JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной работе мы изучаем последствия взаимодействия лейшмании и хозяина, исследуя миграцию дендритных клеток, инфицированных лейшманией. Описаны дифференцировка и инфицирование дендритных клеток, миграционный анализ, оценка адгезионных комплексов и динамики актина. Этот метод может быть применен к другим исследованиям миграции клеток-хозяев при заражении Leishmania или другими видами внутриклеточных паразитов.

Аннотация

Leishmania является внутриклеточным простейшим паразитом, который вызывает широкий спектр клинических проявлений, начиная от саморассасывающихся локализованных поражений кожи до крайне смертельной висцеральной формы заболевания. По оценкам, в настоящее время во всем мире инфицированы 12 миллионов человек, и еще 350 миллионов сталкиваются с риском заражения. Известно, что клетки-хозяева, инфицированные паразитами Leishmania , такие как макрофаги или дендритные клетки, могут мигрировать в различные ткани хозяина, но как миграция способствует распространению и хоумингу паразитов, остается плохо изученным. Таким образом, оценка способности этих паразитов модулировать реакцию, адгезию и миграцию клеток-хозяев прольет свет на механизмы, участвующие в распространении и висцерализации заболевания. Клеточная миграция — это сложный процесс, при котором клетки подвергаются поляризации и выпячиванию, что позволяет им мигрировать. Этот процесс, регулируемый динамикой микротрубочек на основе актина и тубулина, включает в себя различные факторы, в том числе модуляцию клеточной адгезии к субстрату. Процессы клеточной адгезии и миграции были исследованы с помощью нескольких моделей. В данной статье мы описываем метод характеристики миграционных аспектов клеток-хозяев во время инфекции лейшмании . В этом подробном протоколе представлены дифференцировка и инфицирование дендритных клеток, анализ подвижности и миграции клеток-хозяев, а также формирование адгезионных комплексов и динамики актина. Этот протокол in vitro направлен на дальнейшее выяснение механизмов, участвующих в распространении Leishmania в тканях позвоночных хозяев, а также может быть модифицирован и применен в других исследованиях миграции клеток.

Введение

Лейшманиоз, забытая тропическая болезнь, вызываемая простейшими паразитами, принадлежащими к роду Leishmania, приводит к широкому спектру клинических проявлений, от самоизлечивающихся локализованных поражений кожи до смертельных висцеральных форм заболевания. По оценкам, ежегодно возникает до одного миллиона новых случаев лейшманиоза, при этом в настоящеевремя во всем мире инфицировано 12 миллионов человек1. Висцеральный лейшманиоз (ВЛ), который может привести к летальному исходу в более чем 95% случаев при отсутствии лечения, ежегодно становится причиной более 50 000 смертей, затрагивая миллионы людей в Южной Америке, Восточной Африке, Южной Азии и Средиземноморскомрегионе. Основной этиологический агент ВЛ в Новом Свете, Leishmania infantum, передается человеку через инфицированных самок москитов вовремя кормления кровью. Эти паразиты распознаются и интернализуются фагоцитами, например, макрофагами и дендритными клетками 3,4,5. Внутри этих клеток паразиты дифференцируются в свои внутриклеточные формы, известные как амастиготы, которые затем размножаются и транспортируются через лимфатическую систему и кровоток к различным тканям хозяина. Тем не менее, механизмы, с помощью которых паразиты Leishmania распространяются в позвоночном организме-хозяине, а также роль, которую играет миграция клеток-хозяев в этом процессе, остаются неясными.

Миграция клеток является сложным процессом, выполняемым всеми клетками с ядрами, включая лейкоциты8. Согласно классической циклической модели миграции клеток, этот процесс включает в себя несколько интегрированных молекулярных событий, которые можно разделить на пять этапов: выпячивание по переднему краю; сцепление передней кромки с контактами матрицы; сокращение клеточной цитоплазмы; освобождение заднего края ячейки от мест контакта; и рециркуляция мембранных рецепторов от заднейчасти клетки к передней части 9.

Для того, чтобы произошла миграция клеток, протрузии должны быть сформированы, а затем стабилизированы путем прикрепления к внеклеточному матриксу. Среди различных типов рецепторов, участвующих в стимулировании миграции клеток, выделяются интегрины. Активация интегрина приводит к передаче сигналов, связанных с миграцией; Внутриклеточная передача сигналов происходит через фокальную киназу адгезии (FAK) и киназы семейства Src, в дополнение к молекам талина, винкулина и паксиллина 10,11,12. Фосфорилирование паксиллина активированными киназами, в том числе FAK, приводит к рекрутированию эффекторных молекул, которые преобразуют внешние сигналы, вызывающие миграцию клеток. Показано, что паксиллин является внутриклеточной молекулой, которая имеет решающее значение для клеточной адгезии, полимеризации актина и процессов миграции клеток 13,14,15.

Актиновый цитоскелет играет центральную роль в поляризации и миграции фагоцитов16. В процессе миграции клеток выпячивания, образующиеся в результате полимеризации актина, стабилизируются за счет адгезии клеток к внеклеточному матриксу. Этот процесс может модулироваться интегриновыми рецепторами, связанными с актиновым цитоскелетом 17,18,19. Несколько актин-связывающих белков регулируют скорость и организацию полимеризации актина в клеточных выпячиваниях20. Исследования показали, что RhoA, Rac и Cdc42 регулируют реорганизацию актина после стимуляции адгезивных клеток внеклеточными факторами21,22. Во время миграции Rac1 и Cdc42 расположены на переднем крае клетки, контролируя распространение ламеллиподий и филоподий соответственно, в то время как RhoA, расположенный в задней части клетки, регулирует сокращение цитоскелета актомиозина 15,23,24,25.

Исследования показали, что инфекция Leishmania модулирует функции клетки-хозяина, такие как адгезия к клеточному субстрату и миграция 26,27,28,29,30,31. Незрелые ДК находятся в периферических тканях; при взаимодействии с PAMPS эти клетки активируются и мигрируют в дренирующие лимфатические узлы, вызывая презентацию антигена к Т-клеткам. Предыдущее исследование с использованием мышиной модели показало, что инфекция L. amazonensis провоцирует снижение миграции ДК в дренирующие лимфатические узлы29. Также было показано, что ингибирование процесса адгезии снижает миграцию ДК после инфицирования L. major30. Тем не менее, влияние миграции ДК на распространение паразитов в организме хозяина, а также механизмы, участвующие в этом процессе, остаются недостаточно изученными.

Здесь мы представляем составленный пошаговый протокол для проведения анализа адгезии и миграции in vitro с участием ДК человека, инфицированных Leishmania. Этот метод включает в себя не только дифференцировку и инфицирование ДК, но также позволяет анализировать подвижность и миграцию клеток-хозяев, образование адгезионных комплексов, а также динамику актина. Описанный в настоящее время протокол in vitro позволяет исследователям глубже исследовать механизмы, участвующие в распространении Leishmania в тканях позвоночных хозяев, а также может быть использован и применен в других исследованиях миграции клеток.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Описанные в настоящем документе процедуры были одобрены Советом по институциональному контролю Института Гонсалу Мониша (IGM-FIOCRUZ, протокол No 2.751.345). Образцы крови были получены от здоровых доноров-добровольцев. Экспериментальные процедуры на животных проводились в соответствии с Этическими принципами в исследованиях на животных, принятыми бразильским законом 11.784/2008, и были одобрены и лицензированы Этическим комитетом по исследованиям на животных Института Гонсалу Мониша (IGM-FIOCRUZ, протокол No 014/2019).

1. Выделение и дифференцировка дендритных клеток человека

  1. Пипетка 10 мл градиентной среды в центрифужных пробирках объемом 50 мл.
  2. Пробирки объемом 50 мл маркируются в соответствии с образцом каждого донора.
  3. Соберите ~ 50 мл венозной крови от здоровых доноров и после сбора следуйте процедурам, описанным ниже, в проточном шкафу.
  4. Собранную кровь осторожно переложить в центрифужные пробирки и развести в физиологическом растворе (0,9% натрия хлорида) в соотношении 1:1 при комнатной температуре.
  5. Медленно насыпьте разведенную кровь сверху на градиент плотности среды.
  6. Центрифужные пробирки, содержащие среду с градиентом крови и плотности при давлении 400 x g в течение 30 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выключите тормоз перед центрифугированием, чтобы предотвратить смешивание слоев градиента. После 1-го центрифугирования понизьте температуру центрифуги до 4 °C.
  7. Осторожно извлеките пробирки из центрифуги.
  8. Определить кольцо мононуклеарных клеток периферической крови (ПМЦ) в образце (охристая шерсть); Аккуратно удалите остатки плазмы с помощью пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования образуются следующие градиентные слои: эритроциты, среда градиента плотности, кольцо PBMC и плазма. Кольцо PBMC расположено между слоями среды с градиентом плотности и плазмой.
  9. Перенесите облачный слой PBMC в новую пробирку и увеличьте объем до 30 мл с помощью физиологического раствора.
  10. Пробирки, содержащие клеточную суспензию, центрифугируют при концентрации 250 x g в течение 10 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл физиологического раствора.
  11. Соберите аликвоту для подсчета ячеек методом исключения трипанового синего. Во-первых, разбавьте в соотношении 1:1 000. Затем используйте 10 мкл разведенных клеток для окрашивания трипановым синим цветом и подсчитайте клетки с помощью камеры Нейбауэра для определения жизнеспособности клеток.
  12. Снова центрифугируйте при 200 x g в течение 10 минут при 4 °C.
  13. Повторно суспендируйте гранулу в буфере MACS. Используйте 80 мкл буфера на каждые 1 x 107 ячеек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Состав буфера MACS: Приготовьте раствор, содержащий фосфатно-солевой буфер (PBS), pH 7,2, 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 2 мМ ЭДТА. Разбавьте буферный раствор в соотношении 1:20 с раствором для полоскания. Держите буфер в холоде и храните при температуре 2-8 °C.
  14. Добавьте микрогранулы CD14 в клеточную суспензию, приготовленную на шаге 1.13. Используйте 20 мкл микрогранул CD14 на каждые 1 x 107 клеток.
    Микрогранулы CD14 используются для положительного отбора моноцитов человека из PBMC, поскольку гранулы связываются с CD14-положительными клетками, экспрессируемыми на большинстве моноцитов.
  15. Гомогенизируйте раствор, содержащий гранулы и микрогранулы, с помощью пипетки. Держать на льду 15 минут.
  16. Центрифугируйте суспензию при 300 x g в течение 10 мин при 4 °C.
  17. Восстановите суспензию ячеек в буфере MACS. Используйте 1-2 мл на 1 x 107 клеток в клеточной смеси микрогранул.
  18. Центрифугируйте суспензию при 300 x g в течение 10 мин при 4 °C.
  19. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 500 мкл буфера MACS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это максимальный объем клеточной суспензии, который может быть обработан через одну колонку.
  20. Соберите магнитную колонку.
  21. Промойте колонку один раз, добавив 500 мкл буфера MACS. Дайте буферу протекать под действием силы тяжести через колонну.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте колонне высохнуть, так как любой поступающий воздух может засорить колонну.
  22. Добавьте 500 мкл раствора образца клетки с шага 1,19 на колонку. Дайте раствору образца клетки протечь под действием силы тяжести через колонку.
  23. Промойте колонку, добавив 500 мкл буфера MACS (2x). Добавляйте свежий буфер только в том случае, если резервуар столбца пуст. Избегайте высыхания.
  24. Нанесите пипеткой 1 мл буфера MACS на колонку и поместите его в новую пробирку под ней. Немедленно промойте ячейки с магнитной меткой, с усилием вставив поршень в колонку.
  25. Центрифугируйте обогащенные CD14 клетки при 300 x g в течение 10 мин при 4 °C.
  26. Подсчет ячеек с помощью камеры Нейбауэра.
  27. Ресуспендируйте клетки в 1 мл полного РПМИ интерлейкином-4 (ИЛ-4) (100 мкл/мл) + гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) (50 нг/мл).
    Примечание: GM-CSF – это цитокин, секретируемый макрофагами, Т-клетками, тучными клетками, естественными киллерами, эндотелиальными клетками и фибробластами, который индуцирует дифференцировку и пролиферацию миелоидных предшественников в костном мозге. GM-CSF и IL-4 используются для индуцирования дифференцировки дендритных клеток32.
  28. Затравливают клетки в 24-луночный планшет в концентрации от 2 × 10 до5 клеток в лунку в 500 мкл полной среды RPMI, содержащей и инкубируют клетки в течение 7 суток в инкубаторе для клеточных культур при 37 °С.

2. Выращивание Leishmania infantum

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом анализе используются паразиты Leishmania infantum (MCAN/BR/89/BA262). Хомяков внутривенно инфицировали 20 мкл раствора, содержащего 1 x 106 L. infantum promastigotes в стерильном физиологическом растворе. Через 1-2 месяца животных усыпляли, а амастиготные формы Leishmania извлекали из селезенки и дифференцировали в промастиготы33.

  1. Вырастите промастиготы L. infantum, выделенные из ранее инфицированных селезенок хомяка, в наклонной колбе с клеточной культуройдиаметром 25 см2 , содержащей 3 мл среды Нови-Николь-Макнила (NNN) и 5 мл дополненной минимальной незаменимой среды (MEM).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом анализе среда MEM была дополнена 10% фетальной сывороткой крупного рогатого скота (FBS) и 24,5 нМ гемина крупного рогатого скота.
  2. Инкубировать при температуре 24 °C в течение 7 дней в инкубаторе БПК (биокислородная потребность).
  3. Пипеткой внесите 100 мкл культуры промастиготы в новую колбу для клеточных культур диаметром 25см2 , содержащую 5 мл добавленной МЭМ-среды.
  4. Инкубируйте культуру промастиготы при температуре 24 °C в инкубаторе БПК до тех пор, пока промастиготы не достигнут стационарной фазы. Периодически подсчитывайте культивируемые промастиготы, перенося разведенную в физрастворе аликвоту паразитарной суспензии в камеру Нейбауэра (т.е. гемоцитометр) для определения стационарной фазы роста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не рекомендуется использовать паразитов первого пассажа после культивирования в среде NNN во избежание остаточных следов крови кролика.
  5. Перенесите 1 x 105 культуры неподвижной фазы роста промастиготы L. infantum в новую колбудля культуры клеток размером 25 см 2 и добавьте 5 мл среды, дополненной MEM.
  6. Периодически контролируйте рост культуры в течение примерно 7 дней с помощью камеры Нейбауэра до тех пор, пока не будет достигнута неподвижная фаза. В настоящее время паразиты готовы к использованию в экспериментальных методах заражения.
    Примечание: Культуры промастиготы считаются жизнеспособными для инфекции до 7 пассажей in vitro; дополнительные пассажи могут вызвать потерю вирулентности.

3. Инфекция дендритных клеток человека

  1. Внутри биологического ламинарного шкафа переложите все содержимое из колбы для культуры паразитов в центрифужные пробирки объемом 50 мл.
  2. Добавьте холодный солевой раствор до конечного объема 40 мл.
  3. Центрифугируйте при 1 600 xg в течение 10 мин при 4 °C.
  4. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл холодного физиологического раствора (Повторите шаги 3,3-3,4 три раза).
  5. После промывания клеток для удаления любых нежизнеспособных паразитов повторно суспендируйте гранулу в 1 мл холодного солевого раствора.
  6. Медленно пропустите содержимое через шприц объемом 1 мл с иглой 16 G 5 раз, чтобы отделить скопления паразитов.
  7. Удалите аликвоту для определения концентрации паразитов в гемоцитометре (рассчитайте среднее количество паразитов в 4 квадрантах х фактор разведения х 104).
  8. Промойте дендритные клетки, добавив 1 мл физиологического раствора и центрифугируя ячейки при 300 х г в течение 10 минут при комнатной температуре (3 раза).
  9. Рассчитать количество L. infantum , необходимое для экспериментальной инфекции; Соотношение: 20 паразитов на клетку.
  10. Поместите необходимый объем L. infantum в каждую лунку для клеточных культуральных планшетов.
  11. Инкубировать дендритные клетки с паразитами в течение 4 ч в инкубаторе при 37 °C при 5%CO2.
  12. После шага 3.11 центрифугируйте планшеты при давлении 300 x g в течение 10 мин при температуре 4 °C.

4. Миграционный анализ с использованием вставок для клеточных культур

  1. После заражения дендритные клетки (инфицированные или нет) 3 раза промыть 1 мл физиологического раствора комнатной температуры для удаления неинтернализованных паразитов. После каждой промывки центрифугируйте планшеты при давлении 300 x g в течение 10 минут при температуре 4 °C.
  2. После удаления неинтернализованных паразитов отделите клетки, добавив 200 мкл реагента для диссоциации клеток в каждую лунку, и инкубируйте в течение 15 минут. Держите клетки в инкубаторе при температуре 37 °C при 5%CO2.
  3. Гомогенизируйте клетки с помощью наконечника для дозатора объемом 1 000 мкл, чтобы дать клеткам возможность разрыхлиться.
  4. Перенесите диссоциированные клетки в центрифужную пробирку объемом 50 мл.
  5. Центрифугируйте при 300 x g в течение 10 минут при 4 °C.
  6. Ресуспендировать гранулу в 1 мл среды RPMI с добавлением 10% FBS.
  7. Медленно пропустите содержимое каждой пробирки через шприц объемом 1 мл с иглой 25 G 5 раз, чтобы разделить клетки.
  8. Удалите аликвоту, разведите с помощью трипанового синего для определения концентрации клеток с помощью гемоцитометра (среднее значение жизнеспособных клеток в 4 квадрантах × коэффициента разведения × 104).
  9. Приготовление микропланшетов для клеточных культур:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вставки для клеточных культур (мембрана из поликарбоната с порами 5,0 мкМ) рекомендуются для миграционных анализов с использованием дендритных клеток, макрофагов и моноцитов, поскольку эти вставки позволяют фагоцитам проходить через мембраны.
    1. Стерильным пинцетом удалите вставки и поместите в пустые лунки.
    2. Добавьте в каждую лунку по 600 мкл среды RPMI с добавлением 10% FBS; добавить хемоаттрактант хемокин (C-C motif) лиганд 3 (CCL3) (1 мкл на каждый 1 мл среды).
      CCL3 является хемокином, который регулирует миграцию DC34.
    3. С помощью стерильного пинцета поместите вставки в лунки, содержащие среду.
  10. Добавьте 2 x 105 дендритных клеток (инфицированных или нет) в 100 мкл среды в каждую вставку.
  11. Инкубируйте в течение 4 часов, чтобы дать клеткам возможность мигрировать.
  12. Через 4 часа выньте пластину и аспирируйте среду. Добавьте 100 μл 4% параформальдегида и инкубируйте в течение 15 минут.
  13. Удалите параформальдегид и добавьте 100 μл физиологического раствора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины можно хранить при температуре 4 °C для последующей сборки.
  14. Соберите надосадочную жидкость из вкладышей или из лунок для подсчета немигрирующих клеток или тех, которые пересекли мембрану соответственно. Инкубировать с параформальдегидом 4% в течение 15 минут.
  15. Концентрирование клеток с использованием метода цитоцентрифугирования35.
  16. Добавьте 10 μл монтажного материала с DAPI на мембраны и наложите покровные стекла на лунки.
  17. Сборка мембраны вставки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть выполнен вне шкафов биобезопасности.
    1. Снимите вставные мембраны с лунок.
    2. Соскребите поверхность вставки тампоном, чтобы удалить все клетки, которые не мигрировали.
    3. С помощью скальпеля снимите мембрану со вставки.
    4. Поместите мембрану на предметное стекло клетками вверх.
    5. Добавьте 10 μL монтажного материала с DAPI на каждую мембрану, а затем установите накладные покровные стекла.
    6. Накладки на крышки с алюминиевой фольгой.
    7. Инкубировать планшеты при комнатной температуре в течение 30 минут, затем хранить при температуре -20 °C
  18. Для анализа миграции клеток необходимо подсчитать количество клеток в поле (не менее 10 полей) с помощью флуоресцентного микроскопа с длиной волны лазерного возбуждения 405 нм.

5. Анализ адгезии и оценка полимеризации актина методом иммунофлюоресценции

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого анализа используйте 24-луночные планшеты с покровными стеклами.

  1. После заражения клеток в течение 4 ч промойте каждую лунку 3 раза стерильным физиологическим раствором комнатной температуры, чтобы удалить любых неинтернализованных паразитов.
  2. Центрифугируйте планшет при 300 x g в течение 10 минут при 4°C. Добавьте 500 мкл 4% параформальдегида в каждую лунку на 15 мин.
  3. Удалите параформальдегид и добавьте 1 мл физиологического раствора.
  4. Приготовьте растворы, как описано в таблице 1.
Основные решенияХимическое соединениеРазжижающий
Раствор хлорида аммония0,134 г NH4Cl50 мл PBS 1X
Сапонин 15%150 мг сапонина1 мл PBS 1X
Альбумин из бычьей сыворотки (АБС) 10%1 г АБС10 мл PBS 1X
Вторичные решенияКомпонент 1Компонент 2Компонент 3
Сапонин 0,15%1 мл сапонина 15%100 мл PBS 1X-
ПБС 1Х / АБС 3% / Сапонин 0,15%13,8 мл PBS 1X6 мл АБС 10%200 мкл сапонина 15%
PBS1X / ABS 0,3% / Сапонин 0,15%:19,2 мл PBS 1X0,6 мл АБС 10%200 мкл сапонина 15%
ПБС 1Х / АБС 1% / Сапонин 0,15%17,8 мл PBS 1X2 мл АБС 10%200 мкл сапонина 15%

Таблица 1: Буферные рецепты.

  1. Иммуноокрашивание
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие действия должны быть выполнены при перемешивании.
    1. Промойте покровные стекла 3 раза с 1x PBS в течение 5 минут.
    2. Добавьте 500 μл раствора хлорида аммония на лунку в течение 10 мин.
    3. Промойте покровные стекла 3 раза с 1x PBS в течение 5 минут.
    4. Пропитать мембрану сапонином 0,15% в течение 15 мин.
    5. Инкубируйте клетки с блокирующим раствором (PBS 1x / ABS 3% / Saponin 0,15%) в течение 1 ч.
    6. Промойте покровные листы 3 раза PBS 1x/Saponin 0,15% в течение 5 минут.
    7. Разведите первичные антитела в PBS 1x /ABS 1% /сапонин 0,15% в виде: Rabbit anti-FAK (pTyr397): разведение 1:500, Rabbit anti-paxilin (pTyr118): разведение 1:100. Mouse Anti-Rac1: разведение 1:100. Rabbit Anti-Cdc42: разведение 1:200. Rabbit Anti-RhoA: разведение 1:200.
    8. Инкубируют клетки с первичным антителом, разведенным в PBS 1x/ABS 1% / Saponin 0,15% в течение 1 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: FAK и Paxillin являются ключевыми молекулами, участвующими в образовании адгезионных комплексов 13,14,15. Семейство Rho GTPase отвечает за организацию актинового цитоскелета. RAC1 и Cdc42, расположенные на переднем крае клетки, контролируют образование ламелиподий и филоподий соответственно; RhoA расположен в задней части клетки и участвует в сокращении цитоскелета15, 23,24,25.
    9. Постирайте покровные листы 3 раза с 1x PBS/Saponin 0,15% в течение 5 минут.
    10. Разведите вторичное антитело или фаллоидин следующим образом: Anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 568: разведение 1:500; Антимышиный IgG, Alexa Fluor 488: разведение 1:500; Антимышиный IgG, Alexa Fluor 594: разведение 1:500; Фаллоидин Alexa Fluor 488: разведение 1:1200.
    11. Инкубировать клетки с вторичным антителом или фаллоидином, разведенным в 1x PBS/ABS 0,3%, Сапонин 0,15% в течение 45 мин.
      Примечание: Инкубацию вторичного антитела или фаллоидина следует проводить в отсутствие света. Накройте пластины алюминиевой фольгой для защиты от света во время следующих действий.
    12. Промойте покровные стекла 3 раза с 1x PBS в течение 5 минут.
    13. Снимите покровные стекла с колодцев.
    14. При отсутствии света добавьте 10 μL монтажной среды с DAPI на чистые предметные стекла под микроскопом.
    15. Поместите покровные стекла ячейками вниз, чтобы обеспечить контакт между ячейками и раствором DAPI.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Накройте слайды алюминиевой фольгой для защиты от света.
    16. Выдерживать 30 минут при комнатной температуре.
    17. Хранить при температуре -20 °C.

6. Конфокальная микроскопия, получение изображений и количественная оценка с помощью FIJI

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения/захвата иммунофлуоресцентных изображений используйте конфокальный лазерный сканирующий микроскоп. Для оптимального разрешения рекомендуется использовать объектив с масляным погружением 63x.

  1. Дайте покровным стеклам нагреться до комнатной температуры, защищенной от света, не менее чем за 30 минут до получения изображения.
  2. Очистите покровные стекла впитывающей салфеткой.
  3. Добавьте каплю иммерсионного масла на объектив и поместите каждый предметный стекл под микроскоп.
  4. Перемещайте объектив до тех пор, пока масло не коснется предметного стекла.
  5. Наблюдение и регулировка фокуса микроскопа; Выберите объектив 63x с маслом.
  6. Включите лазеры на длинах волн 488 нм, 552 нм и 405 нм .
  7. Выберите разрешение изображения: 1024 x 1024.
  8. Нажмите кнопку «Live », установите стек Z и нажмите «Начать». Повторите процесс и нажмите End.
  9. После выбора параметра «Максимальная проекция » в меню «Инструменты » дождитесь получения изображения.
  10. Сохраните эксперимент.
  11. Экспортируйте изображения в формате .lif на компьютер. Используйте программное обеспечение для анализа изображений с открытым исходным кодом FIJI для анализа изображений.
  12. Выберите изображения для анализа и выберите Дублировать изображение.
  13. Чтобы изображение отображалось в оттенках серого, выберите Изображение | Настройка | Цветовой порог. Выберите 0 и 255 (насыщенность).
  14. Выберите метод порогового значения: По умолчанию.
  15. Выберите цвет порога: B и W (черный и белый).
  16. Не выбирайте «Темный фон».
  17. Выберите: Процесс | Двоичный | Опции , а затем выберите соответствующие данные для измерения: Площадь, Минимум, Максимум, Значение серого, Плотность интегрирования.
  18. Выберите инструмент «Свободные руки» на панели инструментов «Фиджи» и тщательно обведите каждую ячейку вручную.
  19. В меню Анализ выберите пункт Задать измерения. Убедитесь, что выбраны интегрированная по площади интенсивность и среднее значение серого. Повторите этот процесс для каждой ячейки.
  20. Выберите все данные в окне «Результаты», скопируйте и вставьте в файл электронной таблицы.
  21. Рассчитайте скорректированную общую флуоресценцию клеток (CTCF): CTCF (Плотность интегрирования = Площадь выбранной ячейки x Средняя флуоресценция фоновых показаний).
  22. Откройте файл, содержащий данные, с помощью программы статистического анализа для выполнения статистического анализа.

7. Статистический анализ

  1. Откройте новый проект , когда появится приветственное диалоговое окно.
  2. Выберите тип графика и среду с SD.
  3. Примените значения, полученные из результатов эксперимента, к таблице.
  4. Выберите «Описательная статистика» и выберите столбец «Статистика [все тесты»] для анализа распределения данных.
  5. Если данные следуют гауссову распределению, выберите t-критерий для анализа образцов путем сравнения двух пар. Если распределение не является гауссовым, проанализируйте данные с помощью теста Манна-Уитни.
  6. Выберите оптимальный вариант графика для оптимального представления данных.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Этот протокол, описанный в настоящем документе, позволяет оценить миграцию клеток и связанные с ней механизмы, такие как динамика актина и адгезия, тем самым предоставляя инструмент для определения миграции инфицированных Leishmania клеток-хозяев внутри позвоночног...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Описанный здесь метод оценки миграции клеток с использованием системы мембранных вставок клеточных культур позволяет исследователям изучать миграционную реакцию клеток в двумерной среде. В этой методике некоторые шаги считаются критически важными. Во-первых, дифф?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке Фонда поддержки исследований штата Байя (Fapesb), грант No 9092/2015. Авторы выражают благодарность CNPq, Capes и Fapesb за финансовую поддержку в виде стипендий. Авторы выражают благодарность Андрису К. Уолтеру за критический анализ, редактирование английского языка и помощь в редактировании рукописи.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
16 Gauge needleDescarpack353101
24 well cell culture plateJET-BIOFILJ011024
25 Gauge needleDescarpack353601
Albumin from bovine serumSigma AldrichA2153-100G
Ammonium chlorideSigma AldrichA-0171
Anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488InvitrogenA32723
Anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594InvitrogenA11032
Anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 568InvitrogenA11011
CD14 MicroBeadsMACS Myltenyi Biotec130-050-201
Cell Culture Flask 25cm2SPL70125
CellstripperCorning25-056-CI
Confocal microscopeLeicaTCS SP8
Coverslip circles 13mmPerfecta10210013CE
Dissecting ForcepsVWR82027-406
EDTASigma AldrichE6758
Falcon tubeKASVIK19-0051
Fetal Bovine Serumgibco16000044
Fluorescence microscopeOlympus BX51
Glass slide  25,4x76,2mmPerfecta200
Hemin bovineSigma AldrichH2250
HemocytometerPerfecta7302HD
Histopaque® 1077Sigma Aldrich10771
MACS bufferMACS Myltenyi Biotec130-091-221
Minimum Essential MediumGibco41090093
Mouse anti-Rac1BD610650
ParaformaldehydeSigma Aldrich158127
Phalloidin Alexa Fluor 488InvitrogenA12379
Phosphate Buffered SalineThermoFisherAM9624
Polycarbonate Membrane Transwell Inserts - Pore size 5.0 µmCorning3421
ProLong Gold DAPI kitInvitrogenP36931
Rabbit anti-Cdc42InvitrogenPA1-092X
Rabbit anti-FAK (pTyr397)InvitrogenRC222574
Rabbit anti-paxilin (pTyr118)InvitrogenQF221230
Rabbit anti-RhoAInvitrogenOSR00266W
Recombinant Human CCL3R&D Systems270-LD-010
Recombinant Human GM-CSFPeproTech300-03
Recombinant Human IL-4PeproTech200-04
Recombinant Human M-CSFPeproTech300-25
RPMI 1640 MediumGibco21870076
SaponinSigma Aldrich47036 – 50G – F
Syringe 3 mLDescarpack324201
Trypan BlueGibco15250061

Ссылки

  1. Burza, S., Croft, S. L., Boelaert, M. Leishmaniasis. The Lancet. 392 (10151), 951-970 (2018).
  2. Bi, K., Chen, Y., Zhao, S., Kuang, Y., John Wu, C. H. Current Visceral Leishmaniasis Research: A Research Review to Inspire Future Study. BioMed Research International. 2018, (2018).
  3. Serafim, T. D., Iniguez, E., Oliveira, F. Leishmania infantum. Trends in Parasitology. 36 (1), 80-81 (2020).
  4. Van Assche, T., Deschacht, M., da Luz, R. A. I., Maes, L., Cos, P. Leishmania-macrophage interactions: Insights into the redox biology. Free Radical Biology and Medicine. 51 (2), 337-351 (2011).
  5. Podinovskaia, M., Descoteaux, A. Leishmania and the macrophage: A multifaceted interaction. Future Microbiology. 10 (1), 111-129 (2015).
  6. Antoine, J. C., Prina, E., Jouanne, C., Bongrand, P. Parasitophorous vacuoles of Leishmania amazonensis-infected macrophages maintain an acidic pH. Infection and Immunity. 58 (3), (1990).
  7. Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).
  8. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model. Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).
  9. Sheetz, M. P., Felsenfeld, D., Galbraith, C. G., Choquet, D. Cell migration as a five-step cycle. Biochemical Society symposium. 65, 233-243 (1999).
  10. Yano, H., et al. Roles played by a subset of integrin signaling molecules in cadherin-based cell-cell adhesion. Journal of Cell Biology. 166 (2), 283-295 (2004).
  11. Mitra, S. K., Hanson, D. A., Schlaepfer, D. D. Focal adhesion kinase: In command and control of cell motility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (1), 56-68 (2005).
  12. Deramaudt, T. B., et al. Altering FAK-Paxillin Interactions Reduces Adhesion, Migration and Invasion Processes. PLoS One. 9 (3), (2014).
  13. Turner, C. E. Paxillin and focal adhesion signalling. Nature Cell Biology. 2 (12), (2000).
  14. Linder, S., Aepfelbacher, M. Podosomes: Adhesion hot spots of invasive cells. Trends in Cell Biology. 13 (7), 376-385 (2003).
  15. Huveneers, S., Danen, E. H. J. Adhesion signaling - Crosstalk between integrins, Src and Rho. Journal of Cell Science. 122 (8), 1059-1069 (2009).
  16. Jones, G. E. Cellular signaling in macrophage migration and chemotaxis. Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 593-602 (2000).
  17. De Fougerolles, A. R., Koteliansky, V. E. Regulation of monocyte gene expression by the extracellular matrix and its functional implications. Immunological Reviews. 186 (1), 208-220 (2002).
  18. Cortesio, C. L., Boateng, L. R., Piazza, T. M., Bennin, D. a, Huttenlocher, A. Calpain-mediated proteolysis of paxillin negatively regulates focal adhesion dynamics and cell migration. The Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 9998-10006 (2011).
  19. Verkhovsky, A. B., et al. Orientational order of the lamellipodial actin network as demonstrated in living motile cells. Molecular Biology of the Cell. 14 (11), 4667-4675 (2003).
  20. Ridley, A. J., et al. Cell Migration: Integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
  21. Hall, A. Small GTP-binding proteins, and the regulation of the actin cytoskeleton. Annual Review of Cell Biology. 10, 31-54 (1994).
  22. Machesky, L. M., Hall, A. Rho: A connection between membrane receptor signalling and the cytoskeleton. Trends in Cell Biology. 6 (8), 304-310 (1996).
  23. Ridley, A. J., Hall, A. The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors. Cell. 70 (3), 389-399 (1992).
  24. DeMali, K. A., Burridge, K. Coupling membrane protrusion and cell adhesion. Journal of Cell Science. 116 (12), 2389-2397 (2003).
  25. López-Colomé, A. M., Lee-Rivera, I., Benavides-Hidalgo, R., López, E. Paxillin: A crossroad in pathological cell migration. Journal of Hematology and Oncology. 10 (1), (2017).
  26. Carvalhal, D. G. F., et al. The modelling of mononuclear phagocyte-connective tissue adhesion in vitro: Application to disclose a specific inhibitory effect of Leishmania infection. Experimental Parasitology. 107 (3-4), 189-199 (2004).
  27. Pinheiro, N. F., et al. Leishmania infection impairs β1-integrin function and chemokine receptor expression in mononuclear phagocytes. Infection and Immunity. 74 (7), 3912-3921 (2006).
  28. de Menezes, J. P. B., et al. Leishmania infection inhibits macrophage motility by altering F-actin dynamics and the expression of adhesion complex proteins. Cellular Microbiology. 19 (3), (2017).
  29. Hermida, M. D. R., Doria, P. G., Taguchi, A. M. P., Mengel, J. O., dos-Santos, W. L. C. Leishmania amazonensis infection impairs dendritic cell migration from the inflammatory site to the draining lymph node. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 450(2014).
  30. Ballet, R., et al. Blocking junctional adhesion molecule c enhances dendritic cell migration and boosts the immune responses against Leishmania major. PLoS Pathogens. 10 (12), (2014).
  31. Rocha, M. I., et al. Leishmania infantum enhances migration of macrophages via a phosphoinositide 3-Kinase î-dependent pathway. ACS Infectious Diseases. 6 (7), 1643-1649 (2020).
  32. Hiasa, M., et al. GM-CSF and IL-4 induce dendritic cell differentiation and disrupt osteoclastogenesis through M-CSF receptor shedding by up-regulation of TNF-α converting enzyme (TACE). Blood. 114 (20), 4517-4526 (2009).
  33. de Melo, C. V. B., et al. Phenotypical characterization of spleen remodeling in murine experimental visceral leishmaniasis. Frontiers in Immunology. 11, 653(2020).
  34. Gibaldi, D., et al. CCL3/macrophage inflammatory protein-1α is dually involved in parasite persistence and induction of a TNF- and IFNγ-enriched inflammatory milieu in Trypanosoma cruzi-induced chronic cardiomyopathy. Frontiers in Immunology. 11, 306(2020).
  35. Finger, P. T., Papp, C., Latkany, P., Kurli, M., Iacob, C. E. Anterior chamber paracentesis cytology (cytospin technique) for the diagnosis of intraocular lymphoma. British Journal of Ophthalmology. 90 (6), 690-692 (2006).
  36. Zhang, C., Barrios, M. P., Alani, R. M., Cabodi, M., Wong, J. Y. A microfluidic Transwell to study chemotaxis. Experimental Cell Research. 342 (2), 159-165 (2016).
  37. Glynn, S. A., O'Sullivan, D., Eustace, A. J., Clynes, M., O'Donovan, N. The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors, simvastatin, lovastatin and mevastatin inhibit proliferation and invasion of melanoma cells. BMC Cancer. 8, (2008).
  38. van de Merbel, A. F., vander Horst, G., Buijs, J. T., vander Pluijm, G. Protocols for migration and invasion studies in prostate cancer. Methods in Molecular Biology. 1786, 67-79 (2018).
  39. Omar Zaki, S. S., Kanesan, L., Leong, M. Y. D., Vidyadaran, S. The influence of serum-supplemented culture media in a transwell migration assay. Cell Biology International. 43 (10), 1201-1204 (2019).
  40. Borovikov, I. S. Izuchenie strukturnykh izmeneniǐ sokratitel'nykh belkov myshechnogo volokna s pomoshch'iu poliarizatsionnoǐ ul'trafioletovoǐ fluorestsentnoǐ mikroskopii. VIII. Vliianie glutaral'degida i falloidina na konformatsiiu F-aktina. Tsitologiya. 26 (11), 1262-1266 (1984).
  41. Cooper, J. A. Effects of cytochalasin and phalloidin on actin. The Journal of Cell Biology. 105 (4), 1473-1478 (1987).
  42. Allen, W. E., Jones, G. E., Pollard, J. W., Ridley, A. J. Rho, Rac and Cdc42 regulate actin organization and cell adhesion in macrophages. Journal of Cell Science. 110, 707-720 (1997).
  43. Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

in vitro

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены