開された60分後に、P_aO₂/ F_IO₂比が5分間100未満のままで、60分未満のままで止められる。
   1. ターゲット P a_O2 /F_IO₂に達した後の高いテレビ/低 PEEP 換気で開始します。
      注:さもなければ、VILIと組み合わせた過度に積極的な界面活性剤の枯渇は、多臓器不全をもたらし、実験を妥協する。界面活性剤の枯渇の持続時間は、定義された_PaO2/FI_O2が標的とされるので、動物間で異なる。45分から1.5時間かかる場合があります。

6. 高潮量/低ピープ(高テレビ/低ピープ)で有害な換気

1. 1.0 の F_IO₂ を保持します。
2. 換気装置を、気圧制御換気モードの音量保証に設定します。
3. ピーク吸気圧のアラームしきい値を 60 mbar に上げます。
   注:人工呼吸器は、最大60mbarの吸気圧力を加えるべきですが、高くはありません。
4. 呼吸数を12/分に下げ、1:1.5(2 sのインスピレーション時間と3 sの有効期限)に対して、そのインスピレーションを満了(I:E)比に設定します。
5. 潮量を少なくとも2分以上で17 mL/kg bwまでゆっくりと増やします。
   1. 60mbarの吸気圧に達した場合は、さらに潮量を増やさない。
      注:限られた吸気圧は、界面活性剤の洗浄後の肺損傷に応じて、17 mL /kg体重以下の潮量をもたらす可能性があります。急激な潮量の増加は、バロ外傷または血行力低下代償をもたらす可能性がある。したがって、数分間にわたって潮の量をゆっくりと増やすことが最も重要です。
6. 2 mbar に PEEP を減らします。
7. 動物を最大 2 時間換気します(換気装置の設定と流れカーブについては 図 2 を参照)。
   注:高潮量の換気は、動物の良好な酸素化をもたらすが、循環的なほぼ完全なインフレとデフレは、肺の構造的損傷をもたらす。採用工作、ポジショニング、高いPEEPなどでは構造的損傷を取り消すことはできません。結果として生じる傷害は、調査を通じて容認されなければならない。以下の実験と調査の期間によっては、より短い高いテレビ/低PEEP換気時間が必要な場合があります。

7. 実験終了と安楽死

1. 肺損傷の誘発に続く実験プロトコルのすべての測定が行われることを確認します。
2. フェンタニル(0.5mg以上)を続発麻酔に加えて注入し、少なくとも5分間待ちます。チオペンタール(少なくとも1000mg)を注入し、その後に中央線を使用して少なくとも60mmolのカリウムを迅速に注入する。

結果

P_aO₂/F_IO₂-全ての動物の界面活性剤洗浄中に比が低下した(図3)。結果として生じる低酸素血症、高カプ症、およびアテレタシスは肺動脈圧の増加を引き起こした。肺洗浄の詳細は、^{すでに他の}6に記載されています。

界面活性剤の枯渇は、少なくとも5 mbarのPEEPでの機械換気にもかかわらず_、Pa

ディスカッション

本稿では、繰り返し肺洗浄による界面活性剤の枯渇と高潮量、低いPEEP、肺の完全な膨張/デフレを組み合わせた豚における実験的ARDSの誘導について説明する。この組み合わせは、ガス交換の再現性と同等の悪化と結果として生じる血力学的妥協を引き起こすが、肺の採用可能性を制限する。したがって、このモデルは低い採用率の臨床ARDSを模倣し、新しい換気の体制の調査を可能にする。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Evita Infinity V500	Dräger		intensive care ventilator
Flow through chamber thermistor	Baxter	93-505	for measuring cardiac output
Leader Cath Set	Vygon	1,15,805	arterial catheter
Mallinckrodt Tracheal Tube Cuffed	Covidien	107-80	8.0 mm ID
MultiCath3	Vygon	1,57,300	3 lumen central venous catheter, 20 cm length
Percutaneus Sheath Introducer Set	Arrow	SI-09600	introducer sheath for pulmonary artery catheter of 4-6 Fr., 10 cm length
Swan-Ganz True Size Thermodilution Catheter	Edwards	132F5	pulmonary artery catheter, 75 cm length
urinary catheter			no specific model requiered
Vasofix Braunüle 20G	B Braun	4268113B	peripheral vein catheter
Vigilance I	Edwards		monitor