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摘要

在这里，我们通过探索利什曼原虫感染的树突状细胞迁移来研究利什曼原虫与宿主相互作用的意义。描述了树突状细胞的分化和感染、迁移分析以及粘附复合物和肌动蛋白动力学的评估。当感染利什曼原虫或其他细胞内寄生虫物种时，该方法可应用于其他宿主细胞迁移研究。

摘要

利什曼原虫 是一种细胞内原生动物寄生虫，可引起广泛的临床表现，从自消退的局部皮肤病变到高度致命的内脏疾病。据估计，全球目前有 1200 万人受到感染，另有 3.5 亿人面临感染风险。众所周知，被 利什曼原虫 寄生虫感染的宿主细胞（如巨噬细胞或树突状细胞）可以迁移到不同的宿主组织，但迁移如何促进寄生虫传播和归巢仍然知之甚少。因此，评估这些寄生虫调节宿主细胞反应、粘附和迁移的能力将阐明疾病传播和内脏化所涉及的机制。细胞迁移是一个复杂的过程，其中细胞经历极化和突出，使它们能够迁移。这个过程由肌动蛋白和基于微管蛋白的微管动力学调节，涉及不同的因素，包括细胞与底物粘附的调节。已经使用几个模型研究了细胞粘附和迁移过程。在这里，我们描述了一种表征 利什曼原虫 感染期间宿主细胞迁移方面的方法。该详细方案介绍了树突状细胞的分化和感染、宿主细胞运动和迁移的分析以及粘附复合物和肌动蛋白动力学的形成。该 体外 方案旨在进一步阐明利 什曼原虫 在脊椎动物宿主组织内传播的机制，也可以修改并应用于其他细胞迁移研究。

引言

利什曼病是一种被忽视的热带病，由属于利什曼原虫属的原生动物寄生虫引起，可导致广泛的临床表现，从自愈的局部皮肤病变到该病的致命内脏形式。据估计，每年出现多达 100 万例新的利什曼病病例，据报道，目前全球有 1200 万人感染1。内脏利什曼病 （VL） 如果不及时治疗，在 95% 以上的病例中可能是致命的，每年导致超过 50,000 人死亡，影响南美洲、东非、南亚和地中海地区的数百万人2。新世界 VL 的主要病原体婴儿利什曼原虫是通过受感染的雌性白蛉在采血过程中传播给人类的 3。这些寄生虫被吞噬细胞（例如巨噬细胞和树突状细胞）识别和内化 3,4,5。在这些细胞内，寄生虫分化成细胞内形式，称为无鞭毛细胞，然后繁殖并通过淋巴系统和血液运输到不同的宿主组织 6,7。然而，利什曼原虫寄生虫在脊椎动物宿主中传播的机制，以及宿主细胞迁移在此过程中的作用，仍不清楚。

细胞迁移是一个复杂的过程，由所有有核细胞（包括白细胞）执行8。根据细胞迁移的经典循环模型，这个过程涉及几个整合的分子事件，可以分为五个步骤：前沿突起;前缘与基体触点的粘附;细胞质收缩;细胞的后缘从接触部位释放;以及膜受体从细胞后部到前部的回收9。

为了发生细胞迁移，必须形成突起，然后通过附着在细胞外基质上来稳定。在参与促进细胞迁移的不同受体类型中，整合素是值得注意的。整合素激活导致迁移相关信号传导;然后通过黏着斑激酶 （FAK） 和 Src 家族激酶，以及 talin、vinculin 和 paxillin 分子提示 10,11,12 进行细胞内信号转导。桩蛋白被活化激酶（包括 FAK）磷酸化，导致效应分子的募集，从而转导促进细胞迁移的外部信号。已经表明桩蛋白是一种细胞内分子，对细胞粘附、肌动蛋白聚合和细胞迁移过程至关重要 13,14,15。

肌动蛋白细胞骨架在吞噬细胞的极化和迁移中起着核心作用16。在细胞迁移过程中，由于肌动蛋白聚合而形成的突起通过细胞粘附到细胞外基质上而变得稳定。这个过程可能受到与肌动蛋白细胞骨架相关的整合素受体的调节 17,18,19。几种肌动蛋白结合蛋白可调节细胞突起中肌动蛋白聚合的速率和组织20。研究表明，RhoA、Rac 和 Cdc42 在细胞外因子刺激贴壁细胞后调节肌动蛋白重组21,22。在迁移过程中，Rac1 和 Cdc42 位于细胞的前缘，分别控制板状伪足和丝状伪足的延伸，而位于细胞后部的 RhoA 调节肌动球蛋白细胞骨架的收缩 15,23,24,25。

研究表明，利什曼原虫感染可调节宿主细胞功能，例如粘附在细胞基质上和迁移 26,27,28,29,30,31。未成熟的 DC 存在于外周组织中;与 PAMPS 相互作用后，这些细胞被激活并迁移到引流淋巴结，促使抗原呈递给 T 细胞。先前使用小鼠模型的研究表明，亚马逊乳杆菌感染导致 DC 向引流淋巴结的迁移减少29。研究还证明，粘附过程的抑制减少了 30 型李斯特菌感染后的 DC 迁移。尽管如此，DC 迁移对寄生虫在宿主中传播的影响以及这一过程中涉及的机制仍然知之甚少。

在这里，我们提出了一个编译的分步方案，用于执行涉及利什曼原虫感染的人类 DC 的体外粘附和迁移测定。该方法不仅包括 DC 的分化和感染，还允许分析宿主细胞的运动和迁移、粘附复合物的形成以及肌动蛋白动力学。目前描述的体外方案允许研究人员进一步研究利什曼原虫在脊椎动物宿主组织内传播的机制，并且也可以进行作并应用于其他细胞迁移研究。

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研究方案

此处描述的程序已获得 Gonçalo Moniz 研究所机构审查委员会（IGM-FIOCRUZ，协议编号 2.751.345）的批准。血液样本来自健康的志愿捐献者。动物实验程序根据巴西法律 11.784/2008 通过的动物研究伦理原则进行，并获得了 Gonçalo Moniz 研究所动物研究伦理委员会（IGM-FIOCRUZ，协议编号 014/2019）的批准和许可。

1. 人树突状细胞的分离和分化

  1. 在 50 mL 离心管中吸取 10 mL 密度梯度培养基。
  2. 根据每个供体的样品标记 50 mL 试管。
  3. 从健康供体中收集 ~ 50 mL 静脉血，采集后，按照下述程序在流量柜中进行作。
  4. 小心地将收集的血液转移到离心管中，并在室温下以 1：1 的比例用盐水溶液（0.9% 氯化钠）稀释。
  5. 将稀释的血液慢慢覆盖在密度梯度培养基的顶部。
  6. 在室温下以 400 x g 离心含有血液和密度梯度培养基的试管 30 分钟。
    注意：离心前关闭制动器，以防止梯度层混合。第 1 次离心后，将离心机温度降至 4 °C。
  7. 小心地从离心机中取出试管。
  8. 识别样品中的外周血单核细胞 （PBMC） 环（血沉棕黄层）;用移液管轻轻去除残留的血浆。
    注：离心后，将形成以下梯度层：红细胞、密度梯度培养基、PBMC 环和血浆。PBMC 环位于密度梯度介质和血浆层之间。
  9. 将云状 PBMC 层转移到新试管中，并用生理盐水溶液将体积增加到 30 mL。
  10. 将含有细胞悬液的试管在 4 °C 下以 250 x g 离心 10 分钟。 弃去上清液，将沉淀重悬于 1 mL 盐水溶液中。
  11. 收集等分试样用于使用台盼蓝排除法进行细胞计数。首先，以 1：1,000 的比例稀释。然后，使用 10 μL 稀释的细胞进行台盼蓝染色，并使用 Neubauer 腔室对细胞进行计数以确定细胞活力。
  12. 在 4 °C 下再次以 200 x g 离心 10 分钟。
  13. 将沉淀重悬于 MACS 缓冲液中。每 1 x 107 个细胞使用 80 μL 缓冲液。
    注：MACS 缓冲液组成：制备含有磷酸盐缓冲盐水 （PBS）、pH 7.2、0.5% 牛血清白蛋白 （BSA） 和 2 mM EDTA 的溶液。用冲洗液以 1：20 的比例稀释缓冲溶液。保持缓冲液低温并储存在 2-8 °C。
  14. 将 CD14 微珠添加到步骤 1.13 中制备的细胞悬液中。每 1 x 107 个细胞使用 20 μL CD14 微珠。
    注：CD14 微珠用于从 PBMC 中对人单核细胞进行阳性选择，因为微珠与大多数单核细胞上表达的 CD14 阳性细胞结合。
  15. 使用移液管对含有沉淀和微珠的溶液进行均质化。在冰上保持 15 分钟。
  16. 将悬浮液在 4 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟。
  17. 在 MACS 缓冲液中重悬细胞。将 1-2 mL 用于细胞微珠混合物中的 1 x 107 个细胞。
  18. 将悬浮液在 4 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟。
  19. 吸出上清液并将沉淀重悬于 500 μL MACS 缓冲液中。
    注：这是可通过一根色谱柱处理的细胞悬液的最大体积。
  20. 组装磁柱。
  21. 加入 500 μL MACS 缓冲液洗涤色谱柱一次。让缓冲液在重力作用过色谱柱。
    注意：不要让色谱柱干燥，因为任何进入的空气都会阻碍色谱柱。
  22. 每根柱子加入 500 μL 步骤 1.19 中的细胞样品溶液。让细胞样品溶液在重力作用过色谱柱。
  23. 通过添加 500 μL MACS 缓冲液 （2x） 洗涤色谱柱。仅在色谱柱储液器为空时添加新鲜缓冲液。避免干燥。
  24. 将 1 mL 的 MACS 缓冲液移液到色谱柱上，并将其放入下面的新试管中。立即将柱塞用力推入柱中，冲洗出磁性标记的细胞。
  25. 将富含 CD14 的细胞在 4 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟。
  26. 使用 Neubauer 室计数细胞。
  27. 用白细胞介素-4 （IL-4） （100 μL/mL） + 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 （GM-CSF） （50 ng/mL） 将细胞重悬于 1 mL 完全 RPMI 中。
    注意：GM-CSF是由巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、内皮细胞和成纤维细胞分泌的细胞因子，可诱导骨髓中骨髓祖细胞的分化和增殖。GM-CSF 和 IL-4 用于诱导树突状细胞分化32。
  28. 将细胞以每孔 2 × 10 5个细胞的 浓度接种在 500 μL 含有 RPMI 的完全 RPMI 培养基中，并在 37 °C 的细胞培养箱中孵育细胞 7 天。

2. 婴儿利什曼原虫培养

注意： 婴儿利什曼原虫 （MCAN/BR/89/BA262） 寄生虫用于该测定。用 20 μL 含有 1 x 106 L 婴儿 前鞭毛体的无菌盐水溶液静脉感染仓鼠。1 至 2 个月后，对动物实施安乐死，从脾脏中恢复利 什曼原虫 的无鞭毛体形式并分化为前鞭毛体33。

  1. 在含有 3 mL Novy-Nicolle-MacNeal 培养基 （NNN） 和 5 mL 补充的最低必需培养基 （MEM） 的倾斜 25 cm2 细胞培养瓶中培养从先前感染的仓鼠脾脏中分离的婴儿李斯特菌前鞭毛体。
    注：在该测定中，MEM 培养基补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 24.5 nM 血红素牛。
  2. 在 BOD（生物需氧量）培养箱中于 24 °C 孵育 7 天。
  3. 将 100 μL 前鞭毛体培养物移液到含有 5 mL 补充 MEM 培养基的新 25 cm2 细胞培养瓶中。
  4. 在 BOD 培养箱中于 24 °C 孵育前鞭毛体培养物，直到前鞭毛体达到固定相。通过将用盐水稀释的寄生虫悬浮液的等分试样转移到 Neubauer 室（即血细胞计数器）中，定期计数培养的前鞭毛体，以确定生长的稳定期。
    注意：在 NNN 培养基中培养后，不建议使用首代寄生虫，以避免残留兔血痕迹。
  5. 将 1 x 105 婴儿李斯特菌 前鞭毛体的固定生长期培养物转移到新的 25 cm2 细胞培养瓶中，并加入 5 mL 补充 MEM 的培养基。
  6. 使用 Neubauer 室定期监测培养物的生长约 7 天，直到达到固定相。寄生虫现在可以用于实验性感染程序。
    注意：前鞭毛体培养物被认为在 体外 可感染多达 7 次;额外的传代可能会诱导毒力丧失。

3. 人树突状细胞感染

  1. 在生物层流柜内，将寄生虫培养瓶中的所有内容物转移到 50 mL 离心管中。
  2. 加入冷盐水溶液，最终体积为 40 mL。
  3. 在 4 °C 下以 1,600 xg 离心 10 分钟。
  4. 离心后弃去上清液，将沉淀重悬于 1 mL 冷盐水溶液中（重复步骤 3.3-3.4 3 次）。
  5. 洗涤细胞以去除任何无活力的寄生虫后，将沉淀重悬于 1 mL 冷盐水溶液中。
  6. 将内容物缓慢地通过带有 1 G 针头的 1 mL 注射器 5 次，以分离寄生虫簇。
  7. 取出等分试样以确定血细胞计数器中的寄生虫浓度（计算 4 个象限中寄生虫的平均数量 x 稀释因子 x 104）。
  8. 通过加入 1 mL 盐水溶液并在室温下以 300 x g 离心细胞 10 分钟（3 次）来洗涤树突状细胞。
  9. 计算实验性感染所需的 婴儿乳杆菌 数量;比例：每个细胞 20 个寄生虫。
  10. 将所需体积的 婴儿乳杆菌 放入细胞培养板的每个孔中。
  11. 将树突状细胞与寄生虫在 37 °C 的培养箱中，在 5% CO2 下孵育 4 小时。
  12. 在步骤 3.11 之后，在 4 °C 下以 300 x g 离心板 10 分钟。

4. 使用细胞培养小室进行迁移检测

  1. 感染后，在室温下用 1 mL 盐水溶液洗涤树突状细胞（感染或未感染）3 次，以去除未内化的寄生虫。每次洗涤后，将板在 4 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟。
  2. 去除未内化的寄生虫后，通过在每个孔中加入 200 μL 细胞解离试剂来分离细胞并孵育 15 分钟。将细胞保存在 37 °C 和 5% CO2 的培养箱中。
  3. 使用 1,000 μL 移液器吸头对细胞进行匀浆，使细胞松动。
  4. 将解离的细胞转移到 50 mL 离心管中。
  5. 在 4 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟。
  6. 将沉淀重悬于 1 mL 补充有 10% FBS 的 RPMI 培养基中。
  7. 将每管内容物缓慢地通过带有 25 G 针头的 1 mL 注射器 5 次以分离细胞。
  8. 取出等分试样，使用台盼蓝稀释，以使用血细胞计数器测定细胞浓度（稀释因子× 104 的 4 个象限中活细胞的平均值× 4）。
  9. 细胞培养微孔板小室的制备：
    注：建议使用树突状细胞、巨噬细胞和单核细胞进行迁移测定，因为这些插入片段允许吞噬细胞穿过膜。
    1. 用无菌镊子取出插入物并放入空孔中。
    2. 向每个孔中加入 600 μL 补充有 10% FBS 的 RPMI 培养基;添加趋化因子趋化因子 （C-C 基序） 配体 3 （CCL3）（每 1 mL 培养基 1 μL）。
      注意：CCL3 是一种调节 DC 迁移34 的趋化因子。
    3. 使用无菌镊子，将插入物放入含有培养基的孔中。
  10. 向每个插入片段中加入 100 μL 培养基中的 2 x 105 个树突状细胞（感染或未感染）。
  11. 孵育 4 小时，让细胞迁移。
  12. 4 小时后，取出板并吸出培养基。加入 100 μL 4% 多聚甲醛并孵育 15 分钟。
  13. 去除多聚甲醛并加入 100 μL 生理盐水溶液。
    注意：板可以保持在 4 °C 以备以后组装。
  14. 从插入物或孔中收集上清液，以分别计数非迁移细胞或穿过膜的细胞。与 4% 多聚甲醛孵育 15 分钟。
  15. 使用细胞离心技术浓缩细胞35.
  16. 向膜中加入 10 μL 含 DAPI 的封固剂，并将盖玻片盖在孔上。
  17. 插入膜的组装。
    注意：此步骤可以在生物安全柜外进行。
    1. 从孔中取出插入膜。
    2. 用棉签刮擦插入物的表面以去除任何尚未迁移的细胞。
    3. 使用手术刀从插入物上去除膜。
    4. 将膜放在载玻片上，细胞朝上。
    5. 向每个膜中加入 10 μL 含 DAPI 的封固剂，然后放置覆盖盖玻片。
    6. 用铝箔盖板。
    7. 在室温下孵育板 30 分钟，然后在 -20 °C 下储存
  18. 为了分析细胞迁移，使用荧光显微镜在 405 nm 的激光激发波长下计数每个视野（不少于 10 个视野）的细胞数量。

5. 免疫荧光肌动蛋白聚合的粘附测定和评估

注：对于此测定，请使用带盖玻片的 24 孔板。

  1. 感染细胞 4 小时后，在室温下用无菌盐水溶液洗涤每个孔 3 次，以去除任何未内化的寄生虫。
  2. 在 4°C 下以 300 x g 离心板 10 分钟。 向每个孔中加入 500 μL 4% 多聚甲醛 15 分钟。
  3. 去除多聚甲醛并加入 1 mL 盐水溶液。
  4. 如 表 1 所述准备溶液。
主要解决方案化合物稀释剂
氯化铵溶液0,134 克 NH4Cl50 毫升 PBS 1X
皂苷 15%150 毫克皂苷1 mL de PBS 1X
牛血清白蛋白 （ABS） 10%1 克 ABS10 mL PBS 1X
次要解决方案组件 1组件 2组件 3
皂苷 0.15%1mL 皂苷 15%100 mL PBS 1X-
PBS 1X / ABS 3% / 皂苷 0.15%13.8 mL PBS 1X6 mL ABS 10%200 μL 皂苷 15%
PBS1X / ABS 0.3% / 皂苷 0.15%：19.2 mL PBS 1X0.6 mL ABS 10%200 μL 皂苷 15%
PBS 1X / ABS 1% / 皂苷 0.15%17.8 mL PBS 1X2 mL ABS 10%200 μL 皂苷 15%

表 1：缓冲液配方。

  1. 免疫染色
    注意： 以下步骤必须在搅拌下进行。
    1. 用 1x PBS 洗涤盖玻片 3 次，每次 5 分钟。
    2. 每孔加入 500 μL 氯化铵溶液，持续 10 分钟。
    3. 用 1x PBS 洗涤盖玻片 3 次，每次 5 分钟。
    4. 用 0.15% 皂苷透化膜 15 分钟。
    5. 将细胞与封闭溶液（PBS 1x / ABS 3% / 皂苷 0.15%）孵育 1 小时。
    6. 用 PBS 1x/0.15% 皂苷洗涤盖玻片 3 次，持续 5 分钟。
    7. 在 PBS 1x/ABS 1%/皂苷 0.15% 中稀释一抗为：兔抗 FAK （pTyr397）：1：500 稀释，兔抗 paxilin （pTyr118）：1：100 稀释。小鼠抗 Rac1：100 稀释。兔抗 CDC42：1：200 稀释。兔抗 RhoA：1：200 稀释。
    8. 将细胞与在 PBS 1x/ABS 1%/0.15% 皂苷中稀释的一抗孵育 1 小时。
      注意：FAK 和 Paxillin 是参与粘附复合物形成的关键分子 13,14,15。Rho GTP 酶家族负责肌动蛋白细胞骨架的组织。位于细胞前缘的 RAC1 和 Cdc42 分别控制板状伪足和丝状伪足的形成;RhoA 位于细胞后部，参与细胞骨架收缩15、23、24、25。
    9. 用 1x PBS/0.15% 皂苷洗涤盖玻片 3 次，持续 5 分钟。
    10. 按如下方式稀释二抗或鬼笔环肽：抗兔 IgG，Alexa Fluor 568：1：500 稀释度;抗小鼠 IgG，Alexa Fluor 488：1：500 稀释度;抗小鼠 IgG，Alexa Fluor 594：1：500 稀释度;鬼笔环肽 Alexa Fluor 488：1：1200 稀释度。
    11. 将细胞与用 1x PBS/ABS 0.3% 皂苷 0.15% 稀释的二抗或鬼笔环肽孵育 45 分钟。
      注：二抗或鬼笔环肽的孵育应在无光下进行。在以下步骤中，用铝箔盖板以避光。
    12. 用 1x PBS 洗涤盖玻片 3 次，每次 5 分钟。
    13. 从孔中取出盖玻片。
    14. 在没有光线的情况下，将 10 μL 含 DAPI 的封固剂添加到干净的显微镜载玻片上。
    15. 将盖玻片置于细胞朝下，以允许细胞与 DAPI 溶液接触。
      注意：用铝箔盖住载玻片以避光。
    16. 在室温下孵育 30 分钟。
    17. 储存在 -20 °C。

6. 使用 FIJI 进行共聚焦显微镜、图像采集和定量

注意：要获取/捕获免疫荧光图像，请使用共聚焦激光扫描显微镜。建议使用油浸式 63 倍物镜以获得最佳分辨率。

  1. 在图像采集前，让盖玻片避光至室温至少 30 分钟。
  2. 用吸收纸巾清洁盖玻片。
  3. 在物镜中加入一滴浸油，然后将每张载玻片置于显微镜下。
  4. 移动物镜，直到油接触到载玻片。
  5. 观察和调整显微镜焦距;选择 含油的 63x 物镜。
  6. 打开 488 nm、552 nm 和 405 nm 波长的激光器。
  7. 选择图像分辨率： 1024 x 1024。
  8. 点击 Live 按钮，设置 Z 堆栈，然后按 Begin。重复该过程，然后按 End。
  9. 在 Tool 菜单中选择 Maximum Projection 选项后，等待获取图像。
  10. 保存 实验。
  11. 在计算机上以 .lif 格式导出图像。使用 FIJI 开源图像分析软件分析图像。
  12. 选择要分析的图像，然后选择 Duplicate Image。
  13. 要使图像为灰度，请选择 图像 |Adjust |颜色阈值。选择 0 和 255 （饱和度）。
  14. 选择阈值方法： Default。
  15. 选择阈值颜色： B 和 W （黑色和白色）。
  16. 不要选择 Dark background（深色背景）。
  17. 选择： 流程 |二进制 |选项 ，然后选择要测量的相关数据： 面积、最小值、最大值、灰度值、积分密度。
  18. 在 Fiji 工具栏中选择 free hands' 工具，然后仔细手动跟踪每个单元格。
  19. 从 Analyze （分析 ） 菜单中，选择 Set measurements （设置测量值）。确保选中 Area Integrated Intensity （面积积分强度） 和 Average gray value （平均灰度值）。对每个单元格重复此过程。
  20. 在 Results （结果） 窗口中选择所有数据，然后复制并粘贴到电子表格文件中。
  21. 计算校正后的总细胞荧光 （CTCF）：CTCF（积分密度 = 所选细胞的面积 x 背景读数的平均荧光）。
  22. 使用统计分析软件打开包含数据的文件，进行统计分析。

7. 统计分析

  1. 在出现欢迎对话框时打开 New Project 。
  2. 使用 SD 选择图表类型和媒介。
  3. 将从实验结果中获得的值应用于表中。
  4. 选择 Descriptive Statistics 并选择选项 Statistics [all tests] 列以分析数据分布。
  5. 如果数据服从高斯分布，请选择 t 检验，通过比较两对来分析样本。如果分布是非高斯分布，则使用 Mann-Whitney 检验分析数据。
  6. 选择最佳图形选项以实现最佳数据表示。

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结果

本文描述的该方案能够评估细胞迁移及其相关机制，例如肌动蛋白动力学和粘附，从而提供了一种工具来确定利 什曼原虫感染的宿主细胞在脊椎动物宿主内的迁移。此处介绍的结果表明，这种 体外 测定可在 体内 实验之前快速一致地指示细胞粘附、迁移和肌动蛋白动力学的变化。

首先，按照无菌技术和实验室方案成功培养细胞?...

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讨论

此处描述的使用细胞培养膜插入系统评估细胞迁移的方法允许研究人员在二维环境中研究细胞的迁移反应。在这种技术中，某些步骤被认为是关键的。首先，人类 DC 的分化和利 什曼原虫 感染是决定性的，因为感染率取决于供体。每个实验使用多个供体和健康的 利什曼原虫 培养物将获得更一致的结果。寄生虫在宿主动物中维持也很重要，这有利于毒力菌株?...

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披露声明

作者声明他们没有相互竞争的经济利益。

致谢

这项工作得到了 Bahia 研究支持基金会 （Fapesb） 的支持，资助号 9092/2015。作者感谢 CNPq、Capes 和 Fapesb 通过奖学金提供的经济支持。作者感谢 Andris K. Walter 的批判性分析、英语语言修订和手稿编辑帮助。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
16 Gauge needleDescarpack353101
24 well cell culture plateJET-BIOFILJ011024
25 Gauge needleDescarpack353601
Albumin from bovine serumSigma AldrichA2153-100G
Ammonium chlorideSigma AldrichA-0171
Anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488InvitrogenA32723
Anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594InvitrogenA11032
Anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 568InvitrogenA11011
CD14 MicroBeadsMACS Myltenyi Biotec130-050-201
Cell Culture Flask 25cm2SPL70125
CellstripperCorning25-056-CI
Confocal microscopeLeicaTCS SP8
Coverslip circles 13mmPerfecta10210013CE
Dissecting ForcepsVWR82027-406
EDTASigma AldrichE6758
Falcon tubeKASVIK19-0051
Fetal Bovine Serumgibco16000044
Fluorescence microscopeOlympus BX51
Glass slide  25,4x76,2mmPerfecta200
Hemin bovineSigma AldrichH2250
HemocytometerPerfecta7302HD
Histopaque® 1077Sigma Aldrich10771
MACS bufferMACS Myltenyi Biotec130-091-221
Minimum Essential MediumGibco41090093
Mouse anti-Rac1BD610650
ParaformaldehydeSigma Aldrich158127
Phalloidin Alexa Fluor 488InvitrogenA12379
Phosphate Buffered SalineThermoFisherAM9624
Polycarbonate Membrane Transwell Inserts - Pore size 5.0 µmCorning3421
ProLong Gold DAPI kitInvitrogenP36931
Rabbit anti-Cdc42InvitrogenPA1-092X
Rabbit anti-FAK (pTyr397)InvitrogenRC222574
Rabbit anti-paxilin (pTyr118)InvitrogenQF221230
Rabbit anti-RhoAInvitrogenOSR00266W
Recombinant Human CCL3R&D Systems270-LD-010
Recombinant Human GM-CSFPeproTech300-03
Recombinant Human IL-4PeproTech200-04
Recombinant Human M-CSFPeproTech300-25
RPMI 1640 MediumGibco21870076
SaponinSigma Aldrich47036 – 50G – F
Syringe 3 mLDescarpack324201
Trypan BlueGibco15250061

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