JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, Leishmania ile enfekte olmuş dendritik hücre göçünü keşfederek Leishmania-konak etkileşiminin etkilerini inceliyoruz. Dendritik hücrelerin farklılaşması ve enfeksiyonu, migrasyon analizi ve adezyon komplekslerinin ve aktin dinamiklerinin değerlendirilmesi açıklanmaktadır. Bu yöntem, Leishmania veya diğer hücre içi parazit türleri ile enfekte olduğunda diğer konak hücre göçü çalışmalarına uygulanabilir.

Özet

Leishmania , kendiliğinden çözünen lokalize kutanöz lezyonlardan hastalığın oldukça ölümcül bir viseral formuna kadar geniş bir klinik belirti spektrumuna neden olan hücre içi bir protozoan parazittir. Dünya çapında tahminen 12 milyon insan şu anda enfekte ve 350 milyon kişi de enfeksiyon riskiyle karşı karşıya. Makrofajlar veya dendritik hücreler gibi Leishmania parazitleri tarafından enfekte olan konak hücrelerin farklı konakçı dokulara göç edebileceği bilinmektedir, ancak göçün parazit yayılımına ve hedef arama işlemine nasıl katkıda bulunduğu tam olarak anlaşılamamıştır. Bu nedenle, bu parazitlerin konak hücre tepkisini, adezyonunu ve göçünü modüle etme yeteneğinin değerlendirilmesi, hastalığın yayılması ve içselleştirilmesi ile ilgili mekanizmalara ışık tutacaktır. Hücresel göç, hücrelerin polarizasyona ve çıkıntıya maruz kalarak göç etmelerine izin verdiği karmaşık bir süreçtir. Aktin ve tübül bazlı mikrotübül dinamikleri tarafından düzenlenen bu süreç, substrata hücresel yapışmanın modülasyonu dahil olmak üzere farklı faktörleri içerir. Hücresel adezyon ve migrasyon süreçleri çeşitli modeller kullanılarak araştırılmıştır. Burada, Leishmania enfeksiyonu sırasında konakçı hücrelerin göç yönlerini karakterize etmek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu ayrıntılı protokol, dendritik hücrelerin farklılaşmasını ve enfeksiyonunu, konak hücre motilitesinin ve göçünün analizini ve adezyon komplekslerinin ve aktin dinamiklerinin oluşumunu sunar. Bu in vitro protokol, omurgalı konakçı dokularında Leishmania yayılımında yer alan mekanizmaları daha fazla aydınlatmayı amaçlar ve ayrıca değiştirilebilir ve diğer hücre göçü çalışmalarına uygulanabilir.

Giriş

Leishmania cinsine ait protozoan parazitlerin neden olduğu ihmal edilmiş tropikal bir hastalık olan Leishmaniasis, kendi kendini iyileştiren lokalize kutanöz lezyonlardan hastalığın ölümcül viseral formlarına kadar geniş bir klinik belirti spektrumu ile sonuçlanır. Yılda bir milyona kadar yeni leishmaniasis vakasının ortaya çıktığı tahmin edilmektedir ve şu anda dünya çapında 12 milyon insanın enfekte olduğu bildirilmiştir1. Tedavi edilmediğinde vakaların %95'inden fazlasında ölümcül olabilen visseral leishmaniasis (VL), yılda 50.000'den fazla ölüme neden olarak Güney Amerika, Doğu Afrika, Güney Asya ve Akdeniz bölgesinde milyonlarca kişiyi etkilemektedir2. Yeni dünyada VL'nin ana etiyolojik ajanı olan Leishmania infantum, kanla beslenme sırasında enfekte dişi kum sinekleri tarafından insanlara bulaşır3. Bu parazitler, örneğin makrofajlar ve dendritik hücrelergibi fagositler tarafından tanınır ve içselleştirilir 3,4,5. Bu hücrelerin içinde parazitler, amastigotlar olarak bilinen hücre içi formlarına farklılaşır ve bunlar daha sonra çoğalır ve lenfatik sistem ve kan dolaşımı yoluyla farklı konakçı dokularataşınır 6,7. Bununla birlikte, Leishmania parazitlerinin omurgalı konakçıda yayıldığı mekanizmalar ve bu süreçte konak hücre göçünün oynadığı rol belirsizliğini korumaktadır.

Hücre göçü, lökositler8 dahil olmak üzere tüm çekirdekli hücreler tarafından yürütülen karmaşık bir süreçtir. Hücre göçünün klasik döngü modeline göre, bu süreç beş adıma ayrılabilen birkaç entegre moleküler olayı içerir: öncü çıkıntı; ön kenarın matris kontaklarına yapışması; hücresel sitoplazmanın kasılması; hücrenin arka kenarının temas bölgelerinden serbest bırakılması; ve zar reseptörlerinin hücrenin arkasından önüne geri dönüşümü9.

Hücre göçünün gerçekleşmesi için, çıkıntılar oluşturulmalı ve daha sonra hücre dışı matrise bağlanma yoluyla stabilize edilmelidir. Hücre göçünün teşvikinde rol oynayan farklı reseptör tipleri arasında, integrinler dikkat çekicidir. İntegrin aktivasyonu, göçle ilgili sinyalizasyona neden olur; hücre içi sinyalleşme daha sonra talin, vinkülin ve paxillin molecues'e ek olarak fokal adezyon kinaz (FAK) ve Src ailesi kinazları yoluyla gerçekleşir 10,11,12. Paxillin'in FAK dahil olmak üzere aktive edilmiş kinazlar tarafından fosforilasyonu, hücre göçünü tetikleyen dış sinyalleri ileten efektör moleküllerin işe alınmasına yol açar. Paxillin'in hücre yapışması, aktin polimerizasyonu ve hücre göçü süreçleri için çok önemli olan hücre içi bir molekül olduğu gösterilmiştir 13,14,15.

Aktin hücre iskeleti, fagositlerin16 polarizasyonunda ve göçünde merkezi bir rol oynar. Hücre göçü işlemi sırasında, aktin polimerizasyonuna bağlı olarak oluşan çıkıntılar, hücrenin hücre dışı matrise yapışması yoluyla stabilize olur. Bu işlem, aktin hücre iskeleti 17,18,19 ile ilişkili integrin reseptörleri tarafından modüle edilebilir. Çeşitli aktin bağlayıcı proteinler, hücresel çıkıntılarda aktin polimerizasyonunun hızını ve organizasyonunu düzenler20. Çalışmalar, RhoA, Rac ve Cdc42'nin, yapışık hücrelerin hücre dışı faktörler tarafından uyarılmasından sonra aktin yeniden organizasyonunu düzenlediğini göstermiştir21,22. Göç sırasında, Rac1 ve Cdc42, hücrenin ön kenarında bulunur ve sırasıyla lamellipodia ve filopodia'nın uzantısını kontrol ederken, hücrenin arkasında bulunan RhoA, aktomiyosin hücre iskeletinin kasılmasını düzenler 15,23,24,25.

Çalışmalar, Leishmania enfeksiyonunun hücresel substrata yapışma ve göç gibi konak hücre fonksiyonlarını modüle ettiğini göstermiştir 26,27,28,29,30,31. Olgunlaşmamış DC'ler periferik dokularda bulunur; PAMPS ile etkileşime girdikten sonra, bu hücreler aktive olur ve boşalan lenf düğümlerine göç ederek T hücrelerine antijen sunumuna neden olur. Bir fare modeli kullanılarak yapılan önceki bir çalışma, L. amazonensis enfeksiyonunun, DC'lerin drenaj lenf düğümlerine göçünde bir azalmaya neden olduğunu göstermiştir29. Yapışma sürecinin inhibisyonunun L. major30 ile enfeksiyondan sonra DC göçünü azalttığı da gösterilmiştir. Bununla birlikte, DC göçünün konakçıda parazit yayılımı üzerindeki etkisi ve bu süreçte yer alan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır.

Burada, Leishmania ile enfekte olmuş insan DC'lerini içeren bir in vitro yapışma ve migrasyon testi gerçekleştirmek için derlenmiş bir adım adım protokol sunuyoruz. Bu yöntem sadece DC'lerin farklılaşmasını ve enfeksiyonunu içermekle kalmaz, aynı zamanda konak hücre motilitesi ve göçünün, adezyon komplekslerinin oluşumunun yanı sıra aktin dinamiklerinin analizine de izin verir. Şu anda tarif edilen in vitro protokol, araştırmacıların omurgalı konakçı dokularında Leishmania yayılımında yer alan mekanizmaları daha fazla araştırmalarına olanak tanır ve ayrıca manipüle edilebilir ve diğer hücre göçü çalışmalarına uygulanabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Burada açıklanan prosedürler, Gonçalo Moniz Enstitüsü Kurumsal İnceleme Kurulu (IGM-FIOCRUZ, protokol no. 2.751.345) tarafından onaylanmıştır. Sağlıklı gönüllü donörlerden kan örnekleri alındı. Hayvan deney prosedürleri, Brezilya'nın 11.784/2008 sayılı yasası tarafından kabul edilen Hayvan Araştırmalarında Etik İlkelere uygun olarak yürütülmüş ve Gonçalo Moniz Enstitüsü Hayvan Araştırmaları Etik Komitesi (IGM-FIOCRUZ, protokol no. 014/2019) tarafından onaylanmış ve lisanslanmıştır.

1. İnsan dendritik hücrelerinin izolasyonu ve farklılaşması

  1. 50 mL'lik santrifüj tüplerinde 10 mL yoğunluk gradyan ortamını pipetleyin.
  2. 50 mL'lik tüpleri her donörün örneğine göre etiketleyin.
  3. Sağlıklı donörlerden ~ 50 mL venöz kan toplayın ve topladıktan sonra akış kabininde aşağıda açıklanan prosedürleri izleyin.
  4. Toplanan kanı dikkatlice santrifüj tüplerine aktarın ve oda sıcaklığında 1: 1 oranında tuzlu su çözeltisi (% 0.9 sodyum klorür) içinde seyreltin.
  5. Seyreltilmiş kanı yoğunluk gradyan ortamının üzerine yavaşça yerleştirin.
  6. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 400 x g'da kan ve yoğunluk gradyan ortamını içeren santrifüj tüpleri.
    NOT: Degrade katmanların karışmasını önlemek için santrifüjlemeden önce freni kapatın. 1. santrifüjlemeden sonra santrifüj sıcaklığını 4 °C'ye düşürün.
  7. Tüpleri santrifüjden dikkatlice çıkarın.
  8. Numunedeki periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC) halkasını tanımlayın (buffy coat); Kalan plazmayı bir pipetle nazikçe çıkarın.
    NOT: Santrifüjlemeden sonra, aşağıdaki gradyan katmanları oluşmuş olacaktır: eritrositler, yoğunluk gradyan ortamı, PBMC halkası ve plazma. PBMC halkası, yoğunluk gradyan ortamı ve plazma katmanları arasında bulunur.
  9. Bulut benzeri PBMC katmanını yeni bir tüpe aktarın ve tuzlu su çözeltisi ile hacmi 30 mL'ye getirin.
  10. Hücre süspansiyonu içeren tüpleri 250 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti 1 mL tuzlu su çözeltisi içinde yeniden süspanse edin.
  11. Tripan mavisi dışlama yöntemiyle hücre sayımı için bir alikot toplayın. İlk olarak, 1: 1.000 oranında seyreltin. Daha sonra, tripan mavisi boyama için 10 μL seyreltilmiş hücre kullanın ve hücre canlılığını belirlemek için bir Neubauer odası kullanarak hücreleri sayın.
  12. 4 ° C'nin altında 10 dakika boyunca 200 x g'da tekrar santrifüjleyin.
  13. Peleti MACS tamponunda yeniden askıya alın. Her 1 x 107 hücre için 80 μL tampon kullanın.
    NOT: MACS tampon bileşimi: Fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.2, %0.5 sığır serum albümini (BSA) ve 2 mM EDTA içeren bir çözelti hazırlayın. Tampon çözeltisini durulama çözeltisi ile 1:20 oranında seyreltin. Tamponu soğuk tutun ve 2-8 °C'de saklayın.
  14. Adım 1.13'te hazırlanan hücre süspansiyonuna CD14 mikro boncukları ekleyin. Her 1 x 107 hücre için 20 μL CD14 mikro boncuk kullanın.
    NOT: CD14 mikro boncukları, boncuklar çoğu monosit üzerinde eksprese edilen CD14 pozitif hücrelere bağlandığından, PBMC'lerden insan monositlerinin pozitif seçimi için kullanılır.
  15. Pelet ve mikro boncukları içeren çözeltiyi bir pipet kullanarak homojenize edin. 15 dakika buz üzerinde tutun.
  16. Süspansiyonu 300 °C'nin altında 10 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
  17. MACS arabelleğindeki hücreleri yeniden askıya alın. Hücre mikroboncuk karışımındaki 1 x 107 hücre için 1-2 mL kullanın.
  18. Süspansiyonu 300 °C'nin altında 10 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
  19. Süpernatanı aspire edin ve peleti 500 μL MACS tamponunda yeniden süspanse edin.
    NOT: Bu, bir sütun aracılığıyla işlenebilecek maksimum hücre süspansiyonu hacmidir.
  20. Manyetik sütunu monte edin.
  21. 500 μL MACS tamponu ekleyerek kolonu bir kez yıkayın. Tamponun kolon boyunca yerçekimi altında akmasına izin verin.
    NOT: Kolonun kurumasına izin vermeyin, çünkü giren herhangi bir hava kolonu tıkayabilir.
  22. Sütun başına adım 1.19'dan itibaren 500 μL hücre numune çözeltisi ekleyin. Hücre numunesi çözeltisinin kolon boyunca yerçekimi altında akmasına izin verin.
  23. 500 μL MACS tamponu (2x) ekleyerek kolonu yıkayın. Yeni tamponu yalnızca sütun rezervuarı boşken ekleyin. Kurutmaktan kaçının.
  24. 1 mL MACS tamponunu kolonun üzerine pipetleyin ve altındaki yeni bir tüpe yerleştirin. Pistonu kolona sıkıca iterek manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri hemen yıkayın.
  25. CD14 ile zenginleştirilmiş hücreleri 300 x g'da 4 ° C'nin altında 10 dakika santrifüjleyin.
  26. Bir Neubauer odası kullanarak hücreleri sayın.
  27. İnterlökin-4 (IL-4) (100 μL/mL) + granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) (50 ng/mL) ile 1 mL tam RPM'de hücreleri yeniden süspanse edin.
    NOT: GM-CSF, kemik iliğindeki miyeloid progenitörlerin farklılaşmasını ve çoğalmasını indükleyen makrofajlar, T hücreleri, mast hücreleri, doğal öldürücü hücreler, endotel hücreleri ve fibroblastlar tarafından salgılanan bir sitokindir. GM-CSF ve IL-4, dendritik hücre farklılaşmasını indüklemek için kullanılır32.
  28. 500 μL'lik tam RPMI ortamı içeren kuyu başına 2 × 105 hücre konsantrasyonunda 24 oyuklu bir plakadaki tohum hücreleri ve hücreleri 37 ° C'de hücre kültürü inkübatöründe 7 gün boyunca inkübe edin.

2. Leishmania infantum yetiştiriciliği

NOT: Bu testte Leishmania infantum (MCAN/BR/89/BA262) parazitleri kullanılmaktadır. Hamsterler, steril salin içinde 1 x 106 L. infantum promastigot içeren 20 μL solüsyon ile intravenöz olarak enfekte edildi. 1 ila 2 ay sonra, hayvanlara ötenazi yapıldı ve Leishmania'nın amastigot formları dalaklarından çıkarıldı ve promastigotlara farklılaştırıldı33.

  1. Daha önce enfekte olmuş hamster dalaklarından izole edilen L. infantum promastigotları, 3 mL Novy-Nicolle-MacNeal ortamı (NNN) ve 5 mL takviye edilmiş Minimum Esansiyel Ortam (MEM) içeren eğimli 25cm2 hücre kültürü şişesinde büyütün.
    NOT: Bu testte, MEM ortamı% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve 24.5 nM hemin sığır ile desteklenmiştir.
  2. BOİ (Biyo-Oksijen İhtiyacı) inkübatöründe 24 °C'de 7 gün inkübe edin.
  3. 100 μL promastigot kültürünü, 5 mL takviye edilmiş MEM ortamı içeren yeni bir 25cm2 hücre kültürü şişesine pipetleyin.
  4. Promastigot kültürünü, promastigotlar durağan faza ulaşana kadar BOİ inkübatörde 24 ° C'de inkübe edin. Büyümenin durağan fazını belirlemek için tuzlu su içinde seyreltilmiş bir parazit süspansiyonu alikotunu bir Neubauer odasına (yani hemositometre) aktararak kültürlenmiş promastigotları periyodik olarak sayın.
    NOT: Tavşan kanı kalıntılarını önlemek için NNN ortamında ekimden sonra ilk geçiş parazitlerinin kullanılması önerilmez.
  5. L. infantum promastigotes'un 1 x 105 sabit büyüme fazı kültürünü yeni bir 25cm2 hücre kültürü şişesine aktarın ve 5 mL MEM takviyeli ortam ekleyin.
  6. Durağan faz elde edilene kadar bir Neubauer odası kullanarak kültürün büyümesini yaklaşık 7 gün boyunca periyodik olarak izleyin. Parazitler artık deneysel enfeksiyon prosedürlerinde kullanıma hazırdır.
    NOT: Promastigot kültürleri, in vitro olarak 7 pasaja kadar enfeksiyon için uygun kabul edilir; ek pasajlar virülans kaybına neden olabilir.

3. İnsan dendritik hücre enfeksiyonu

  1. Biyolojik bir laminer akış kabini içinde, parazit kültürü şişesindeki tüm içeriği 50 mL santrifüj tüplerine aktarın.
  2. 40 mL'lik son hacme soğuk tuzlu su çözeltisi ekleyin.
  3. 4 ° C'nin altında 10 dakika boyunca 1.600 xg'da santrifüjleyin.
  4. Santrifüjlemeden sonra süpernatanı atın ve peleti 1 mL soğuk tuzlu su çözeltisinde yeniden süspanse edin (3.3-3.4 adımlarını üç kez tekrarlayın).
  5. Canlı olmayan parazitleri gidermek için hücreleri yıkadıktan sonra, peleti 1 mL soğuk tuzlu su çözeltisinde yeniden süspanse edin.
  6. Parazit kümelerini ayırmak için içeriği 16 G'lık bir iğne ile 1 mL'lik bir şırıngadan 5 kez yavaşça geçirin.
  7. Bir hemositometredeki parazit konsantrasyonunu belirlemek için bir alikotu çıkarın (4 kadran x seyreltme faktörü x 10,4'teki ortalama parazit sayısını hesaplayın).
  8. Dendritik hücreleri 1 mL tuzlu su çözeltisi ekleyerek ve hücreleri 300 x g'da oda sıcaklığında 10 dakika (3 kez) santrifüjleyerek yıkayın.
  9. Deneysel enfeksiyon için gerekli olan L. infantum miktarını hesaplayın; Oran: Hücre başına 20 parazit.
  10. Gerekli hacimde L. infantum'u hücre kültürü plakalarının her bir oyuğuna yerleştirin.
  11. Dendritik hücreleri parazitlerle birlikte 37 ° C'de 37 ° C'de% 5 CO2 altında inkübe edin.
  12. Adım 3.11'den sonra, plakaları 4 °C'nin altında 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.

4. Hücre kültürü ekleri kullanılarak migrasyon testi

  1. Enfeksiyondan sonra, içselleştirilmemiş parazitleri uzaklaştırmak için dendritik hücreleri (enfekte olmuş veya olmamış) oda sıcaklığında 1 mL salin solüsyonu ile 3 kez yıkayın. Her yıkamadan sonra, plakaları 300 x g'da 4 °C'nin altında 10 dakika santrifüjleyin.
  2. İçselleştirilmemiş parazitler uzaklaştırıldıktan sonra, her bir oyuğa 200 μL hücre ayrışma reaktifi ekleyerek hücreleri ayırın ve 15 dakika inkübe edin. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 altında bir inkübatörde tutun.
  3. Hücrelerin gevşemesine izin vermek için 1.000 μL'lik bir pipet ucu kullanarak hücreleri homojenize edin.
  4. Ayrışmış hücreleri 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
  5. 4 ° C'nin altında 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
  6. Pelet% 10 FBS ile desteklenmiş 1 mL RPMI ortamında yeniden süspanse edin.
  7. Her tüpün içeriğini 25 G'lık bir iğne ile 1 mL'lik bir şırıngadan 5 kez yavaşça geçirin ve hücreleri ayırın.
  8. Bir alikotu çıkarın, bir hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonunu belirlemek için tripan mavisi kullanarak seyreltin (4 kadrandaki canlı hücrelerin ortalaması × seyreltme faktörü × 104).
  9. Hücre kültürü mikroplaka eklerinin hazırlanması:
    NOT: Dendritik hücreler, makrofajlar ve monositler kullanılarak yapılan migrasyon testleri için hücre kültürü ekleri (5.0 μM gözenekli polikarbonat membran) önerilir, çünkü bu ekler fagositlerin zarlardan geçmesine izin verir.
    1. Ekleri steril cımbızla çıkarın ve boş kuyucuklara yerleştirin.
    2. Her oyuğa %10 FBS ile desteklenmiş 600 μL RPMI ortamı ekleyin; kemoatraktan kemokin (CC motifi) ligand 3 (CCL3) (her 1 mL ortam için 1 μL) ekleyin.
      NOT: CCL3, DC göçünü düzenleyen bir kemokindir34.
    3. Steril cımbız kullanarak, ekleri ortamı içeren kuyucuklara yerleştirin.
  10. Her bir kesici uça 100 μL ortamda 2 x10 5 dendritik hücre (enfekte olmuş veya olmamış) ekleyin.
  11. Hücrelerin göç etmesine izin vermek için 4 saat inkübe edin.
  12. 4 saat sonra plakayı çıkarın ve ortamı aspire edin. 100 μL% 4 paraformaldehit ekleyin ve 15 dakika inkübe edin.
  13. Paraformaldehiti çıkarın ve 100 μL tuzlu su çözeltisi ekleyin.
    NOT: Plakalar daha sonra monte edilmek üzere 4 °C'de tutulabilir.
  14. Göç etmeyen hücreleri veya zarı geçenleri saymak için süpernatanı eklerden veya kuyulardan toplayın. Paraformaldehit% 4 ile 15 dakika inkübe edin.
  15. Sitosantrifüj tekniği kullanarak hücreleri konsantre edin35.
  16. Membranlara DAPI ile 10 μL montaj ortamı ekleyin ve lamelleri kuyucukların üzerine yerleştirin.
  17. Geçme membranının montajı.
    NOT: Bu adım biyogüvenlik kabinlerinin dışında da gerçekleştirilebilir.
    1. Ekleme membranlarını kuyulardan çıkarın.
    2. Taşınmamış hücreleri çıkarmak için ekin yüzeyini bir çubukla kazıyın.
    3. Bir neşter kullanarak, zarı ekten çıkarın.
    4. Membranı, hücreler yukarı bakacak şekilde bir slayt üzerine yerleştirin.
    5. Her membrana DAPI ile 10 μL montaj ortamı ekleyin ve ardından kaplama lamellerini yerleştirin.
    6. Plakaları alüminyum folyo ile örtün.
    7. Plakaları oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin, ardından -20 °C'de saklayın
  18. Hücre göçünü analiz etmek için, 405 nm'lik bir lazer uyarma dalga boyunda bir floresan mikroskobu kullanarak alan başına hücre sayısını (en az 10 alan) sayın.

5. Adezyon testi ve immünofloresan ile aktin polimerizasyonunun değerlendirilmesi

NOT: Bu test için, lamel ile 24 oyuklu plakalar kullanın.

  1. Hücreleri 4 saat boyunca enfekte ettikten sonra, içselleştirilmemiş parazitleri uzaklaştırmak için her bir kuyucuğu oda sıcaklığında steril tuzlu su çözeltisi ile 3 kez yıkayın.
  2. Plakayı 300 x g'da 4°C'nin altında 10 dakika santrifüjleyin. Her oyuğa 15 dakika boyunca 500 μL% 4 paraformaldehit ekleyin.
  3. Paraformaldehiti çıkarın ve 1 mL tuzlu su çözeltisi ekleyin.
  4. Çözeltileri Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın.
Birincil çözümlerBileşikDilüent
Amonyum klorür çözeltisi0,134 g NH4Cl50 ml PBS 1X
Saponin% 15150 mg saponin1 mL de PBS 1X
Sığır serumundan elde edilen albümin (ABS) %101 g ABS10 mL PBS 1X
İkincil çözümlerBileşen 1Bileşen 2Bileşen 3
Saponin % 0,151 mL saponin% 15100 mL PBS 1X-
PBS 1X / ABS %3 / Saponin %0,1513,8 mL PBS 1X6 mL ABS %10200 μL Saponin %15
PBS1X / ABS %0,3 / Saponin %0,15:19,2 mL PBS 1X0,6 mL ABS %10200 μL Saponin %15
PBS 1X / ABS %1 / Saponin %0,1517,8 mL PBS 1X2 mL ABS %10200 μL Saponin %15

Tablo 1: Tampon tarifleri.

  1. İmmün boyama
    NOT: Aşağıdaki adımlar ajitasyon altında gerçekleştirilmelidir.
    1. Lamelleri 1x PBS ile 3 kez 5 dakika yıkayın.
    2. 10 dakika boyunca oyuk başına 500 μL amonyum klorür çözeltisi ekleyin.
    3. Lamelleri 1x PBS ile 3 kez 5 dakika yıkayın.
    4. Membranı 15 dakika boyunca% 0.15 Saponin ile geçirgenleştirin.
    5. Hücreleri bloke edici çözelti (PBS 1x / ABS% 3 / Saponin% 0.15) ile 1 saat inkübe edin.
    6. Lamelleri PBS 1x / Saponin% 0.15 ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
    7. PBS 1x / ABS %1 /Saponin %0.15'te primer antikorları şu şekilde seyreltin: Tavşan anti-FAK (pTyr397): 1:500 seyreltme, Tavşan anti-paxilin (pTyr118): 1:100 seyreltme. Fare Anti-Rac1: 1:100 seyreltme. Tavşan Anti-Cdc42: 1:200 seyreltme. Tavşan Anti-RhoA: 1:200 seyreltme.
    8. PBS 1x / ABS %1 / Saponin %0.15 içinde seyreltilmiş primer antikor ile hücreleri 1 saat inkübe edin.
      NOT: FAK ve Paxillin, yapışma komplekslerinin(13,14,15) oluşumunda rol oynayan anahtar moleküllerdir. Rho GTPase ailesi, aktin hücre iskeletinin organizasyonundan sorumludur. Hücrenin ön kenarında bulunan RAC1 ve Cdc42, sırasıyla lamellipodia ve filopodia oluşumunu kontrol eder; RhoA, hücrenin arkasında bulunur ve hücre iskeleti kasılmasındarol oynar 15, 23,24,25.
    9. Lamelleri 1x PBS/Saponin %0.15 ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
    10. İkincil antikor veya falloidini aşağıdaki gibi seyreltin: Anti-tavşan IgG, Alexa Fluor 568: 1:500 seyreltme; Anti-fare IgG, Alexa Fluor 488: 1:500 seyreltme; Anti-fare IgG, Alexa Fluor 594: 1:500 seyreltme; Phalloidin Alexa Fluor 488: 1:1200 seyreltme.
    11. Hücreleri 1x PBS / ABS %0.3 Saponin %0.15 içinde seyreltilmiş ikincil antikor veya falloidin ile 45 dakika inkübe edin.
      NOT: İkincil antikorun veya falloidinin inkübasyonu ışık yokluğunda yapılmalıdır. Aşağıdaki adımlar sırasında ışıktan korumak için plakaları alüminyum folyo ile örtün.
    12. Lamelleri 1x PBS ile 3 kez 5 dakika yıkayın.
    13. Lamelleri kuyulardan çıkarın.
    14. Işık yokluğunda, temiz mikroskobik cam slaytların üzerine DAPI ile 10 μL montaj ortamı ekleyin.
    15. Hücreler ve DAPI çözeltisi arasında temasa izin vermek için lamelleri hücreler aşağı bakacak şekilde yerleştirin.
      NOT: Işıktan korumak için slaytları alüminyum folyo ile örtün.
    16. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
    17. -20 °C'de saklayın.

6. FIJI kullanarak konfokal mikroskopi, görüntü elde etme ve niceleme

NOT: İmmünofloresan görüntüleri elde etmek/yakalamak için konfokal lazer tarama mikroskobu kullanın. Optimum çözünürlük için yağa daldırmalı 63x objektif lens önerilir.

  1. Görüntü alımından en az 30 dakika önce lamellerin ışıktan korunarak oda sıcaklığına ulaşmasını bekleyin.
  2. Lamelleri emici doku ile temizleyin.
  3. Objektife bir damla daldırma yağı ekleyin ve her slaydı mikroskop altına yerleştirin.
  4. Yağ slayta temas edene kadar hedefi hareket ettirin.
  5. Mikroskop odağını gözlemleyin ve ayarlayın; Yağ ile 63x hedefi seçin.
  6. Lazerleri 488 nm, 552 nm ve 405 nm dalga boylarında açın.
  7. Görüntü çözünürlüğünü seçin: 1024 x 1024.
  8. Canlı düğmesine tıklayın, Z yığınını ayarlayın ve Başlat'a basın. İşlemi tekrarlayın ve ardından Bitir'e basın.
  9. Tool (Araç) menüsünde Maximum Projection (Maksimum Projeksiyon) seçeneğini seçtikten sonra, görüntünün elde edilmesini bekleyin.
  10. Denemeyi kaydedin .
  11. Görüntüleri bir bilgisayarda .lif formatında dışa aktarın. Görüntüleri analiz etmek için FIJI açık kaynaklı görüntü analiz yazılımını kullanın.
  12. Analiz edilecek görüntüleri seçin ve Görüntüyü Çoğalt'ı seçin.
  13. Görüntünün gri tonlamalı olması için Görüntü | Ayarla | Renk eşiği. 0 ve 255 (doygunluk) öğesini seçin.
  14. Eşik yöntemini seçin: Varsayılan.
  15. Eşik rengini seçin: B ve W (siyah beyaz).
  16. Koyu arka plan'ı seçmeyin.
  17. Seçin: Süreç | İkili | Seçenekleri seçin ve ardından ölçülecek ilgili verileri seçin: Alan, Min, Maks, gri değer, yoğunluğu entegre edin.
  18. Fiji araç çubuğunda serbest eller aracını seçin ve her hücreyi manuel olarak dikkatlice izleyin.
  19. Analiz menüsünden, Ölçümleri ayarla'yı seçin. Alana entegre yoğunluğun ve ortalama gri değerin seçili olduğundan emin olun. Bu işlemi her hücre için tekrarlayın.
  20. Sonuçlar penceresinde tüm verileri seçin ve kopyalayıp bir elektronik tablo dosyasına yapıştırın.
  21. Düzeltilmiş toplam hücre floresansını (CTCF) hesaplayın: CTCF (Yoğunluğu entegre et = Seçilen hücrenin alanı x Arka plan okumalarının ortalama floresansı).
  22. İstatistiksel analiz yapmak için istatistiksel analiz yazılımını kullanarak verileri içeren dosyayı açın.

7. İstatistiksel analiz

  1. Hoş geldiniz iletişim kutusu göründüğünde Yeni Bir Proje Açın.
  2. SD ile grafik türünü ve ortamı seçin.
  3. Deney sonuçlarından elde edilen değerleri tabloya uygulayın.
  4. Tanımlayıcı İstatistikler'i seçin ve veri dağılımını analiz etmek için İstatistikler [tüm testler] seçenek sütununu seçin.
  5. Veriler bir Gauss dağılımını takip ediyorsa, iki çifti karşılaştırarak örnekleri analiz etmek için t-testini seçin. Dağılım Gauss değilse, Mann-Whitney testini kullanarak verileri analiz edin.
  6. En iyi veri gösterimi için en iyi grafik seçeneğini belirleyin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Burada açıklanan bu protokol, hücre göçünün ve aktin dinamikleri ve yapışma gibi ilişkili mekanizmalarının değerlendirilmesini sağlar, böylece omurgalı konakçı içindeki Leishmania ile enfekte konakçı hücrelerin göçünü belirlemek için bir araç sağlar. Burada sunulan sonuçlar, bu in vitro testin, in vivo deneylerden önce hücresel yapışma, göç ve aktin dinamiklerindeki değişikliklerin hızlı ve tutarlı göstergelerini sağla...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Hücre kültürü zarı ekler sistemini kullanarak hücre göçünü değerlendirmek için burada açıklanan yöntem, araştırmacıların hücrelerin göç tepkisini iki boyutlu bir ortamda incelemelerine olanak tanır. Bu teknikte, bazı adımlar kritik olarak kabul edilir. İlk olarak, insan DC'lerinin farklılaşması ve Leishmania enfeksiyonu, enfeksiyon oranı donöre bağlı olduğu için belirleyicidir. Deney başına birden fazla donör ve sağlıklı Leishmania

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Bahia Araştırma Destek Vakfı (Fapesb) tarafından 9092/2015 numaralı hibe ile desteklenmiştir. Yazarlar, burslar yoluyla mali destek için CNPq, Capes ve Fapesb'ye teşekkür eder. Yazarlar, eleştirel analiz, İngilizce dil revizyonu ve el yazması kopya düzenleme yardımı için Andris K. Walter'a teşekkür eder.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
16 Gauge needleDescarpack353101
24 well cell culture plateJET-BIOFILJ011024
25 Gauge needleDescarpack353601
Albumin from bovine serumSigma AldrichA2153-100G
Ammonium chlorideSigma AldrichA-0171
Anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488InvitrogenA32723
Anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594InvitrogenA11032
Anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 568InvitrogenA11011
CD14 MicroBeadsMACS Myltenyi Biotec130-050-201
Cell Culture Flask 25cm2SPL70125
CellstripperCorning25-056-CI
Confocal microscopeLeicaTCS SP8
Coverslip circles 13mmPerfecta10210013CE
Dissecting ForcepsVWR82027-406
EDTASigma AldrichE6758
Falcon tubeKASVIK19-0051
Fetal Bovine Serumgibco16000044
Fluorescence microscopeOlympus BX51
Glass slide  25,4x76,2mmPerfecta200
Hemin bovineSigma AldrichH2250
HemocytometerPerfecta7302HD
Histopaque® 1077Sigma Aldrich10771
MACS bufferMACS Myltenyi Biotec130-091-221
Minimum Essential MediumGibco41090093
Mouse anti-Rac1BD610650
ParaformaldehydeSigma Aldrich158127
Phalloidin Alexa Fluor 488InvitrogenA12379
Phosphate Buffered SalineThermoFisherAM9624
Polycarbonate Membrane Transwell Inserts - Pore size 5.0 µmCorning3421
ProLong Gold DAPI kitInvitrogenP36931
Rabbit anti-Cdc42InvitrogenPA1-092X
Rabbit anti-FAK (pTyr397)InvitrogenRC222574
Rabbit anti-paxilin (pTyr118)InvitrogenQF221230
Rabbit anti-RhoAInvitrogenOSR00266W
Recombinant Human CCL3R&D Systems270-LD-010
Recombinant Human GM-CSFPeproTech300-03
Recombinant Human IL-4PeproTech200-04
Recombinant Human M-CSFPeproTech300-25
RPMI 1640 MediumGibco21870076
SaponinSigma Aldrich47036 – 50G – F
Syringe 3 mLDescarpack324201
Trypan BlueGibco15250061

Referanslar

  1. Burza, S., Croft, S. L., Boelaert, M. Leishmaniasis. The Lancet. 392 (10151), 951-970 (2018).
  2. Bi, K., Chen, Y., Zhao, S., Kuang, Y., John Wu, C. H. Current Visceral Leishmaniasis Research: A Research Review to Inspire Future Study. BioMed Research International. 2018, (2018).
  3. Serafim, T. D., Iniguez, E., Oliveira, F. Leishmania infantum. Trends in Parasitology. 36 (1), 80-81 (2020).
  4. Van Assche, T., Deschacht, M., da Luz, R. A. I., Maes, L., Cos, P. Leishmania-macrophage interactions: Insights into the redox biology. Free Radical Biology and Medicine. 51 (2), 337-351 (2011).
  5. Podinovskaia, M., Descoteaux, A. Leishmania and the macrophage: A multifaceted interaction. Future Microbiology. 10 (1), 111-129 (2015).
  6. Antoine, J. C., Prina, E., Jouanne, C., Bongrand, P. Parasitophorous vacuoles of Leishmania amazonensis-infected macrophages maintain an acidic pH. Infection and Immunity. 58 (3), (1990).
  7. Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).
  8. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model. Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).
  9. Sheetz, M. P., Felsenfeld, D., Galbraith, C. G., Choquet, D. Cell migration as a five-step cycle. Biochemical Society symposium. 65, 233-243 (1999).
  10. Yano, H., et al. Roles played by a subset of integrin signaling molecules in cadherin-based cell-cell adhesion. Journal of Cell Biology. 166 (2), 283-295 (2004).
  11. Mitra, S. K., Hanson, D. A., Schlaepfer, D. D. Focal adhesion kinase: In command and control of cell motility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (1), 56-68 (2005).
  12. Deramaudt, T. B., et al. Altering FAK-Paxillin Interactions Reduces Adhesion, Migration and Invasion Processes. PLoS One. 9 (3), (2014).
  13. Turner, C. E. Paxillin and focal adhesion signalling. Nature Cell Biology. 2 (12), (2000).
  14. Linder, S., Aepfelbacher, M. Podosomes: Adhesion hot spots of invasive cells. Trends in Cell Biology. 13 (7), 376-385 (2003).
  15. Huveneers, S., Danen, E. H. J. Adhesion signaling - Crosstalk between integrins, Src and Rho. Journal of Cell Science. 122 (8), 1059-1069 (2009).
  16. Jones, G. E. Cellular signaling in macrophage migration and chemotaxis. Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 593-602 (2000).
  17. De Fougerolles, A. R., Koteliansky, V. E. Regulation of monocyte gene expression by the extracellular matrix and its functional implications. Immunological Reviews. 186 (1), 208-220 (2002).
  18. Cortesio, C. L., Boateng, L. R., Piazza, T. M., Bennin, D. a, Huttenlocher, A. Calpain-mediated proteolysis of paxillin negatively regulates focal adhesion dynamics and cell migration. The Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 9998-10006 (2011).
  19. Verkhovsky, A. B., et al. Orientational order of the lamellipodial actin network as demonstrated in living motile cells. Molecular Biology of the Cell. 14 (11), 4667-4675 (2003).
  20. Ridley, A. J., et al. Cell Migration: Integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
  21. Hall, A. Small GTP-binding proteins, and the regulation of the actin cytoskeleton. Annual Review of Cell Biology. 10, 31-54 (1994).
  22. Machesky, L. M., Hall, A. Rho: A connection between membrane receptor signalling and the cytoskeleton. Trends in Cell Biology. 6 (8), 304-310 (1996).
  23. Ridley, A. J., Hall, A. The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors. Cell. 70 (3), 389-399 (1992).
  24. DeMali, K. A., Burridge, K. Coupling membrane protrusion and cell adhesion. Journal of Cell Science. 116 (12), 2389-2397 (2003).
  25. López-Colomé, A. M., Lee-Rivera, I., Benavides-Hidalgo, R., López, E. Paxillin: A crossroad in pathological cell migration. Journal of Hematology and Oncology. 10 (1), (2017).
  26. Carvalhal, D. G. F., et al. The modelling of mononuclear phagocyte-connective tissue adhesion in vitro: Application to disclose a specific inhibitory effect of Leishmania infection. Experimental Parasitology. 107 (3-4), 189-199 (2004).
  27. Pinheiro, N. F., et al. Leishmania infection impairs β1-integrin function and chemokine receptor expression in mononuclear phagocytes. Infection and Immunity. 74 (7), 3912-3921 (2006).
  28. de Menezes, J. P. B., et al. Leishmania infection inhibits macrophage motility by altering F-actin dynamics and the expression of adhesion complex proteins. Cellular Microbiology. 19 (3), (2017).
  29. Hermida, M. D. R., Doria, P. G., Taguchi, A. M. P., Mengel, J. O., dos-Santos, W. L. C. Leishmania amazonensis infection impairs dendritic cell migration from the inflammatory site to the draining lymph node. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 450(2014).
  30. Ballet, R., et al. Blocking junctional adhesion molecule c enhances dendritic cell migration and boosts the immune responses against Leishmania major. PLoS Pathogens. 10 (12), (2014).
  31. Rocha, M. I., et al. Leishmania infantum enhances migration of macrophages via a phosphoinositide 3-Kinase î-dependent pathway. ACS Infectious Diseases. 6 (7), 1643-1649 (2020).
  32. Hiasa, M., et al. GM-CSF and IL-4 induce dendritic cell differentiation and disrupt osteoclastogenesis through M-CSF receptor shedding by up-regulation of TNF-α converting enzyme (TACE). Blood. 114 (20), 4517-4526 (2009).
  33. de Melo, C. V. B., et al. Phenotypical characterization of spleen remodeling in murine experimental visceral leishmaniasis. Frontiers in Immunology. 11, 653(2020).
  34. Gibaldi, D., et al. CCL3/macrophage inflammatory protein-1α is dually involved in parasite persistence and induction of a TNF- and IFNγ-enriched inflammatory milieu in Trypanosoma cruzi-induced chronic cardiomyopathy. Frontiers in Immunology. 11, 306(2020).
  35. Finger, P. T., Papp, C., Latkany, P., Kurli, M., Iacob, C. E. Anterior chamber paracentesis cytology (cytospin technique) for the diagnosis of intraocular lymphoma. British Journal of Ophthalmology. 90 (6), 690-692 (2006).
  36. Zhang, C., Barrios, M. P., Alani, R. M., Cabodi, M., Wong, J. Y. A microfluidic Transwell to study chemotaxis. Experimental Cell Research. 342 (2), 159-165 (2016).
  37. Glynn, S. A., O'Sullivan, D., Eustace, A. J., Clynes, M., O'Donovan, N. The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors, simvastatin, lovastatin and mevastatin inhibit proliferation and invasion of melanoma cells. BMC Cancer. 8, (2008).
  38. van de Merbel, A. F., vander Horst, G., Buijs, J. T., vander Pluijm, G. Protocols for migration and invasion studies in prostate cancer. Methods in Molecular Biology. 1786, 67-79 (2018).
  39. Omar Zaki, S. S., Kanesan, L., Leong, M. Y. D., Vidyadaran, S. The influence of serum-supplemented culture media in a transwell migration assay. Cell Biology International. 43 (10), 1201-1204 (2019).
  40. Borovikov, I. S. Izuchenie strukturnykh izmeneniǐ sokratitel'nykh belkov myshechnogo volokna s pomoshch'iu poliarizatsionnoǐ ul'trafioletovoǐ fluorestsentnoǐ mikroskopii. VIII. Vliianie glutaral'degida i falloidina na konformatsiiu F-aktina. Tsitologiya. 26 (11), 1262-1266 (1984).
  41. Cooper, J. A. Effects of cytochalasin and phalloidin on actin. The Journal of Cell Biology. 105 (4), 1473-1478 (1987).
  42. Allen, W. E., Jones, G. E., Pollard, J. W., Ridley, A. J. Rho, Rac and Cdc42 regulate actin organization and cell adhesion in macrophages. Journal of Cell Science. 110, 707-720 (1997).
  43. Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

LeishmaniaH cre GH cre AdhezyonuKonak H cre Etkile imiH cre i ParazitMakrofajlarDendritik H crelerHastal k Yay l mVisseralizasyonAktin Dinami iMotilite AnaliziEnfeksiyon ProtokolAdezyon Komplekslerin Vitro al ma

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır