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要約

ここでは、リーシュマニアに感染した樹状細胞の遊走を探索することにより、リーシュマニアと宿主の相互作用の意味を研究します。樹状細胞の分化と感染、遊走解析、接着複合体とアクチン動態の評価について述べる。この方法は、リーシュマニアや他の細胞内寄生虫種に感染した場合に、他の宿主細胞遊走研究にも適用できます。

要約

リーシュマニア は細胞内原虫であり、自己消失性の限局性皮膚病変から非常に致命的な内臓疾患まで、幅広い臨床症状を引き起こします。現在、世界中で推定1,200万人が感染しており、さらに3億5,000万人が感染のリスクに直面しています。マクロファージや樹状細胞などの リーシュマニア 寄生虫に感染した宿主細胞は、異なる宿主組織に移動することが知られていますが、その移動が寄生虫の播種とホーミングにどのように寄与するかは、まだよくわかっていません。したがって、これらの寄生虫が宿主細胞の応答、接着、および移動を調節する能力を評価することで、疾患の播種と内臓形成に関与するメカニズムが明らかになります。細胞移動は、細胞が分極と突出を受けて移動できるようにする複雑なプロセスです。このプロセスは、アクチンおよびチューブリンベースの微小管ダイナミクスによって制御され、基質への細胞接着の調節など、さまざまな要因が関与しています。細胞の接着と移動のプロセスは、いくつかのモデルを使用して調査されています。ここでは、 リーシュマニア 感染時の宿主細胞の遊走性を特徴づける方法を説明します。この詳細なプロトコルは、樹状細胞の分化と感染、宿主細胞の運動性と遊走の解析、ならびに接着複合体とアクチンダイナミクスの形成を示しています。この in vitro プロトコールは、脊椎動物の宿主組織内で のリーシュマニア 播種に関与するメカニズムをさらに解明することを目的としており、他の細胞遊走研究にも変更して適用することができます。

概要

リーシュマニア症は、リーシュマニア属に属する原虫寄生虫によって引き起こされる顧みられない熱帯病であり、自己治癒性の限局性皮膚病変から致死的な内臓疾患まで、幅広い臨床症状を引き起こします。リーシュマニア症は年間最大100万人が新たに発症していると推定されており、現在、世界中で1,200万人が感染していると報告されています1。内臓リーシュマニア症(VL)は、治療せずに放置すると95%以上の症例で致命的となる可能性があり、年間50,000人以上が死亡し、南アメリカ、東アフリカ、南アジア、地中海地域で数百万人が罹患しています2。新世界におけるVLの主な病原体であるリーシュマニア・インファンタムは、給血中に感染した雌のサシチョウバエによってヒトに感染する3。これらの寄生虫は、食細胞、例えばマクロファージおよび樹状細胞3,4,5によって認識され、内在化される。これらの細胞内では、寄生虫はアマスチゴートとして知られる細胞内形態に分化し、その後増殖し、リンパ系と血流を介して異なる宿主組織に輸送されます6,7。しかし、リーシュマニア原虫が脊椎動物の宿主に播種するメカニズムや、この過程で宿主細胞の移動が果たす役割は不明のままです。

細胞遊走は、白血球8を含むすべての有核細胞によって実行される複雑なプロセスです。細胞移動の古典的なサイクリングモデルによれば、このプロセスには、5つのステップに分けることができるいくつかの統合された分子イベントが含まれます。マトリックス接点へのリーディングエッジの接着。細胞質の収縮;接触部位からのセルの後端の解放;細胞の後部から前部への膜受容体のリサイクル9。

細胞遊走が起こるためには、突起が形成され、細胞外マトリックスへの付着によって安定化される必要があります。細胞遊走の促進に関与するさまざまな受容体タイプの中で、インテグリンは注目に値します。インテグリンの活性化は、移動関連のシグナル伝達をもたらします。次いで、細胞内シグナル伝達は、タリン、ビンキュリン、およびパキシリン分子に加えて、焦点接着キナーゼ(FAK)およびSrcファミリーキナーゼを介して起こる10,11,12。FAKを含む活性化キナーゼによるパキシリンのリン酸化は、エフェクター分子の動員につながり、細胞遊走を促進する外部シグナルを伝達します。パキシリンは、細胞接着、アクチン重合、および細胞遊走プロセスに重要な細胞内分子であることが示されています13,14,15。

アクチン細胞骨格は、食細胞の分極と遊走において中心的な役割を果たしている16。細胞遊走の過程で、アクチン重合によって形成された突起は、細胞外マトリックスへの細胞接着によって安定化されます。このプロセスは、アクチン細胞骨格17,18,19に結合したインテグリン受容体によって調節され得る。いくつかのアクチン結合タンパク質は、細胞突起におけるアクチン重合の速度と組織化を調節している20。研究によると、RhoA、Rac、およびCdc42は、細胞外因子による接着細胞の刺激後にアクチン再編成を調節することが示されている21,22。遊走中、Rac1およびCdc42は細胞の前縁に位置し、それぞれラメリポディアおよびフィロポディアの伸展を制御し、一方、細胞の後部に位置するRhoAは、アクトミオシン細胞骨格15,23,24,25の収縮を調節する。

研究によると、リーシュマニア感染は、細胞基質への接着や移動などの宿主細胞の機能を調節することが示されています26,27,28,29,30,31。未成熟なDCは末梢組織に存在します。PAMPSと相互作用すると、これらの細胞は活性化されてドレインリンパ節に移動し、T細胞への抗原提示を促します。マウスモデルを用いた以前の研究では、L. amazonensisの感染がDCの排液リンパ節への移動の減少を引き起こすことが示された29。また、接着プロセスの阻害により、L. major30の感染後のDC遊走が減少することも実証されました。それにもかかわらず、DC移動が宿主の寄生虫の拡散に与える影響、およびこのプロセスに関与するメカニズムは、まだ十分に理解されていません。

ここでは、リーシュマニアに感染したヒトDCを対象としたin vitro接着および遊走アッセイを実施するためのステップバイステップのプロトコールをまとめて紹介します。この方法は、DCの分化と感染だけでなく、宿主細胞の運動性と遊走、接着複合体の形成、およびアクチンダイナミクスの解析も可能にします。現在記載されているin vitroプロトコルにより、研究者は脊椎動物の宿主組織内でのリーシュマニア播種に関与するメカニズムをさらに調査することができ、操作して他の細胞遊走研究にも適用できます。

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プロトコル

ここに記載されている手順は、ゴンサロモニス研究所の治験審査委員会(IGM-FIOCRUZ、プロトコル番号2.751.345)によって承認されました。.血液サンプルは健康なボランティアドナーから採取した。動物実験手順は、ブラジルの法律11.784/2008で採択された動物研究の倫理原則に従って実施され、ゴンサロ・モニス研究所の動物研究倫理委員会(IGM-FIOCRUZ、プロトコル番号014/2019)によって承認およびライセンスされました。

1. ヒト樹状細胞の単離と分化

  1. 密度勾配培地10 mLを50 mL遠心チューブにピペットで入れます。
  2. 各ドナーのサンプルに従って50mLチューブをラベル付けします。
  3. 健康なドナーから~50mLの静脈血を採取し、採取後、フローキャビネットで以下に説明する手順に従ってください。
  4. 採取した血液を慎重に遠心チューブに移し、生理食塩水(0.9%塩化ナトリウム)で室温で1:1の割合で希釈します。
  5. 希釈した血液を密度勾配培地の上部にゆっくりと重ねます。
  6. 血液と密度勾配培地を含むチューブを400 x g で室温で30分間遠心分離します。
    注:遠心分離する前にブレーキをオフにして、グラジエント層の混合を防ぎます。1回目の遠心分離後、遠心分離機の温度を4°Cに下げます。
  7. 遠心分離機からチューブを慎重に取り外します。
  8. サンプル中の末梢血単核細胞(PBMC)のリングを特定します(バフィーコート)。ピペットで残留血漿を静かに除去します。
    注:遠心分離後、赤血球、密度勾配培地、PBMCリング、および血漿の勾配層が形成されます。PBMCリングは、密度勾配媒体とプラズマ層の間にあります。
  9. 雲状のPBMC層を新しいチューブに移し、生理食塩水で容量を30mLに上げます。
  10. 細胞懸濁液を含むチューブを250 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清を捨て、ペレットを生理食塩水1mLに再懸濁します。
  11. トリパンブルー排除法による細胞計数用のアリコートを採取します。まず、1:1,000の割合で希釈します。次に、希釈した細胞10 μLをトリパンブルー染色に使用し、ノイバウアーチャンバーを使用して細胞をカウントし、細胞生存率を測定します。
  12. 再度、200 x g で4°C下で10分間遠心分離します。
  13. ペレットをMACSバッファーに再懸濁します。1 x 107 セルごとに80 μLのバッファーを使用します。
    注:MACS緩衝液組成:リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.2、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)、および2 mM EDTAを含む溶液を調製します。緩衝液をすすぎ液で1:20の比率で希釈します。バッファーを冷たく保ち、2〜8°Cで保存します。
  14. ステップ1.13で調製した細胞懸濁液にCD14マイクロビーズを添加します。1 x 107 細胞ごとに20 μLのCD14マイクロビーズを使用してください。
    注:CD14マイクロビーズは、ビーズがほとんどの単球で発現するCD14陽性細胞に結合するため、PBMCからのヒト単球の正選択に使用されます。
  15. ペレットとマイクロビーズを含む溶液をピペットで均質化します。氷の上を15分間保ちます。
  16. 懸濁液を300 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
  17. MACSバッファ内のセルを再懸濁します。細胞マイクロビーズ混合物中の1 x 107 細胞に1〜2 mLを使用します。
  18. 懸濁液を300 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
  19. 上清を吸引し、ペレットを500μLのMACSバッファーに再懸濁します。
    注:これは、1つのカラムで処理できる細胞懸濁液の最大容量です。
  20. 磁気カラムを組み立てます。
  21. 500 μLのMACSバッファーを加えてカラムを1回洗浄します。バッファが重力下でカラムを流れるようにします。
    注意: 入る空気がカラムを遮る可能性があるため、カラムを乾燥させないでください。
  22. ステップ1.19の細胞サンプル溶液をカラムあたり500 μL加えます。セルサンプル溶液が重力下でカラム内を流れるようにします。
  23. 500 μL の MACS バッファー (2x) を加えてカラムを洗浄します。新しいバッファーは、カラムリザーバーが空の場合にのみ追加してください。乾燥は避けてください。
  24. MACSバッファー1 mLをカラムにピペットで移し、その下の新しいチューブに入れます。プランジャーをカラムにしっかりと押し込んで、磁気的に標識されたセルをすぐに洗い流します。
  25. CD14に富んだ細胞を300 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
  26. ノイバウアーチャンバーを使用して細胞をカウントします。
  27. インターロイキン-4 (IL-4) (100 μL/mL) + 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF) (50 ng/mL) を使用して、1 mL 完全 RPMI に細胞を再懸濁します。
    注:GM-CSFは、マクロファージ、T細胞、肥満細胞、ナチュラルキラー細胞、内皮細胞、線維芽細胞から分泌されるサイトカインで、骨髄中の骨髄前駆細胞の分化と増殖を誘導します。GM-CSFおよびIL-4は、樹状細胞の分化を誘導するために使用される32。
  28. 2ウェルプレートに2×10個の5 細胞/ウェルの濃度で細胞を播種し、500μLの完全RPMI培地に細胞をインキュベートし、細胞培養インキュベーター(37°C)で7日間インキュベートします。

2. リーシュマニアの幼児栽培

注:このアッセイでは、 リーシュマニアインファンタム (MCAN/BR/89/BA262)寄生虫が使用されます。ハムスターは、滅菌生理食塩水中の1 x 106 L.乳児 前乳房を含む溶液20μLに静脈内感染しました。1〜2ヶ月後、動物は安楽死させられ、 リーシュマニア のアマスティゴート型が脾臓から回収され、プロマスタゴテスに分化した33。

  1. 以前に感染したハムスターの脾臓から分離された L. infantum promastigotesを、3 mLのNovy-Nicolle-MacNeal培地(NNN)と5 mLのサプリメント添加Minimum Essential Medium(MEM)を含む傾斜した25 cm2 細胞培養フラスコで増殖させます。
    注:このアッセイでは、MEM培地に10%ウシ胎児血清(FBS)と24.5nMウシヘミンを添加しました。
  2. 24°Cで7日間、BOD(Bio-Oxygen Demand)インキュベーターでインキュベートします。
  3. 100 μL のプロマスティゴート培養液を、5 mL の添加 MEM 培地を含む新しい 25 cm2 細胞培養フラスコにピペットで移します。
  4. 前胸炎が固定相に達するまで、BODインキュベーターで前胸茎培養物を24°Cでインキュベートします。生理食塩水で希釈した寄生虫懸濁液のアリコートをノイバウアーチャンバー(すなわち、血球計算盤)に移すことにより、培養された前胸茎を定期的にカウントし、成長の固定期を決定します。
    注:NNN培地での培養後、ウサギの血液の残留微量を避けるために、初回通過寄生虫を使用することはお勧めしません。
  5. L. infantum promastigotesの静止成長期培養液1 x 105を新しい25 cm2細胞培養フラスコに移し、5 mLのMEM添加培地を添加します。
  6. Neubauerチャンバーを使用して、固定相が達成されるまで、約7日間、定期的に培養物の成長をモニタリングします。寄生虫は、実験的な感染手順で使用する準備が整いました。
    注:プロマスタチゴート培養物は、 in vitro で最大7継代の感染に対して生存可能であると考えられている;追加の継代は病原性の喪失を誘発する可能性がある。

3. ヒト樹状細胞感染

  1. 生物学的層流キャビネット内で、寄生虫培養フラスコからすべての内容物を50 mL遠心分離チューブに移します。
  2. 冷たい生理食塩水を最終容量40mLまで加えます。
  3. 1,600 xg で4°Cで10分間遠心分離します。
  4. 遠心分離後に上清を捨て、ペレットを1 mLの冷たい生理食塩水に再懸濁します(手順3.3〜3.4を3回繰り返します)。
  5. 細胞を洗浄して生存不能な寄生虫を除去した後、ペレットを1 mLの冷たい生理食塩水に再懸濁します。
  6. 内容物を16Gの針が付いた1mLシリンジにゆっくりと5回通し、寄生虫クラスターを分離します。
  7. アリコートを取り出して、血球計算盤の寄生虫濃度を決定します(4象限の寄生虫の平均数x希釈係数x10、4を計算します)。
  8. 樹状細胞を洗浄するには、生理食塩水1 mLを加え、細胞を300 x g で室温で10分間(3回)遠心分離します。
  9. 実験感染に必要な L.infantum の量を計算します。比率:細胞あたり20個の寄生虫。
  10. 必要量の L. infantum を細胞培養プレートの各ウェルに入れます。
  11. 樹状細胞を寄生虫と寄生虫とインキュベートし、インキュベーター内で37°C、5%CO2未満で4時間インキュベートします。
  12. ステップ3.11の後、プレートを300 x g で4°Cで10分間遠心分離します。

4. 細胞培養インサートを用いた遊走アッセイ

  1. 感染後、樹状細胞(感染しているかどうかにかかわらず)を1mLの生理食塩水で室温で3回洗浄し、非内在化寄生虫を除去します。各洗浄後、プレートを300 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
  2. 未取り込まれた寄生虫が除去されたら、各ウェルに200 μLの細胞解離試薬を加えて細胞を分離し、15分間インキュベートします。細胞をインキュベーター内で37°Cに5%CO2未満に保ちます。
  3. 1,000 μLのピペットチップを使用して細胞をホモジナイズし、細胞をほぐします。
  4. 解離した細胞を50 mLの遠心チューブに移します。
  5. 300 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
  6. 10% FBSを添加したRPMI培地1 mLにペレットを再懸濁します。
  7. 各チューブの内容物を25Gの針で1mLのシリンジにゆっくりと通し、細胞を分離します。
  8. アリコートを除去し、トリパンブルーを使用して希釈し、血球計算盤を使用して細胞濃度を決定します(4象限の生存細胞の平均×希釈係数×104)。
  9. 細胞培養マイクロプレートインサートの調製:
    注:樹状細胞、マクロファージ、および単球を用いた遊走アッセイには、細胞培養インサート(5.0 μM細孔ポリカーボネートメンブレン)が推奨されます。これらのインサートは食細胞がメンブレンを通過させるためです。
    1. 滅菌ピンセットでインサートを取り外し、空のウェルに入れます。
    2. 10% FBSを添加したRPMI培地600 μLを各ウェルに加えます。走化性物質ケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド3(CCL3)(培地1 mLにつき1 μL)を添加します。
      注:CCL3は、DC遊走を調節するケモカインである34。
    3. 滅菌ピンセットを使用して、培地を含むウェルにインサートを置きます。
  10. 2 x 105 樹状細胞(感染しているかどうかにかかわらず)を100 μLの培地に各インサートに加えます。
  11. 細胞が移動するまで4時間インキュベートします。
  12. 4時間後、プレートを取り出し、培地を吸引します。4%パラホルムアルデヒド100μLを加え、15分間インキュベートします。
  13. パラホルムアルデヒドを除去し、生理食塩水100μLを加えます。
    注:プレートは、後で組み立てるために4°Cに保つことができます。
  14. インサートまたはウェルから上清を採取し、非移動細胞または膜を通過した細胞をそれぞれカウントします。パラホルムアルデヒド4%と15分間インキュベートします。
  15. 細胞遠心分離技術を用いて細胞を濃縮する35。
  16. DAPI入り封入剤10 μLをメンブレンに加え、ウェル上にカバースリップを貼ります。
  17. インサートメンブレンの組み立て。
    注:この手順は、バイオセーフティキャビネットの外部で実行できます。
    1. インサートメンブレンはウェルから取り外します。
    2. インサートの表面を綿棒でこすり落とし、移行していない細胞をすべて取り除きます。
    3. メスを使用して、インサートからメンブレンを取り外します。
    4. メンブレンをスライド上に置き、細胞を上に向けます。
    5. DAPIを含む10 μLの封入剤を各メンブレンに加え、オーバーレイカバースリップを配置します。
    6. アルミホイルでプレートを覆います。
    7. プレートを室温で30分間インキュベートし、その後-20°Cで保存します
  18. 細胞遊走を解析するには、レーザー励起波長405nmの蛍光顕微鏡を用いて、フィールドあたりの細胞数(10フィールド以上)をカウントします。

5. 免疫蛍光法によるアクチン重合の接着アッセイと評価

注:このアッセイでは、カバースリップ付きの24ウェルプレートを使用してください。

  1. 細胞に4時間感染させた後、室温で滅菌生理食塩水で各ウェルを3回洗浄し、非内在化寄生虫を除去します。
  2. プレートを300 x gで4°Cで10分間遠心分離します。 500 μLの4%パラホルムアルデヒドを各ウェルに15分間加えます。
  3. パラホルムアルデヒドを除去し、生理食塩水1mLを加えます。
  4. 表1の説明に従って溶液を準備します。
主な解決策化合物希釈 剤
塩化アンモニウム溶液NH4Cl 0,134 gPBS 1X 50 ml
サポニン 15%サポニン150mg1 mL de PBS 1X
ウシ血清由来アルブミン(ABS)10%ABS1gPBS 1X 10 mL
二次ソリューションコンポーネント 1コンポーネント 2コンポーネント 3
サポニン0,15%サポニン1mL 15%PBS 1X 100 mL-
PBS 1X / ABS 3% / サポニン0,15%PBS 1X 13,8 mLABS10%の6mL200 μL のサポニン 15%
PBS1X / ABS 0,3% / サポニン0,15%:19,2 mLのPBS 1X0.6mLのABS10%200 μL のサポニン 15%
PBS 1X / ABS 1% / サポニン0,15%PBS 1X 17.8 mLABS10%の2mL200 μL のサポニン 15%

表1:バッファレシピ。

  1. 免疫染色
    注意: 次の手順は、攪拌下で実行する必要があります。
    1. カバースリップを1x PBSで3回5分間洗浄します。
    2. 1ウェルあたり500 μLの塩化アンモニウム溶液を10分間加えます。
    3. カバースリップを1x PBSで3回5分間洗浄します。
    4. メンブレンをサポニン0.15%で15分間透過処理します。
    5. ブロッキング溶液(PBS 1x / ABS 3% / Saponin 0.15%)と細胞を1時間インキュベートします。
    6. カバースリップをPBS 1x/Saponin 0.15%で5分間3回洗浄します。
    7. 一次抗体をPBS 1x /ABS 1% /Saponin 0.15%で希釈します:ウサギ抗FAK(pTyr397):1:500希釈、ウサギ抗パキシリン(pTyr118):1:100希釈。マウス抗Rac1:1:100希釈。ウサギ抗Cdc42:1:200希釈。ウサギ抗RhoA:1:200希釈。
    8. PBS 1x/ABS 1% /Saponin 0.15% で希釈した一次抗体で細胞を 1 時間インキュベートします。
      注:FAKとパキシリンは、接着複合体の形成に関与する重要な分子です13,14,15。Rho GTPアーゼファミリーは、アクチン細胞骨格の組織化に関与しています。細胞の前端に位置するRAC1とCdc42は、それぞれラメリポディアとフィロポディアの形成を制御します。RhoAは細胞の後部に位置し、細胞骨格の収縮に関与しています15、23、24、25。
    9. カバースリップを1x PBS/Saponin 0.15%で5分間3回洗浄します。
    10. 二次抗体またはファロイジンを次のように希釈します:抗ウサギIgG、Alexa Fluor 568:1:500希釈;抗マウスIgG、Alexa Fluor 488:1:500希釈;抗マウスIgG、Alexa Fluor 594:1:500希釈;ファロイジン Alexa Fluor 488: 1:1200 希釈。
    11. 細胞を1x PBS/ABS 0.3% Saponin 0.15%で希釈した二次抗体またはファロイジンと45分間インキュベートします。
      注:二次抗体またはファロイジンのインキュベーションは、光がない状態で行う必要があります。次の手順で光から保護するために、プレートをアルミホイルで覆います。
    12. カバースリップを1x PBSで3回5分間洗浄します。
    13. ウェルからカバースリップを取り外します。
    14. 光が当たらない場合は、DAPIを含む10 μLの封入剤をきれいなスライドガラス上に加えます。
    15. セルを下に向けてカバースリップを置き、セルとDAPI溶液が接触できるようにします。
      注意: 光から保護するために、スライドをアルミホイルで覆います。
    16. 室温で30分間インキュベートします。
    17. -20°Cで保存してください。

6. FIJIを用いた共焦点顕微鏡、画像取得、定量

注:免疫蛍光画像を取得/キャプチャするには、共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用します。最適な解像度を得るには、油浸63倍対物レンズをお勧めします。

  1. 画像取得の少なくとも30分前に、カバーガラスを光から保護された室温まで待ちます。
  2. カバースリップを吸収性ティッシュで清掃します。
  3. 対物レンズに液浸油を一滴加え、各スライドを顕微鏡下に置きます。
  4. オイルがスライドに触れるまで対物レンズを動かします。
  5. 顕微鏡の焦点を観察して調整します。 オイル付きの63倍対物レンズを選択します。
  6. 488 nm、552 nm、および 405 nm の波長でレーザーをオンにします。
  7. 画像の解像度を選択します: 1024 x 1024。
  8. 「Live」ボタンをクリックし、Zスタックを設定して、「Begin」を押します。このプロセスを繰り返してから、Endキーを押します。
  9. ツールメニューで[最大投影]オプションを選択した後、画像が取得されるのを待ちます。
  10. 実験を保存します。
  11. コンピューター上で画像を .lif 形式でエクスポートします。FIJIのオープンソース画像解析ソフトウェアを使用して画像を分析します。
  12. 分析する画像を選択し、[ 画像の複製]を選択します。
  13. 画像をグレースケールにするには、[ 画像] |調整 |色のしきい値。 0 と 255 (彩度) を選択します。
  14. しきい値の方法として [ デフォルト] を選択します。
  15. しきい値の色を選択します: BとW (黒と白)。
  16. [暗い背景] は選択しないでください。
  17. 選択: プロセス |バイナリ |オプション を選択し、測定する関連データを選択します: 面積、最小、最大、グレー値、積分密度。
  18. フィジーツールバーでフリーハンドツールを選択し、各セルを手動で注意深くトレースします。
  19. 「分析」メニューから、「測定値の設定」を選択します。面積積分強度と平均グレー値が選択されていることを確認してください。セルごとにこのプロセスを繰り返します。
  20. [結果] ウィンドウですべてのデータを選択し、コピーしてスプレッドシート ファイルに貼り付けます。
  21. 補正された全細胞蛍光(CTCF)を計算します:CTCF(積分密度=選択した細胞の面積xバックグラウンド読み取りの平均蛍光)。
  22. 統計解析ソフトウェアを使用してデータを含むファイルを開き、統計解析を行います。

7. 統計解析

  1. ウェルカムダイアログが表示されたら、 新しいプロジェクト を開きます。
  2. SD付きのグラフとメディアのタイプを選択します。
  3. 実験結果から得られた値を表に適用します。
  4. 「記述統計量」を選択し、データ分布を分析するために列「統計量 [すべての検定]」オプションを選択します。
  5. データがガウス分布に従う場合は、t検定を選択して、2つのペアを比較してサンプルを分析します。分布が非ガウス分布の場合は、マンホイットニー検定を使用してデータを分析します。
  6. 最適なデータ表現のために、最適なグラフオプションを選択します。

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結果

本明細書に記載のこのプロトコルは、細胞遊走およびそれに関連するメカニズム(アクチン動態および接着など)の評価を可能にし、それにより、脊椎動物宿主内の リーシュマニア感染宿主細胞の遊走を決定するためのツールを提供する。ここで紹介する結果は、この in vitro アッセイが、 in vivo 実験に先立って、細胞の接着、遊走、およびアクチ?...

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ディスカッション

ここで説明する細胞培養膜インサートシステムを使用して細胞遊走を評価する方法により、研究者は二次元環境における細胞の遊走応答を研究することができます。この手法では、一部の手順が重要と見なされます。まず、感染率はドナーに依存するため、ヒトDCと リーシュマニア 感染の区別が決定的です。1つの実験で複数のドナーを使用し、健康な リ?...

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開示事項

著者は、競合する金銭的利益がないことを宣言しています。

謝辞

この研究は、バイーア研究支援財団(Fapesb)、助成金番号9092/2015の支援を受けました。著者は、CNPq、Capes、Fapesbが奨学金を通じて財政支援を行ったことを認めています。著者らは、批判的分析、英語の校正、原稿の編集支援を提供してくださったAndris K. Walterに感謝します。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
16 Gauge needleDescarpack353101
24 well cell culture plateJET-BIOFILJ011024
25 Gauge needleDescarpack353601
Albumin from bovine serumSigma AldrichA2153-100G
Ammonium chlorideSigma AldrichA-0171
Anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488InvitrogenA32723
Anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594InvitrogenA11032
Anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 568InvitrogenA11011
CD14 MicroBeadsMACS Myltenyi Biotec130-050-201
Cell Culture Flask 25cm2SPL70125
CellstripperCorning25-056-CI
Confocal microscopeLeicaTCS SP8
Coverslip circles 13mmPerfecta10210013CE
Dissecting ForcepsVWR82027-406
EDTASigma AldrichE6758
Falcon tubeKASVIK19-0051
Fetal Bovine Serumgibco16000044
Fluorescence microscopeOlympus BX51
Glass slide  25,4x76,2mmPerfecta200
Hemin bovineSigma AldrichH2250
HemocytometerPerfecta7302HD
Histopaque® 1077Sigma Aldrich10771
MACS bufferMACS Myltenyi Biotec130-091-221
Minimum Essential MediumGibco41090093
Mouse anti-Rac1BD610650
ParaformaldehydeSigma Aldrich158127
Phalloidin Alexa Fluor 488InvitrogenA12379
Phosphate Buffered SalineThermoFisherAM9624
Polycarbonate Membrane Transwell Inserts - Pore size 5.0 µmCorning3421
ProLong Gold DAPI kitInvitrogenP36931
Rabbit anti-Cdc42InvitrogenPA1-092X
Rabbit anti-FAK (pTyr397)InvitrogenRC222574
Rabbit anti-paxilin (pTyr118)InvitrogenQF221230
Rabbit anti-RhoAInvitrogenOSR00266W
Recombinant Human CCL3R&D Systems270-LD-010
Recombinant Human GM-CSFPeproTech300-03
Recombinant Human IL-4PeproTech200-04
Recombinant Human M-CSFPeproTech300-25
RPMI 1640 MediumGibco21870076
SaponinSigma Aldrich47036 – 50G – F
Syringe 3 mLDescarpack324201
Trypan BlueGibco15250061

参考文献

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