JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו חוקרים את ההשלכות של אינטראקציה בין לישמניה-מארח על ידי חקירת נדידת תאים דנדריטיים נגועים בלישמניה. מתוארים התמיינות וזיהום של תאים דנדריטיים, ניתוח נדידה והערכת מתחמי הידבקות ודינמיקת אקטין. ניתן ליישם שיטה זו במחקרי נדידת תאים מארחים אחרים כאשר הם נגועים בלישמניה או מיני טפילים תוך-תאיים אחרים.

Abstract

לישמניה הוא טפיל פרוטוזואי תוך-תאי הגורם לספקטרום רחב של ביטויים קליניים, החל מנגעים עוריים מקומיים המתפרקים מעצמם ועד לצורה קרבית קטלנית ביותר של המחלה. על פי הערכות, 12 מיליון אנשים ברחבי העולם נדבקים כיום, ועוד 350 מיליון נמצאים בסכנת הדבקה. ידוע שתאי מארח הנגועים בטפילי לישמניה , כגון מקרופאגים או תאים דנדריטיים, יכולים לנדוד לרקמות מארח שונות, אך כיצד הנדידה תורמת להפצת הטפילים ולביות נותרה לא מובנת היטב. לכן, הערכת יכולתם של טפילים אלה לווסת את תגובת התא המארח, ההידבקות והנדידה תשפוך אור על המנגנונים המעורבים בהפצת מחלות ובוויסרליזציה. נדידת תאים היא תהליך מורכב בו תאים עוברים קיטוב ובליטה, מה שמאפשר להם לנדוד. תהליך זה, המווסת על ידי דינמיקת מיקרו-צינורות מבוססת אקטין וטובולין, כרוך בגורמים שונים, כולל אפנון ההידבקות התאית למצע. תהליכי הידבקות והגירה תאיים נחקרו באמצעות מספר מודלים. כאן, אנו מתארים שיטה לאפיון ההיבטים הנודדים של תאי מארח במהלך זיהום לישמניה . פרוטוקול מפורט זה מציג את ההתמיינות והזיהום של תאים דנדריטיים, ניתוח התנועתיות והנדידה של תאי המארח, והיווצרות מתחמי הידבקות ודינמיקת אקטין. פרוטוקול מבחנה זה נועד להבהיר עוד יותר את המנגנונים המעורבים בהפצת לישמניה, בתוך רקמות מארחות של בעלי חוליות, וניתן גם לשנות אותו וליישם אותו במחקרי נדידת תאים אחרים.

Introduction

לישמניאזיס, מחלה טרופית מוזנחת הנגרמת על ידי טפילי פרוטוזואים השייכים לסוג לישמניה, גורמת למגוון רחב של ביטויים קליניים, החל מנגעים עוריים מקומיים בריפוי עצמי ועד לצורות קרביות קטלניות של המחלה. ההערכה היא כי עד מיליון מקרי לישמניאזיס חדשים מתעוררים מדי שנה, כאשר 12 מיליון אנשים נדבקים כיום ברחבי העולם1. לישמניאזיס קרביים (VL), שעלולה להיות קטלנית ביותר מ-95% מהמקרים כאשר אינה מטופלת, גורמת ליותר מ-50,000 מקרי מוות מדי שנה, ומשפיעה על מיליונים בדרום אמריקה, מזרח אפריקה, דרום אסיהואזור הים התיכון. הגורם האטיולוגי העיקרי של VL בעולם החדש, Leishmania infantum, מועבר לבני אדם על ידי נקבות זבובי חול נגועות במהלך הזנת דם3. טפילים אלה מזוהים ומופנמים על ידי פגוציטים, למשל, מקרופאגים ותאים דנדריטיים 3,4,5. בתוך תאים אלה, טפילים מתמיינים לצורות התוך תאיות שלהם, הידועות בשם אמסטיגוטים, אשר לאחר מכן יתרבו ויועברו דרך מערכת הלימפה וזרם הדם לרקמות מארחות שונות 6,7. עם זאת, המנגנונים שבאמצעותם טפילי לישמנייה מופצים במארח החולייתנים, כמו גם התפקיד שממלאת נדידת התאים המארחים בתהליך זה, נותרו לא ברורים.

נדידת תאים היא תהליך מורכב המבוצע על ידי כל התאים הגרעיניים, כולל לויקוציטים8. על פי מודל המחזור הקלאסי של נדידת תאים, תהליך זה כולל מספר אירועים מולקולריים משולבים שניתן לחלק לחמישה שלבים: בליטה מובילה; הידבקות של הקצה המוביל למגעי מטריצה; התכווצות של ציטופלזמה תאית; שחרור הקצה האחורי של התא מאתרי מגע; ומיחזור קולטני ממברנה מהחלק האחורי לקדמת התא9.

כדי שנדידת התאים תתרחש, יש ליצור בליטות ואז לייצב אותן באמצעות הצמדה למטריצה החוץ-תאית. בין סוגי הקולטנים השונים המעורבים בקידום נדידת התאים, בולטים אינטגרינים. הפעלת אינטגרין מביאה לאיתות הקשור להגירה; איתות תוך-תאי מתרחש לאחר מכן באמצעות קינאז הידבקות מוקדית (FAK) וקינאזות ממשפחת Src, בנוסף למולקאות טלין, וינקולין ופקסילין 10,11,12. הזרחן של פקסילין על ידי קינאזות מופעלות, כולל FAK, מוביל לגיוס מולקולות אפקטור, אשר מתמיר אותות חיצוניים המעודדים נדידת תאים. הוכח כי פקסילין היא מולקולה תוך-תאית החיונית להידבקות תאים, פילמור אקטין ותהליכי נדידת תאים 13,14,15.

השלד הציטולוגי של האקטין ממלא תפקיד מרכזי בקיטוב ובנדידה של פגוציטים16. במהלך תהליך נדידת התאים, בליטות שנוצרו עקב פילמור אקטין מתייצבות באמצעות הידבקות תאים למטריצה החוץ-תאית. תהליך זה עשוי להיות מווסת על ידי קולטני אינטגרין הקשורים לשלד הציטו של אקטין 17,18,19. מספר חלבונים קושרי אקטין מווסתים את קצב וארגון פילמור האקטין בבליטות תאיות20. מחקרים הראו כי RhoA, Rac ו-Cdc42 מווסתים את ארגון מחדש של אקטין לאחר גירוי של תאים דבקים על ידי גורמים חוץ-תאיים21,22. במהלך הנדידה, Rac1 ו- Cdc42 ממוקמים בקצה המוביל של התא, ושולטים בהרחבה של lamellipodia ו- filopodia, בהתאמה, ואילו RhoA, הממוקם בחלק האחורי של התא, מווסת את התכווצות השלד הציטולוגי של האקטומיוזין 15,23,24,25.

מחקרים הראו כי זיהום בלישמניה מווסת את תפקודי התא המארח, כגון הידבקות למצע התאי ונדידה 26,27,28,29,30,31. DCs לא בשלים שוכנים ברקמות היקפיות; באינטראקציה עם PAMPS, תאים אלה מופעלים ונודדים לבלוטות הלימפה המנקזות, מה שגורם להצגת אנטיגן לתאי T. מחקר קודם שהשתמש במודל עכבר הראה כי זיהום L. amazonensis מעורר הפחתה בנדידת DCs לניקוז בלוטות הלימפה29. כמו כן הוכח כי עיכוב תהליך ההדבקה הפחית את נדידת ה-DC לאחר זיהום ב-L. major30. עם זאת, ההשפעה של נדידת DC על התפשטות הטפילים בפונדקאי, כמו גם המנגנונים המעורבים בתהליך זה, נותרו לא מובנים היטב.

כאן אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב לביצוע בדיקת הידבקות והגירה במבחנה הכוללת DCs אנושיים הנגועים בלישמניה. שיטה זו כוללת לא רק התמיינות והדבקה של DCs, אלא גם מאפשרת ניתוח של תנועתיות ונדידה של תאי מארח, היווצרות קומפלקסים של הדבקה, כמו גם דינמיקת אקטין. פרוטוקול המבחנה המתואר כיום מאפשר לחוקרים לחקור עוד יותר את המנגנונים המעורבים בהתפשטות הלישמניה בתוך רקמות מארחות של בעלי חוליות וניתן גם לתמרן אותו וליישם אותו במחקרי נדידת תאים אחרים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הנהלים המתוארים כאן אושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של מכון גונסאלו מוניז (IGM-FIOCRUZ, פרוטוקול מס' 2.751.345). דגימות דם נלקחו מתורמים מתנדבים בריאים. הליכי ניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם לעקרונות האתיים במחקר בבעלי חיים שאומצו על ידי החוק הברזילאי 11.784/2008 ואושרו ואושרו על ידי הוועדה האתית למחקר בבעלי חיים של מכון גונסאלו מוניז (IGM-FIOCRUZ, פרוטוקול מס' 014/2019).

1. בידוד והתמיינות של תאים דנדריטיים אנושיים

  1. פיפטה 10 מ"ל של מדיום שיפוע הצפיפות בצינורות צנטריפוגה של 50 מ"ל.
  2. סמן את הצינורות של 50 מ"ל בהתאם לדגימה של כל תורם.
  3. אסוף ~ 50 מ"ל דם ורידי מתורמים בריאים ולאחר האיסוף, בצע את ההליכים המתוארים להלן בארון הזרימה.
  4. מעבירים בזהירות את הדם שנאסף לצינורות צנטריפוגה ומדללים בתמיסת מלח (0.9% נתרן כלורי) ביחס של 1:1 בטמפרטורת החדר.
  5. שכבו לאט את הדם המדולל על החלק העליון של מדיום שיפוע הצפיפות.
  6. צינורות צנטריפוגה המכילים את מדיום שיפוע הדם והצפיפות ב-400 x g למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: כבה את הבלם לפני הצנטריפוגה כדי למנוע ערבוב של שכבות שיפוע. לאחר הצנטריפוגה הראשונה, הורד את טמפרטורת הצנטריפוגה ל -4 מעלות צלזיוס.
  7. הסר בזהירות את הצינורות מהצנטריפוגה.
  8. זהה את טבעת התאים החד-גרעיניים של הדם ההיקפי (PBMC) בדגימה (מעיל באפי); הסר בעדינות את שאריות הפלזמה בעזרת פיפטה.
    הערה: לאחר הצנטריפוגה, ייווצרו שכבות השיפוע הבאות: אריתרוציטים, מדיום שיפוע צפיפות, טבעת PBMC ופלזמה. טבעת PBMC ממוקמת בין מדיום שיפוע הצפיפות לשכבות הפלזמה.
  9. העבירו את שכבת ה-PBMC דמוית הענן לצינור חדש והעלו את הנפח ל-30 מ"ל עם תמיסת מלח.
  10. צנטריפוגה הצינורות המכילים תרחיף תאים ב-250 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של תמיסת מלח.
  11. אסוף ציטוט עבור ספירת תאים בשיטת אי הכללת הטריפן הכחול. ראשית, יש לדלל ביחס של 1:1,000. לאחר מכן, השתמש ב-10 מיקרוליטר מהתאים המדוללים לצביעה כחולה של טריפאן וספירת תאים באמצעות תא נויבאואר כדי לקבוע את כדאיות התא.
  12. שוב צנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 10 דקות מתחת ל-4 מעלות צלזיוס.
  13. השעו מחדש את הגלולה במאגר MACS. השתמש ב-80 מיקרוליטר של המאגר עבור כל 1 x 107 תאים.
    הערה: הרכב מאגר MACS: הכן תמיסה המכילה מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS), pH 7.2, 0.5% אלבומין בסרום בקר (BSA) ו-2 מ"מ EDTA. יש לדלל את תמיסת החיץ ביחס של 1:20 עם תמיסת השטיפה. שמור את המאגר קר ואחסן בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס.
  14. הוסף מיקרו-חרוזי CD14 לתרחיף התאים שהוכן בשלב 1.13. השתמש ב-20 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזי CD14 לכל 1 x 107 תאים.
    הערה: מיקרו-חרוזי CD14 משמשים לבחירה חיובית של מונוציטים אנושיים מ-PBMCs, שכן חרוזים נקשרים לתאים חיוביים ל-CD14 המתבטאים ברוב המונוציטים.
  15. הומוגניזציה של התמיסה המכילה את הגלולה והמיקרו-חרוזים באמצעות פיפטה. שמור על קרח למשך 15 דקות.
  16. צנטריפוגה את המתלה ב-300 x g למשך 10 דקות מתחת ל-4 מעלות צלזיוס.
  17. השעיית תאים במאגר MACS. השתמש ב-1-2 מ"ל עבור 1 x 107 תאים בתערובת המיקרו-חרוזים של התא.
  18. צנטריפוגה את המתלה ב-300 x g למשך 10 דקות מתחת ל-4 מעלות צלזיוס.
  19. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מאגר MACS.
    הערה: זהו הנפח המרבי של מתלה התא שניתן לעבד באמצעות עמודה אחת.
  20. הרכיבו את העמוד המגנטי.
  21. שטפו את העמודה פעם אחת על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של מאגר MACS. אפשר למאגר לזרום תחת כוח הכבידה דרך העמודה.
    הערה: אל תאפשר לעמוד להתייבש, מכיוון שכל אוויר שנכנס עלול לחסום את העמוד.
  22. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת דגימת התא משלב 1.19 לכל עמודה. אפשר לתמיסת דגימת התא לזרום תחת כוח הכבידה דרך העמודה.
  23. שטפו את העמודה על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של מאגר MACS (פי 2). הוסף את המאגר הטרי רק כאשר מאגר העמודים ריק. הימנע מייבוש.
  24. פיפטה 1 מ"ל של מאגר ה-MACSעל העמוד והנח אותו בצינור חדש מתחתיו. שטוף מיד את התאים המסומנים מגנטית על ידי דחיפה חזקה של הבוכנה לתוך העמודה.
  25. צנטריפוגה התאים המועשרים CD14 ב-300 x g למשך 10 דקות מתחת ל-4 מעלות צלזיוס.
  26. ספרו תאים באמצעות תא נויבאואר.
  27. השעיה מחדש של תאים ב-1 מ"ל RPMI מלא עם אינטרלוקין-4 (IL-4) (100 מיקרוליטר / מ"ל) + גורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים (GM-CSF) (50 ננוגרם/מ"ל).
    הערה: GM-CSF הוא ציטוקין המופרש על ידי מקרופאגים, תאי T, תאי פיטום, תאי הרג טבעיים, תאי אנדותל ופיברובלסטים הגורם להתמיינות ושגשוג של אבות מיאלואידים במח העצם. GM-CSF ו-IL-4 משמשים לגרימת התמיינות תאים דנדריטיים32.
  28. תאי זרע בצלחת של 24 בארות בריכוז של 2 × 105 תאים לבאר ב -500 מיקרוליטר של מדיום RPMI שלם המכיל ודוגר את התאים במשך 7 ימים בחממת תרבית התאים ב -37 מעלות צלזיוס.

2. טיפוח לישמניה אינפנטום

הערה: טפילי Leishmania infantum (MCAN/BR/89/BA262) משמשים בבדיקה זו. אוגרים נדבקו תוך ורידי ב-20 מיקרוליטר של התמיסה המכילה 1 x 106 L. infantum promastigotes בתמיסת מלח סטרילית. לאחר חודש עד חודשיים, בעלי חיים הומתו בהמתת חסד וצורות האמסטיגוט של הלישמניה נמצאו מהטחול שלהם והובחנו לפומסטיגוטים33.

  1. לגדל L . infantum promastigotes שבודדו מטחול אוגר שנדבק בעבר בבקבוק תרביתתאים משופע בגודל 25 ס"מ 2 המכיל 3 מ"ל של מדיום Novy-Nicolle-MacNeal (NNN) ו-5 מ"ל של מדיום חיוני מינימלי (MEM).
    הערה: בבדיקה זו, מדיום MEM הוסיף 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-24.5 ננומטר בקר המין.
  2. דגירה בטמפרטורה של 24 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים בחממת BOD (ביקוש לביו-חמצן).
  3. פיפטה 100 מיקרוליטר של תרבית פרומסטיגוט לתוך בקבוק תרבית תאים חדש בגודל 25 ס"מ2 המכיל 5 מ"ל של מדיום MEM משלים.
  4. דגרו את תרבית הפרומסטיגוט בטמפרטורה של 24 מעלות צלזיוס בחממת BOD עד שהפרומסטיגוטים מגיעים לשלב הנייח. ספור מעת לעת פרומסטיגוטים מתורבתים על ידי העברת אליקוט של תרחיף טפילים מדולל במי מלח לתא נויבאואר (כלומר, המוציטומטר) כדי לקבוע את שלב הגידול הנייח.
    הערה: לא מומלץ להשתמש בטפילי המעבר הראשון לאחר הגידול במדיום NNN כדי למנוע שאריות של דם ארנב.
  5. העבירו 1 x 105 של תרבית שלב גדילה נייחת של L. infantum promastigotes לבקבוק תרביתתאים חדש בגודל 25 ס"מ 2 והוסיפו 5 מ"ל של מדיום משלים MEM.
  6. עקוב אחר צמיחת התרבית מעת לעת במשך כ -7 ימים באמצעות תא נויבאואר עד להשגת השלב הנייח. טפילים מוכנים כעת לשימוש בהליכי זיהום ניסיוניים.
    הערה: תרביות פרומסטיגוט נחשבות כברות קיימא לזיהום עד 7 מעברים במבחנה; מעברים נוספים עלולים לגרום לאובדן אלימות.

3. זיהום בתאים דנדריטיים אנושיים

  1. בתוך ארון זרימה למינרית ביולוגית, העבירו את כל התכולה מבקבוק תרבית הטפילים לצינורות צנטריפוגה של 50 מ"ל.
  2. הוסף תמיסת מלח קרה לנפח סופי של 40 מ"ל.
  3. צנטריפוגה ב-1,600x גרם למשך 10 דקות מתחת ל-4 מעלות צלזיוס.
  4. יש להשליך את הסופרנטנט לאחר הצנטריפוגה ולהשעות מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של תמיסת מלח קרה (חזור על שלבים 3.3-3.4 שלוש פעמים).
  5. לאחר שטיפת התאים כדי להסיר טפילים שאינם ברי קיימא, השעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של תמיסת מלח קרה.
  6. העבירו את התוכן לאט דרך מזרק של 1 מ"ל עם מחט 16 גרם 5 פעמים כדי להפריד בין אשכולות הטפילים.
  7. הסר אליקוט כדי לקבוע את ריכוז הטפיל בהמוציטומטר (חשב את המספר הממוצע של טפילים ב-4 רבעים x גורם דילול x 104).
  8. שטפו תאים דנדריטיים על ידי הוספת 1 מ"ל תמיסת מלח ותאי צנטריפוגה ב -300 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (פי 3).
  9. לחשב את כמות ה-L. infantum הנדרשת לזיהום הניסיוני; יחס: 20 טפילים לתא.
  10. מניחים את הנפח הנדרש של L. infantum בכל באר של צלחות תרבית תאים.
  11. דגירה של תאים דנדריטיים עם טפילים למשך 4 שעות בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% CO2.
  12. לאחר שלב 3.11, צלחות צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 10 דקות מתחת ל-4 מעלות צלזיוס.

4. בדיקת הגירה באמצעות תוספות תרבית תאים

  1. לאחר ההדבקה יש לשטוף תאים דנדריטיים (נגועים או לא) 3 פעמים עם 1 מ"ל תמיסת מלח בטמפרטורת החדר כדי להסיר טפילים לא מופנמים. לאחר כל שטיפה, צלחות צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 10 דקות מתחת ל-4 מעלות צלזיוס.
  2. לאחר הסרת טפילים לא מופנמים, נתק תאים על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של מגיב דיסוציאציה של התאים בכל באר ודגירה למשך 15 דקות. שמור את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% CO2.
  3. הומוגניזציה של תאים באמצעות קצה פיפטה של 1,000 מיקרוליטר כדי לאפשר לתאים להשתחרר.
  4. העבירו את התאים המנותקים לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
  5. צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 10 דקות מתחת ל-4 מעלות צלזיוס.
  6. השעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מדיום RPMI בתוספת 10% FBS.
  7. העבירו את התוכן של כל צינור לאט דרך מזרק של 1 מ"ל עם מחט 25 גרם 5 פעמים כדי להפריד בין תאים.
  8. הסר אליקווט, דלל באמצעות טריפאן כחול כדי לקבוע את ריכוז התאים באמצעות המוציטומטר (ממוצע של תאים ברי קיימא ב -4 רבעים × גורם דילול × 104).
  9. הכנת תוספות מיקרו-צלחת תרבית תאים:
    הערה: תוספות תרבית תאים (קרום פוליקרבונט נקבובי 5.0 מיקרומטר) מומלצות לבדיקות נדידה באמצעות תאים דנדריטיים, מקרופאגים ומונוציטים, מכיוון שתוספות אלו מאפשרות לפגוציטים לעבור דרך הממברנות.
    1. הסר את התוספות בעזרת פינצטה סטרילית והניח בבארות ריקות.
    2. הוסף 600 מיקרוליטר של מדיום RPMI בתוספת 10% FBS לכל באר; הוסף כימוקין כימואטרקטיבי (מוטיב C-C) ליגנד 3 (CCL3) (1 מיקרוליטר לכל 1 מ"ל של מדיום).
      הערה: CCL3 הוא כימוקין המווסת את העברת DC34.
    3. בעזרת פינצטה סטרילית, הניחו תוספות בבארות המכילות את המדיום.
  10. הוסף 2 x 105 תאים דנדריטיים (נגועים או לא) ב-100 מיקרוליטר של מדיום לכל תוספת.
  11. דגירה במשך 4 שעות כדי לאפשר לתאים לנדוד.
  12. לאחר 4 שעות, הוציאו את הצלחת ושאבו את המדיום. מוסיפים 100 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד ודוגרים למשך 15 דקות.
  13. הסר פרפורמלדהיד והוסף 100 מיקרוליטר תמיסת מלח.
    הערה: ניתן לשמור צלחות ב-4 מעלות צלזיוס להרכבה מאוחרת יותר.
  14. אספו את הסופרנטנט מתוספות או מבארות כדי לספור תאים שאינם נודדים או כאלה שחצו את הממברנה, בהתאמה. דגירה עם פרפורמלדהיד 4% למשך 15 דקות.
  15. לרכז תאים בטכניקת ציטוצנטריפוגה35.
  16. הוסף 10 מיקרוליטר מאמצעי ההרכבה עם DAPI לממברנות והניח כיסויים מעל הבארות.
  17. הרכבת קרום ההכנסה.
    הערה: ניתן לבצע שלב זה מחוץ לארונות הבטיחות הביולוגית.
    1. הסר את ממברנות ההכנסה מבארות.
    2. מגרדים את פני התוספת בעזרת ספוגית כדי להסיר תאים שלא נדדו.
    3. בעזרת אזמל, הסר את הממברנה מהתוספת.
    4. הניחו את הממברנה על שקופית, כשהתאים פונים כלפי מעלה.
    5. הוסף 10 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה עם DAPI לכל ממברנה ולאחר מכן הנח כיסויי כיסוי.
    6. מכסים את הצלחות בנייר אלומיניום.
    7. דגרו צלחות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, ולאחר מכן אחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס
  18. כדי לנתח נדידת תאים, ספרו את מספר התאים בכל שדה (לא פחות מ-10 שדות) באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי באורך גל עירור לייזר של 405 ננומטר.

5. בדיקת הידבקות והערכה של פילמור אקטין על ידי אימונופלואורסצנציה

הערה: לבדיקה זו, השתמש בצלחות 24 בארות עם כיסויים.

  1. לאחר הדבקת תאים למשך 4 שעות, יש לשטוף כל באר 3 פעמים בתמיסת מלח סטרילית בטמפרטורת החדר כדי להסיר טפילים שאינם מופנמים.
  2. צנטריפוגה את הצלחת ב-300 x גרם למשך 10 דקות מתחת ל-4 מעלות צלזיוס. הוסף 500 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד לכל באר למשך 15 דקות.
  3. הסר פרפורמלדהיד והוסף 1 מ"ל תמיסת מלח.
  4. הכן פתרונות כמתואר בטבלה 1.
פתרונות עיקרייםתרכובת כימיתמדלל
תמיסת אמוניום כלוריד0,134 גרם NH4Cl50 מ"ל PBS 1X
ספונין 15%150 מ"ג ספונין1 מ"ל דה PBS 1X
אלבומין מסרום בקר (ABS) 10%1 גרם ABS10 מ"ל של PBS 1X
פתרונות משנייםרכיב 1רכיב 2רכיב 3
ספונין 0,15%1 מ"ל ספונין 15%100 מ"ל של PBS 1X-
PBS 1X / ABS 3% / ספונין 0,15%13,8 מ"ל של PBS 1X6 מ"ל של ABS 10%200 מיקרוליטר ספונין 15%
PBS1X / ABS 0,3% / ספונין 0,15%:19,2 מ"ל של PBS 1X0,6 מ"ל של ABS 10%200 מיקרוליטר ספונין 15%
PBS 1X / ABS 1% / ספונין 0,15%17,8 מ"ל של PBS 1X2 מ"ל של ABS 10%200 מיקרוליטר ספונין 15%

טבלה 1: מתכוני חיץ.

  1. צביעה חיסונית
    הערה: יש לבצע את השלבים הבאים תחת תסיסה.
    1. שטפו את הכיסויים 3 פעמים עם 1x PBS למשך 5 דקות.
    2. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת אמוניום כלוריד לבאר למשך 10 דקות.
    3. שטפו את הכיסויים 3 פעמים עם 1x PBS למשך 5 דקות.
    4. מחלחלים את הממברנה עם ספונין 0.15% למשך 15 דקות.
    5. דגרו תאים עם תמיסת החסימה (PBS 1x / ABS 3% / Saponin 0.15%) למשך שעה.
    6. שטפו את הכיסויים 3 פעמים עם PBS 1x/Saponin 0.15% למשך 5 דקות.
    7. דילול נוגדנים ראשוניים ב-PBS 1x /ABS 1% /Saponin 0.15% כגון: Rabbit anti-FAK (pTyr397): דילול 1:500, Rabbit anti-paxilin (pTyr118): דילול 1:100. עכבר Anti-Rac1: דילול 1:100. ארנב נגד CDC42: דילול 1:200. ארנב נגד RhoA: דילול 1:200.
    8. דגירה של תאים עם נוגדן ראשוני מדולל ב-PBS 1x/ABS 1%/Saponin 0.15% למשך שעה.
      הערה: FAK ו-Paxillin הן מולקולות מפתח המעורבות ביצירת קומפלקסים של הידבקות 13,14,15. משפחת Rho GTPase אחראית על ארגון השלד הציטולוגי של האקטין. RAC1 ו- Cdc42, הממוקמים בקצה הקדמי של התא, שולטים בהיווצרות lamellipodia ו- filopodia, בהתאמה; RhoA ממוקם בחלק האחורי של התא ומעורב בהתכווצות שלד התא15, 23,24,25.
    9. שטפו את הכיסויים 3 פעמים עם 1x PBS/Saponin 0.15% למשך 5 דקות.
    10. לדלל נוגדן משני או פלואידין באופן הבא: IgG נגד ארנב, Alexa Fluor 568: דילול 1:500; IgG נגד עכבר, Alexa Fluor 488: דילול 1:500; IgG נגד עכבר, Alexa Fluor 594: דילול 1:500; Phalloidin Alexa Fluor 488: דילול 1:1200.
    11. דגירה של תאים עם נוגדן משני או פלואידין מדולל ב-1x PBS/ABS 0.3% ספונין 0.15% למשך 45 דקות.
      הערה: הדגירה של הנוגדן המשני או הפאלואידין צריכה להתבצע בהיעדר אור. מכסים את הצלחות בנייר אלומיניום להגנה מפני אור במהלך השלבים הבאים.
    12. שטפו את הכיסויים 3 פעמים עם 1x PBS למשך 5 דקות.
    13. הסר כיסויים מבארות.
    14. בהיעדר אור, הוסף 10 מיקרוליטר של מדיום הרכבה עם DAPI על שקופיות זכוכית מיקרוסקופיות נקיות.
    15. הנח פתקי כיסוי כשהתאים פונים כלפי מטה כדי לאפשר מגע בין התאים לתמיסת DAPI.
      הערה: הכיסוי מחליק בנייר אלומיניום להגנה מפני אור.
    16. דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    17. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.

6. מיקרוסקופיה קונפוקלית, רכישת תמונות וכימות באמצעות פיג'י

הערה: כדי לרכוש/ללכוד תמונות אימונופלואורסצנטיות, השתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. עדשה אובייקטיבית 63x טבולה בשמן מומלצת לרזולוציה אופטימלית.

  1. אפשר לכיסויים להגיע לטמפרטורת החדר, מוגנים מפני אור, למשך 30 דקות לפחות לפני רכישת התמונה.
  2. נקה את הכיסויים ברקמה סופגת.
  3. הוסף טיפת שמן טבילה למטרה והנח כל שקופית מתחת למיקרוסקופ.
  4. הזז את המטרה עד שהשמן נוגע בשקופית.
  5. התבונן והתאם את מיקוד המיקרוסקופ; בחר את המטרה פי 63 עם שמן.
  6. הפעל לייזרים באורכי גל של 488 ננומטר, 552 ננומטר ו-405 ננומטר .
  7. בחר רזולוציית תמונה: 1024 x 1024.
  8. לחץ על כפתור Live , הגדר את מחסנית Z ולחץ על Begin. חזור על התהליך ולאחר מכן לחץ על סיום.
  9. לאחר בחירת האפשרות הקרנה מקסימלית בתפריט כלי , המתן לרכישת התמונה.
  10. שמור את הניסוי.
  11. ייצוא תמונות בתבנית .lif במחשב. השתמש בתוכנת ניתוח תמונות בקוד פתוח של FIJI כדי לנתח תמונות.
  12. בחר את התמונות לניתוח ובחר שכפל תמונה.
  13. כדי שהתמונה תהיה בגווני אפור, בחר Image | התאם | סף צבע. בחר 0 ו- 255 (רוויה).
  14. בחר את שיטת הסף: ברירת מחדל.
  15. בחר צבע סף: B ו-W (שחור-לבן).
  16. אל תבחר רקע כהה.
  17. בחר: תהליך | בינארי | אפשרויות ולאחר מכן בחר את הנתונים הרלוונטיים למדידה: שטח, מינימום, מקסימום, ערך אפור, שילוב צפיפות.
  18. בחר את כלי הידיים החופשיות בסרגל הכלים של פיג'י ועקוב אחר כל תא באופן ידני בקפידה.
  19. בתפריט Analyze , בחר Set measurements. הקפד לבחור את עוצמת האזור המשולב ואת הערך האפור הממוצע. חזור על תהליך זה עבור כל תא.
  20. בחר את כל הנתונים בחלון התוצאות והעתק והדבק בקובץ גיליון אלקטרוני.
  21. חשב את הקרינה הכוללת המתוקנת של התאים (CTCF): CTCF (אינטגרציה צפיפות = שטח התא שנבחר x פלואורסצנטיות ממוצעת של קריאות רקע).
  22. פתח את הקובץ המכיל נתונים באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי לביצוע ניתוח סטטיסטי.

7. ניתוח סטטיסטי

  1. פתח פרוייקט חדש כאשר מופיעה תיבת דו-שיח של ברוכים הבאים.
  2. בחר את סוג הגרף והמדיום עם SD.
  3. החל את הערכים שהתקבלו מתוצאות הניסוי על הטבלה.
  4. בחר סטטיסטיקה תיאורית ובחר בעמודת האפשרות סטטיסטיקה [כל הבדיקות] כדי לנתח את התפלגות הנתונים.
  5. אם הנתונים עוקבים אחר התפלגות גאוס, בחר במבחן t כדי לנתח דגימות על ידי השוואה בין שני זוגות. אם ההתפלגות אינה גאוסית, נתח נתונים באמצעות מבחן מאן-וויטני.
  6. בחר את אפשרות הגרף הטובה ביותר לייצוג נתונים אופטימלי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

פרוטוקול זה המתואר כאן מאפשר להעריך את נדידת התאים והמנגנונים הנלווים אליה, כגון דינמיקת אקטין והדבקה, ובכך מספק כלי לקביעת הנדידה של תאי מארח נגועים בלישמניה בתוך מארח החולייתנים. התוצאות המוצגות כאן מדגימות כי בדיקה חוץ גופית זו מספקת אינדיקציות מהירות ועקב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

השיטה המתוארת כאן להערכת נדידת תאים באמצעות מערכת הוספות ממברנה של תרבית תאים מאפשרת לחוקרים לחקור את תגובת הנדידה של תאים בסביבה דו-ממדית. בטכניקה זו, שלבים מסוימים נחשבים קריטיים. ראשית, ההבחנה בין DCs אנושיים והדבקה בלישמניה הם מכריעים מכיוון ששיעור ההדבקה תלוי ב?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי קרן התמיכה במחקר של באהיה (Fapesb), מענק מספר 9092/2015. המחברים מודים ל-CNPq, Capes ו-Fapesb על התמיכה הכספית באמצעות מלגות. המחברים מבקשים להודות לאנדריס ק. וולטר על ניתוח ביקורתי, תיקון בשפה האנגלית וסיוע בעריכת כתבי יד.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
16 Gauge needleDescarpack353101
24 well cell culture plateJET-BIOFILJ011024
25 Gauge needleDescarpack353601
Albumin from bovine serumSigma AldrichA2153-100G
Ammonium chlorideSigma AldrichA-0171
Anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488InvitrogenA32723
Anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594InvitrogenA11032
Anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 568InvitrogenA11011
CD14 MicroBeadsMACS Myltenyi Biotec130-050-201
Cell Culture Flask 25cm2SPL70125
CellstripperCorning25-056-CI
Confocal microscopeLeicaTCS SP8
Coverslip circles 13mmPerfecta10210013CE
Dissecting ForcepsVWR82027-406
EDTASigma AldrichE6758
Falcon tubeKASVIK19-0051
Fetal Bovine Serumgibco16000044
Fluorescence microscopeOlympus BX51
Glass slide  25,4x76,2mmPerfecta200
Hemin bovineSigma AldrichH2250
HemocytometerPerfecta7302HD
Histopaque® 1077Sigma Aldrich10771
MACS bufferMACS Myltenyi Biotec130-091-221
Minimum Essential MediumGibco41090093
Mouse anti-Rac1BD610650
ParaformaldehydeSigma Aldrich158127
Phalloidin Alexa Fluor 488InvitrogenA12379
Phosphate Buffered SalineThermoFisherAM9624
Polycarbonate Membrane Transwell Inserts - Pore size 5.0 µmCorning3421
ProLong Gold DAPI kitInvitrogenP36931
Rabbit anti-Cdc42InvitrogenPA1-092X
Rabbit anti-FAK (pTyr397)InvitrogenRC222574
Rabbit anti-paxilin (pTyr118)InvitrogenQF221230
Rabbit anti-RhoAInvitrogenOSR00266W
Recombinant Human CCL3R&D Systems270-LD-010
Recombinant Human GM-CSFPeproTech300-03
Recombinant Human IL-4PeproTech200-04
Recombinant Human M-CSFPeproTech300-25
RPMI 1640 MediumGibco21870076
SaponinSigma Aldrich47036 – 50G – F
Syringe 3 mLDescarpack324201
Trypan BlueGibco15250061

References

  1. Burza, S., Croft, S. L., Boelaert, M. Leishmaniasis. The Lancet. 392 (10151), 951-970 (2018).
  2. Bi, K., Chen, Y., Zhao, S., Kuang, Y., John Wu, C. H. Current Visceral Leishmaniasis Research: A Research Review to Inspire Future Study. BioMed Research International. 2018, (2018).
  3. Serafim, T. D., Iniguez, E., Oliveira, F. Leishmania infantum. Trends in Parasitology. 36 (1), 80-81 (2020).
  4. Van Assche, T., Deschacht, M., da Luz, R. A. I., Maes, L., Cos, P. Leishmania-macrophage interactions: Insights into the redox biology. Free Radical Biology and Medicine. 51 (2), 337-351 (2011).
  5. Podinovskaia, M., Descoteaux, A. Leishmania and the macrophage: A multifaceted interaction. Future Microbiology. 10 (1), 111-129 (2015).
  6. Antoine, J. C., Prina, E., Jouanne, C., Bongrand, P. Parasitophorous vacuoles of Leishmania amazonensis-infected macrophages maintain an acidic pH. Infection and Immunity. 58 (3), (1990).
  7. Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).
  8. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model. Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).
  9. Sheetz, M. P., Felsenfeld, D., Galbraith, C. G., Choquet, D. Cell migration as a five-step cycle. Biochemical Society symposium. 65, 233-243 (1999).
  10. Yano, H., et al. Roles played by a subset of integrin signaling molecules in cadherin-based cell-cell adhesion. Journal of Cell Biology. 166 (2), 283-295 (2004).
  11. Mitra, S. K., Hanson, D. A., Schlaepfer, D. D. Focal adhesion kinase: In command and control of cell motility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (1), 56-68 (2005).
  12. Deramaudt, T. B., et al. Altering FAK-Paxillin Interactions Reduces Adhesion, Migration and Invasion Processes. PLoS One. 9 (3), (2014).
  13. Turner, C. E. Paxillin and focal adhesion signalling. Nature Cell Biology. 2 (12), (2000).
  14. Linder, S., Aepfelbacher, M. Podosomes: Adhesion hot spots of invasive cells. Trends in Cell Biology. 13 (7), 376-385 (2003).
  15. Huveneers, S., Danen, E. H. J. Adhesion signaling - Crosstalk between integrins, Src and Rho. Journal of Cell Science. 122 (8), 1059-1069 (2009).
  16. Jones, G. E. Cellular signaling in macrophage migration and chemotaxis. Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 593-602 (2000).
  17. De Fougerolles, A. R., Koteliansky, V. E. Regulation of monocyte gene expression by the extracellular matrix and its functional implications. Immunological Reviews. 186 (1), 208-220 (2002).
  18. Cortesio, C. L., Boateng, L. R., Piazza, T. M., Bennin, D. a, Huttenlocher, A. Calpain-mediated proteolysis of paxillin negatively regulates focal adhesion dynamics and cell migration. The Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 9998-10006 (2011).
  19. Verkhovsky, A. B., et al. Orientational order of the lamellipodial actin network as demonstrated in living motile cells. Molecular Biology of the Cell. 14 (11), 4667-4675 (2003).
  20. Ridley, A. J., et al. Cell Migration: Integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
  21. Hall, A. Small GTP-binding proteins, and the regulation of the actin cytoskeleton. Annual Review of Cell Biology. 10, 31-54 (1994).
  22. Machesky, L. M., Hall, A. Rho: A connection between membrane receptor signalling and the cytoskeleton. Trends in Cell Biology. 6 (8), 304-310 (1996).
  23. Ridley, A. J., Hall, A. The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors. Cell. 70 (3), 389-399 (1992).
  24. DeMali, K. A., Burridge, K. Coupling membrane protrusion and cell adhesion. Journal of Cell Science. 116 (12), 2389-2397 (2003).
  25. López-Colomé, A. M., Lee-Rivera, I., Benavides-Hidalgo, R., López, E. Paxillin: A crossroad in pathological cell migration. Journal of Hematology and Oncology. 10 (1), (2017).
  26. Carvalhal, D. G. F., et al. The modelling of mononuclear phagocyte-connective tissue adhesion in vitro: Application to disclose a specific inhibitory effect of Leishmania infection. Experimental Parasitology. 107 (3-4), 189-199 (2004).
  27. Pinheiro, N. F., et al. Leishmania infection impairs β1-integrin function and chemokine receptor expression in mononuclear phagocytes. Infection and Immunity. 74 (7), 3912-3921 (2006).
  28. de Menezes, J. P. B., et al. Leishmania infection inhibits macrophage motility by altering F-actin dynamics and the expression of adhesion complex proteins. Cellular Microbiology. 19 (3), (2017).
  29. Hermida, M. D. R., Doria, P. G., Taguchi, A. M. P., Mengel, J. O., dos-Santos, W. L. C. Leishmania amazonensis infection impairs dendritic cell migration from the inflammatory site to the draining lymph node. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 450(2014).
  30. Ballet, R., et al. Blocking junctional adhesion molecule c enhances dendritic cell migration and boosts the immune responses against Leishmania major. PLoS Pathogens. 10 (12), (2014).
  31. Rocha, M. I., et al. Leishmania infantum enhances migration of macrophages via a phosphoinositide 3-Kinase î-dependent pathway. ACS Infectious Diseases. 6 (7), 1643-1649 (2020).
  32. Hiasa, M., et al. GM-CSF and IL-4 induce dendritic cell differentiation and disrupt osteoclastogenesis through M-CSF receptor shedding by up-regulation of TNF-α converting enzyme (TACE). Blood. 114 (20), 4517-4526 (2009).
  33. de Melo, C. V. B., et al. Phenotypical characterization of spleen remodeling in murine experimental visceral leishmaniasis. Frontiers in Immunology. 11, 653(2020).
  34. Gibaldi, D., et al. CCL3/macrophage inflammatory protein-1α is dually involved in parasite persistence and induction of a TNF- and IFNγ-enriched inflammatory milieu in Trypanosoma cruzi-induced chronic cardiomyopathy. Frontiers in Immunology. 11, 306(2020).
  35. Finger, P. T., Papp, C., Latkany, P., Kurli, M., Iacob, C. E. Anterior chamber paracentesis cytology (cytospin technique) for the diagnosis of intraocular lymphoma. British Journal of Ophthalmology. 90 (6), 690-692 (2006).
  36. Zhang, C., Barrios, M. P., Alani, R. M., Cabodi, M., Wong, J. Y. A microfluidic Transwell to study chemotaxis. Experimental Cell Research. 342 (2), 159-165 (2016).
  37. Glynn, S. A., O'Sullivan, D., Eustace, A. J., Clynes, M., O'Donovan, N. The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors, simvastatin, lovastatin and mevastatin inhibit proliferation and invasion of melanoma cells. BMC Cancer. 8, (2008).
  38. van de Merbel, A. F., vander Horst, G., Buijs, J. T., vander Pluijm, G. Protocols for migration and invasion studies in prostate cancer. Methods in Molecular Biology. 1786, 67-79 (2018).
  39. Omar Zaki, S. S., Kanesan, L., Leong, M. Y. D., Vidyadaran, S. The influence of serum-supplemented culture media in a transwell migration assay. Cell Biology International. 43 (10), 1201-1204 (2019).
  40. Borovikov, I. S. Izuchenie strukturnykh izmeneniǐ sokratitel'nykh belkov myshechnogo volokna s pomoshch'iu poliarizatsionnoǐ ul'trafioletovoǐ fluorestsentnoǐ mikroskopii. VIII. Vliianie glutaral'degida i falloidina na konformatsiiu F-aktina. Tsitologiya. 26 (11), 1262-1266 (1984).
  41. Cooper, J. A. Effects of cytochalasin and phalloidin on actin. The Journal of Cell Biology. 105 (4), 1473-1478 (1987).
  42. Allen, W. E., Jones, G. E., Pollard, J. W., Ridley, A. J. Rho, Rac and Cdc42 regulate actin organization and cell adhesion in macrophages. Journal of Cell Science. 110, 707-720 (1997).
  43. Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved