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Resumen

Aquí estudiamos las implicaciones de la interacción entre Leishmania y el huésped mediante la exploración de la migración de células dendríticas infectadas por Leishmania. Se describe la diferenciación e infección de células dendríticas, el análisis de la migración y la evaluación de los complejos de adhesión y la dinámica de la actina. Este método se puede aplicar a otros estudios de migración de células huésped cuando se infectan con Leishmania u otras especies de parásitos intracelulares.

Resumen

La leishmania es un parásito protozoario intracelular que causa un amplio espectro de manifestaciones clínicas, que van desde lesiones cutáneas localizadas que se resuelven por sí mismas hasta una forma visceral altamente mortal de la enfermedad. Se estima que 12 millones de personas en todo el mundo están infectadas actualmente, y otros 350 millones corren el riesgo de infectarse. Se sabe que las células huésped infectadas por parásitos de Leishmania , como los macrófagos o las células dendríticas, pueden migrar a diferentes tejidos del huésped, pero aún no se conoce bien cómo la migración contribuye a la diseminación del parásito y a la localización del parásito. Por lo tanto, la evaluación de la capacidad de estos parásitos para modular la respuesta, la adhesión y la migración de las células huésped arrojará luz sobre los mecanismos involucrados en la diseminación y visceralización de la enfermedad. La migración celular es un proceso complejo en el que las células sufren polarización y protuberancia, lo que les permite migrar. Este proceso, regulado por la dinámica de los microtúbulos basada en actina y tubulina, involucra diferentes factores, entre ellos la modulación de la adhesión celular al sustrato. Los procesos de adhesión y migración celular se han investigado utilizando varios modelos. En este trabajo describimos un método para caracterizar los aspectos migratorios de las células huésped durante la infección por Leishmania . Este protocolo detallado presenta la diferenciación e infección de las células dendríticas, el análisis de la motilidad y migración de la célula huésped, y la formación de complejos de adhesión y dinámica de actina. Este protocolo in vitro tiene como objetivo dilucidar aún más los mecanismos involucrados en la diseminación de Leishmania dentro de los tejidos del huésped vertebrado y también puede modificarse y aplicarse a otros estudios de migración celular.

Introducción

La leishmaniasis, una enfermedad tropical desatendida causada por parásitos protozoarios pertenecientes al género Leishmania, da lugar a un amplio espectro de manifestaciones clínicas, desde lesiones cutáneas localizadas autocurativas hasta formas viscerales mortales de la enfermedad. Se ha estimado que anualmente surgen hasta un millón de nuevos casos de leishmaniasis, con un total de 12 millones de personas infectadas actualmente en todo el mundo1. La leishmaniasis visceral (LV), que puede ser mortal en más del 95% de los casos si no se trata, causa más de 50.000 muertes al año, afectando a millones de personas en América del Sur, África Oriental, Asia Meridional y la región mediterránea2. El principal agente etiológico de la LV en el nuevo mundo, Leishmania infantum, se transmite a los seres humanos a través de flebótomos hembra infectados durante la alimentación sanguínea3. Estos parásitos son reconocidos e internalizados por los fagocitos, por ejemplo, los macrófagos y las células dendríticas 3,4,5. Dentro de estas células, los parásitos se diferencian en sus formas intracelulares, conocidas como amastigotes, que luego se multiplicarán y serán transportadas a través del sistema linfático y el torrente sanguíneo a diferentes tejidos del huésped 6,7. Sin embargo, los mecanismos por los cuales los parásitos de Leishmania se diseminan en el huésped vertebrado, así como el papel que desempeña la migración de las células huésped en este proceso, siguen sin estar claros.

La migración celular es un proceso complejo ejecutado por todas las células nucleadas, incluidos los leucocitos8. De acuerdo con el modelo clásico de ciclo de migración celular, este proceso involucra varios eventos moleculares integrados que se pueden dividir en cinco pasos: protrusión de borde de ataque; adherencia del borde de ataque a los contactos de la matriz; contracción del citoplasma celular; liberación del borde posterior de la célula de los lugares de contacto; y el reciclaje de los receptores de membrana desde la parte trasera hasta la parte delantera de la célula9.

Para que ocurra la migración celular, se deben formar protuberancias y luego estabilizar mediante la unión a la matriz extracelular. Entre los diferentes tipos de receptores implicados en la promoción de la migración celular, destacan las integrinas. La activación de la integrina da lugar a la señalización relacionada con la migración; la señalización intracelular ocurre a través de la quinasa de adhesión focal (FAK) y las quinasas de la familia Src, además de las moléculas de talina, vinculina y paxilina 10,11,12. La fosforilación de la paxilina por quinasas activadas, incluida la FAK, conduce al reclutamiento de moléculas efectoras, que transducen señales externas que provocan la migración celular. Se ha demostrado que la paxilina es una molécula intracelular crucial para la adhesión celular, la polimerización de la actina y los procesos de migración celular 13,14,15.

El citoesqueleto de actina desempeña un papel central en la polarización y migración de los fagocitos16. Durante el proceso de migración celular, las protuberancias formadas debido a la polimerización de actina se estabilizan a través de la adhesión celular a la matriz extracelular. Este proceso puede ser modulado por receptores de integrinas asociados con el citoesqueleto de actina 17,18,19. Varias proteínas de unión a actina regulan la velocidad y organización de la polimerización de actina en protuberancias celulares20. Los estudios han demostrado que RhoA, Rac y Cdc42 regulan la reorganización de la actina después de la estimulación de las células adherentes por factores extracelulares21,22. Durante la migración, Rac1 y Cdc42 se localizan en el borde delantero de la célula, controlando la extensión de los lamelipodios y filopodios, respectivamente, mientras que RhoA, situada en la parte posterior de la célula, regula la contracción del citoesqueleto de actomiosina 15,23,24,25.

Los estudios han demostrado que la infección por Leishmania modula las funciones de la célula huésped, como la adhesión al sustrato celular y la migración 26,27,28,29,30,31. Las CD inmaduras residen en los tejidos periféricos; al interactuar con PAMPS, estas células se activan y migran a los ganglios linfáticos drenantes, lo que provoca la presentación del antígeno a las células T. Un estudio previo con un modelo de ratón mostró que la infección por L. amazonensis provoca una reducción en la migración de las CD a los ganglios linfáticos drenantes29. También se demostró que la inhibición del proceso de adhesión redujo la migración de DC después de la infección con L. major30. Sin embargo, el impacto de la migración de DC en la diseminación del parásito en el huésped, así como los mecanismos involucrados en este proceso, siguen siendo poco conocidos.

Aquí presentamos un protocolo compilado paso a paso para realizar un ensayo de adhesión y migración in vitro con DC humanas infectadas por Leishmania. Este método comprende no solo la diferenciación e infección de las CD, sino que también permite el análisis de la motilidad y migración de la célula huésped, la formación de complejos de adhesión, así como la dinámica de la actina. El protocolo in vitro descrito actualmente permite a los investigadores investigar más a fondo los mecanismos implicados en la diseminación de Leishmania dentro de los tejidos del huésped vertebrado y también puede manipularse y aplicarse a otros estudios de migración celular.

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Protocolo

Los procedimientos descritos en este documento fueron aprobados por el Comité de Revisión Institucional del Instituto Gonçalo Moniz (IGM-FIOCRUZ, protocolo nº 2.751.345). Se obtuvieron muestras de sangre de donantes voluntarios sanos. Los procedimientos de experimentación con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los Principios Éticos en Investigación Animal adoptados por la ley brasileña 11.784/2008 y fueron aprobados y autorizados por el Comité de Ética para la Investigación Animal del Instituto Gonçalo Moniz (IGM-FIOCRUZ, protocolo n.º 014/2019).

1. Aislamiento y diferenciación de células dendríticas humanas

  1. Pipetear 10 mL del medio de gradiente de densidad en tubos de centrífuga de 50 mL.
  2. Etiquete los tubos de 50 ml de acuerdo con la muestra de cada donante.
  3. Recoja ~ 50 ml de sangre venosa de donantes sanos y, después de la recolección, siga los procedimientos que se describen a continuación en el gabinete de flujo.
  4. Transfiera cuidadosamente la sangre recolectada a tubos de centrífuga y diluya en solución salina (cloruro de sodio al 0,9%) en una proporción de 1:1 a temperatura ambiente.
  5. Superponga lentamente la sangre diluida en la parte superior del medio de gradiente de densidad.
  6. Tubos de centrífuga que contienen la sangre y el medio de gradiente de densidad a 400 x g durante 30 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Apague el freno antes de centrifugar para evitar la mezcla de capas de degradado. Después de la 1ª centrifugación, baje la temperatura de la centrífuga a 4 °C.
  7. Retire con cuidado los tubos de la centrífuga.
  8. Identificar el anillo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en la muestra (capa leucocitaria); Retire suavemente el plasma residual con una pipeta.
    NOTA: Después de la centrifugación, se habrán formado las siguientes capas de gradiente: eritrocitos, medio de gradiente de densidad, anillo PBMC y plasma. El anillo PBMC se encuentra entre el medio de gradiente de densidad y las capas de plasma.
  9. Transfiera la capa de PBMC en forma de nube a un nuevo tubo y aumente el volumen a 30 ml con solución salina.
  10. Centrifugar los tubos que contienen la suspensión celular a 250 x g durante 10 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 mL de solución salina.
  11. Recopile una alícuota para el recuento de células con el método de exclusión de azul de tripano. Primero, diluir en una proporción de 1:1,000. A continuación, utilice 10 μL de las células diluidas para la tinción con azul de tripano y cuente las células utilizando una cámara de Neubauer para determinar la viabilidad celular.
  12. Vuelva a centrifugar a 200 x g durante 10 min a menos de 4 °C.
  13. Vuelva a suspender el pellet en el búfer MACS. Utilice 80 μL del tampón por cada 1 x 107 celdas.
    NOTA: Composición del tampón MACS: Prepare una solución que contenga solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2, albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5% y EDTA 2 mM. Diluya la solución tampón en una proporción de 1:20 con la solución de enjuague. Mantenga el tampón frío y guárdelo a 2-8 °C.
  14. Agregue microperlas CD14 a la suspensión celular preparada en el paso 1.13. Utilice 20 μL de microperlas CD14 por cada 1 x 107 células.
    NOTA: Las microperlas CD14 se utilizan para la selección positiva de monocitos humanos de PBMC, ya que las perlas se unen a las células CD14 positivas expresadas en la mayoría de los monocitos.
  15. Homogeneizar la solución que contiene el pellet y las microperlas con una pipeta. Mantener en hielo durante 15 min.
  16. Centrifugar la suspensión a 300 x g durante 10 min a menos de 4 °C.
  17. Vuelva a suspender las celdas en el búfer MACS. Use 1-2 mL para 1 x 107 celdas en la mezcla de microperlas celulares.
  18. Centrifugar la suspensión a 300 x g durante 10 min a menos de 4 °C.
  19. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 500 μL de tampón MACS.
    NOTA: Este es el volumen máximo de la suspensión celular que se puede procesar a través de una columna.
  20. Ensamble la columna magnética.
  21. Lave la columna una vez añadiendo 500 μL de tampón MACS. Permita que el búfer fluya por gravedad a través de la columna.
    NOTA: No permita que la columna se seque, ya que cualquier aire que entre puede obstruir la columna.
  22. Añadir 500 μL de la solución de muestra celular del paso 1.19 por columna. Permita que la solución de muestra de célula fluya por gravedad a través de la columna.
  23. Lave la columna añadiendo 500 μL de tampón MACS (2x). Agregue el búfer nuevo solo cuando el depósito de la columna esté vacío. Evite el secado.
  24. Pipetee 1 mL del tampón MACS en la columna y colóquelo en un nuevo tubo debajo. Enjuague inmediatamente las celdas marcadas magnéticamente empujando firmemente el émbolo en la columna.
  25. Centrifugar las células enriquecidas con CD14 a 300 x g durante 10 min a menos de 4 °C.
  26. Cuente las células con una cámara de Neubauer.
  27. Resuspender células en RPMI completo de 1 mL con interleucina-4 (IL-4) (100 μL/mL) + factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) (50 ng/mL).
    NOTA: El GM-CSF es una citocina secretada por macrófagos, linfocitos T, mastocitos, linfocitos citolíticos naturales, células endoteliales y fibroblastos que induce la diferenciación y proliferación de progenitores mieloides en la médula ósea. El GM-CSF y la IL-4 se utilizan para inducir la diferenciación de las células dendríticas32.
  28. Las células de siembra en una placa de 24 pocillos a una concentración de 2 × 105 células por pocillo en 500 μL de medio RPMI completo que contiene e incuban las células durante 7 días en la incubadora de cultivo celular a 37 °C.

2. Cultivo de Leishmania infantum

NOTA: En este ensayo se utilizan parásitos Leishmania infantum (MCAN/BR/89/BA262). Los hámsters se infectaron por vía intravenosa con 20 μL de la solución que contenía 1 x 106 L. infantum promastigotes en solución salina estéril. Después de 1 a 2 meses, los animales fueron sacrificados y las formas amastigotas de Leishmania fueron recuperadas de sus bazos y diferenciadas en promastigotes33.

  1. Cultive promastigotes de L. infantum aislados de bazos de hámster previamente infectados en un matraz de cultivo celular inclinado de 25cm2 que contiene 3 mL de medio Novy-Nicolle-MacNeal (NNN) y 5 mL de Medio Esencial Mínimo (MEM) suplementado.
    NOTA: En este ensayo, el medio MEM se suplementó con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 24,5 nM de hemina bovina.
  2. Incubar a 24 °C durante 7 días en incubadora DBO (Bio-Oxygen Demand).
  3. Pipetear 100 μL de cultivo de promastigote en un nuevo matraz de cultivo celular de 25cm2 que contenga 5 mL de medio MEM suplementado.
  4. Incubar el cultivo de promastigotes a 24 °C en incubadora de DBO hasta que los promastigotes alcancen la fase estacionaria. Contar periódicamente los promastigotes cultivados transfiriendo una alícuota de suspensión de parásitos diluida en solución salina a una cámara de Neubauer (es decir, hemocitómetro) para determinar la fase estacionaria de crecimiento.
    NOTA: No se recomienda utilizar parásitos de primer paso después del cultivo en medio NNN para evitar rastros residuales de sangre de conejo.
  5. Transfiera 1 x 105 de cultivo estacionario en fase de crecimiento de L. infantum promastigotes a un nuevo matraz de cultivo celular de 25cm2 y agregue 5 mL de medio suplementado con MEM.
  6. Monitorizar el crecimiento del cultivo periódicamente durante aproximadamente 7 días utilizando una cámara de Neubauer hasta alcanzar la fase estacionaria. Los parásitos ya están listos para su uso en procedimientos experimentales de infección.
    NOTA: Los cultivos de promastigotes se consideran viables para la infección hasta por 7 conductos in vitro; los conductos adicionales pueden inducir pérdida de virulencia.

3. Infección de células dendríticas humanas

  1. Dentro de una cabina de flujo laminar biológico, transfiera todo el contenido del matraz de cultivo de parásitos a tubos de centrífuga de 50 mL.
  2. Agregue solución salina fría hasta un volumen final de 40 mL.
  3. Centrifugar a 1.600 xg durante 10 min a menos de 4 °C.
  4. Deseche el sobrenadante después de la centrifugación y vuelva a suspender el pellet en 1 ml de solución salina fría (repita los pasos 3.3-3.4 tres veces).
  5. Después de lavar las células para eliminar cualquier parásito no viable, vuelva a suspender el pellet en 1 ml de solución salina fría.
  6. Pase el contenido lentamente a través de una jeringa de 1 ml con una aguja de 16 G 5 veces para separar los grupos de parásitos.
  7. Eliminar una alícuota para determinar la concentración de parásitos en un hemocitómetro (calcular el número medio de parásitos en 4 cuadrantes x factor de dilución x 104).
  8. Lave las células dendríticas añadiendo 1 mL de solución salina y centrifugando las células a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente (3 veces).
  9. Calcular la cantidad de L. infantum necesaria para la infección experimental; Ratio: 20 parásitos por célula.
  10. Coloque el volumen requerido de L. infantum en cada pocillo de placas de cultivo celular.
  11. Incubar células dendríticas con parásitos durante 4 h en una incubadora a 37 °C bajo 5% de CO2.
  12. Después del paso 3.11, centrifugar las placas a 300 x g durante 10 min a menos de 4 °C.

4. Ensayo de migración con insertos de cultivo celular

  1. Después de la infección, lavar las células dendríticas (infectadas o no) 3 veces con 1 ml de solución salina a temperatura ambiente para eliminar los parásitos no internalizados. Después de cada lavado, centrifugar las placas a 300 x g durante 10 min a menos de 4 °C.
  2. Una vez eliminados los parásitos no internalizados, se separan las células añadiendo 200 μL del reactivo de disociación celular en cada pocillo y se incuba durante 15 min. Mantenga las células en una incubadora a 37 °C por debajo del 5% de CO2.
  3. Homogeneice las células con una punta de pipeta de 1.000 μL para permitir que las células se aflojen.
  4. Transfiera las células disociadas a un tubo de centrífuga de 50 mL.
  5. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a menos de 4 °C.
  6. Vuelva a suspender el pellet en 1 mL de medio RPMI suplementado con 10% de FBS.
  7. Pase el contenido de cada tubo lentamente a través de una jeringa de 1 ml con una aguja de 25 G 5 veces para separar las células.
  8. Retirar una alícuota, diluir con azul de tripán para determinar la concentración celular utilizando un hemocitómetro (media de células viables en 4 cuadrantes × factor de dilución × 104).
  9. Preparación de insertos de microplacas de cultivo celular:
    NOTA: Los insertos de cultivo celular (membrana de policarbonato de poro de 5,0 μM) se recomiendan para los ensayos de migración con células dendríticas, macrófagos y monocitos, ya que estos insertos permiten que los fagocitos pasen a través de las membranas.
    1. Retire los insertos con pinzas estériles y colóquelos en pozos vacíos.
    2. Agregue 600 μL de medio RPMI suplementado con 10% de FBS a cada pocillo; añadir quimioatrayente quimiocina (motivo C-C) ligando 3 (CCL3) (1 μL por cada 1 mL de medio).
      NOTA: CCL3 es una quimiocina que regula la migración de DC34.
    3. Con pinzas estériles, coloque los insertos en los pocillos que contengan el medio.
  10. Añadir 2 x 105 células dendríticas (infectadas o no) en 100 μL de medio a cada inserto.
  11. Incubar durante 4 h para permitir que las células migren.
  12. Pasadas las 4 h, saque la placa y aspire el medio. Añadir 100 μL de paraformaldehído al 4% e incubar durante 15 min.
  13. Retire el paraformaldehído y agregue 100 μL de solución salina.
    NOTA: Las placas se pueden mantener a 4 °C para su posterior montaje.
  14. Recoja el sobrenadante de insertos o de pocillos para contar las células no migratorias o las que atravesaron la membrana, respectivamente. Incubar con paraformaldehído al 4% durante 15 min.
  15. Células concentradas mediante una técnica de citocentrifugación35.
  16. Añada 10 μL del medio de montaje con DAPI a las membranas y coloque cubreobjetos sobre los pocillos.
  17. Montaje de la membrana del inserto.
    NOTA: Este paso se puede realizar fuera de las cabinas de bioseguridad.
    1. Retire las membranas de inserción de los pocillos.
    2. Raspe la superficie del inserto con un hisopo para eliminar las células que no hayan migrado.
    3. Con un bisturí, retire la membrana del inserto.
    4. Coloque la membrana en un portaobjetos, con las células hacia arriba.
    5. Agregue 10 μL de medio de montaje con DAPI a cada membrana y luego coloque cubreobjetos superpuestos.
    6. Cubra las placas con papel de aluminio.
    7. Incubar las placas a temperatura ambiente durante 30 min, luego almacenar a -20 °C
  18. Para analizar la migración celular, cuente el número de células por campo (no menos de 10 campos) utilizando un microscopio de fluorescencia a una longitud de onda de excitación láser de 405 nm.

5. Ensayo de adhesión y evaluación de la polimerización de actina por inmunofluorescencia

NOTA: Para este ensayo, utilice placas de 24 pocillos con cubreobjetos.

  1. Después de infectar las células durante 4 h, lavar cada pocillo 3 veces con solución salina estéril a temperatura ambiente para eliminar cualquier parásito no internalizado.
  2. Centrifugar la placa a 300 x g durante 10 min a menos de 4 °C. Añadir 500 μL de paraformaldehído al 4% a cada pocillo durante 15 min.
  3. Retire el paraformaldehído y agregue 1 mL de solución salina.
  4. Prepare las soluciones como se describe en la Tabla 1.
Soluciones primariasCompuesto químicoDiluyente
Solución de cloruro de amonio0,134 g de NH4Cl50 ml de PBS 1X
Saponina 15%150 mg de saponina1 mL de PBS 1X
Albúmina de suero bovino (ABS) 10%1 g de ABS10 mL de PBS 1X
Soluciones secundariasComponente 1Componente 2Componente 3
Saponina 0,15%1mL de saponina 15%100 ml de PBS 1X-
PBS 1X / ABS 3% / Saponina 0,15%13,8 mL de PBS 1X6 mL de ABS 10%200 μL de Saponina 15%
PBS1X / ABS 0,3% / Saponina 0,15%:19,2 mL de PBS 1X0,6 mL de ABS 10%200 μL de Saponina 15%
PBS 1X / ABS 1% / Saponina 0,15%17,8 mL de PBS 1X2 mL de ABS 10%200 μL de Saponina 15%

Tabla 1: Recetas tampón.

  1. Inmunotinción
    NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse bajo agitación.
    1. Lave los cubreobjetos 3 veces con 1x PBS durante 5 min.
    2. Añadir 500 μL de solución de cloruro de amonio por pocillo durante 10 min.
    3. Lave los cubreobjetos 3 veces con 1x PBS durante 5 min.
    4. Permeabilizar la membrana con Saponina 0,15% durante 15 min.
    5. Incubar las células con la solución de bloqueo (PBS 1x / ABS 3% / Saponina 0,15%) durante 1 h.
    6. Lave los cubreobjetos 3 veces con PBS 1x/Saponin 0.15% durante 5 min.
    7. Diluir los anticuerpos primarios en PBS 1x /ABS 1% /Saponina 0,15% como: Conejo anti-FAK (pTyr397): dilución 1:500, Conejo anti-paxilina (pTyr118): dilución 1:100. Ratón Anti-Rac1: dilución 1:100. Conejo Anti-Cdc42: dilución 1:200. Conejo Anti-RhoA: dilución 1:200.
    8. Incubar células con anticuerpo primario diluido en PBS 1x/ABS 1%/Saponina 0,15% durante 1 h.
      NOTA: FAK y Paxillin son moléculas clave involucradas en la formación de complejos de adhesión 13,14,15. La familia Rho GTPasa es responsable de la organización del citoesqueleto de actina. RAC1 y Cdc42, localizados en el borde frontal de la célula, controlan la formación de lamelópodos y filopodios, respectivamente; RhoA se encuentra en la parte posterior de la célula y está involucrada en la contracción del citoesqueleto15, 23,24,25.
    9. Lave los cubreobjetos 3 veces con 1x PBS/Saponina 0.15% durante 5 min.
    10. Diluir el anticuerpo secundario o faloidina de la siguiente manera: Anti-conejo IgG, Alexa Fluor 568: dilución 1:500; IgG antiratón, Alexa Fluor 488: dilución 1:500; IgG anti-ratón, Alexa Fluor 594: dilución 1:500; Phalloidin Alexa Fluor 488: dilución 1:1200.
    11. Incubar células con anticuerpo secundario o faloidina diluida en 1x PBS/ABS 0,3% Saponina 0,15% durante 45 min.
      NOTA: La incubación del anticuerpo secundario o faloidina debe realizarse en ausencia de luz. Cubra las placas con papel de aluminio para protegerlas de la luz durante los siguientes pasos.
    12. Lave los cubreobjetos 3 veces con 1x PBS durante 5 min.
    13. Retire los cubreobjetos de los pozos.
    14. En ausencia de luz, agregue 10 μL de medio de montaje con DAPI sobre portaobjetos de vidrio microscópico limpios.
    15. Coloque cubreobjetos con las celdas hacia abajo para permitir el contacto entre las celdas y la solución DAPI.
      NOTA: Cubra los portaobjetos con papel de aluminio para protegerlos de la luz.
    16. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
    17. Conservar a -20 °C.

6. Microscopía confocal, adquisición y cuantificación de imágenes mediante FIJI

NOTA: Para adquirir/capturar imágenes de inmunofluorescencia, utilice un microscopio de barrido láser confocal. Se recomienda una lente de objetivo de 63x por inmersión en aceite para una resolución óptima.

  1. Deje que los cubreobjetos alcancen la temperatura ambiente, protegidos de la luz, durante al menos 30 minutos antes de la adquisición de la imagen.
  2. Limpie los cubreobjetos con papel absorbente.
  3. Agregue una gota de aceite de inmersión al objetivo y coloque cada portaobjetos bajo el microscopio.
  4. Mueva el objetivo hasta que el aceite toque la corredera.
  5. Observe y ajuste el enfoque del microscopio; Selecciona el objetivo 63x con aceite.
  6. Encienda los láseres en longitudes de onda de 488 nm, 552 nm y 405 nm .
  7. Seleccione la resolución de la imagen: 1024 x 1024.
  8. Haga clic en el botón Live , configure la pila Z y presione Comenzar. Repita el proceso y, a continuación, pulse Fin.
  9. Después de seleccionar la opción Proyección máxima en el menú Herramienta , espere a que se adquiera la imagen.
  10. Guarde el experimento.
  11. Exporte imágenes en formato .lif en una computadora. Utilice el software de análisis de imágenes de código abierto FIJI para analizar imágenes.
  12. Seleccione las imágenes que se van a analizar y seleccione Duplicar imagen.
  13. Para tener la imagen en escala de grises, seleccione Imagen | Ajustar | Umbral de color. Seleccione 0 y 255 (saturación).
  14. Seleccione el método de umbral: Predeterminado.
  15. Seleccione el color del umbral: B y W (blanco y negro).
  16. No seleccione Fondo oscuro.
  17. Seleccione: Procesar | Binario | Opciones y luego seleccione los datos relevantes que se van a medir: Área, Mín., Máx., valor de gris, densidad integrada.
  18. Seleccione la herramienta de manos libres en la barra de herramientas de Fiji y trace cada celda manualmente cuidadosamente.
  19. En el menú Analizar , seleccione Establecer mediciones. Asegúrese de tener seleccionados la intensidad integrada en el área y el valor medio de gris. Repita este proceso para cada celda.
  20. Seleccione todos los datos en la ventana Resultados y copie y pegue en un archivo de hoja de cálculo.
  21. Calcule la fluorescencia total de la celda corregida (CTCF): CTCF (Densidad de integración = Área de la celda seleccionada x Fluorescencia media de las lecturas de fondo).
  22. Abra el archivo que contiene los datos utilizando el software de análisis estadístico para realizar análisis estadísticos.

7. Análisis estadístico

  1. Abra un nuevo proyecto cuando aparezca un cuadro de diálogo de bienvenida.
  2. Elige el tipo de gráfico y el medio con SD.
  3. Aplicar a la tabla los valores obtenidos de los resultados experimentales.
  4. Seleccione Estadística descriptiva y elija la columna de opciones Estadísticas [todas las pruebas] para analizar la distribución de datos.
  5. Si los datos siguen una distribución gaussiana, elija la prueba t para analizar muestras comparando dos pares. Si la distribución no es gaussiana, analice los datos utilizando la prueba de Mann-Whitney.
  6. Elija la mejor opción de gráfico para una representación óptima de los datos.

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Resultados

Este protocolo descrito en este documento permite evaluar la migración celular y sus mecanismos asociados, como la dinámica de actina y la adhesión, proporcionando así una herramienta para determinar la migración de las células huésped infectadas por Leishmania dentro del huésped vertebrado. Los resultados presentados aquí demuestran que este ensayo in vitro proporciona indicaciones rápidas y consistentes de cambios en la adhesión celular, la migración y la ...

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Discusión

El método descrito aquí para evaluar la migración celular utilizando el sistema de inserciones de membrana de cultivo celular permite a los investigadores estudiar la respuesta migratoria de las células en un entorno bidimensional. En esta técnica, algunos pasos se consideran críticos. En primer lugar, la diferenciación de las CD humanas y la infección por Leishmania son determinantes, ya que la tasa de infección depende del donante. El uso de más de un donante por exp...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación de Apoyo a la Investigación de Bahía (Fapesb), subvención número 9092/2015. Los autores agradecen al CNPq, a la Capes y a la Fapesb por el apoyo financiero a través de becas. Los autores desean agradecer a Andris K. Walter por su análisis crítico, revisión en inglés y asistencia en la edición de manuscritos.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
16 Gauge needleDescarpack353101
24 well cell culture plateJET-BIOFILJ011024
25 Gauge needleDescarpack353601
Albumin from bovine serumSigma AldrichA2153-100G
Ammonium chlorideSigma AldrichA-0171
Anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488InvitrogenA32723
Anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594InvitrogenA11032
Anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 568InvitrogenA11011
CD14 MicroBeadsMACS Myltenyi Biotec130-050-201
Cell Culture Flask 25cm2SPL70125
CellstripperCorning25-056-CI
Confocal microscopeLeicaTCS SP8
Coverslip circles 13mmPerfecta10210013CE
Dissecting ForcepsVWR82027-406
EDTASigma AldrichE6758
Falcon tubeKASVIK19-0051
Fetal Bovine Serumgibco16000044
Fluorescence microscopeOlympus BX51
Glass slide  25,4x76,2mmPerfecta200
Hemin bovineSigma AldrichH2250
HemocytometerPerfecta7302HD
Histopaque® 1077Sigma Aldrich10771
MACS bufferMACS Myltenyi Biotec130-091-221
Minimum Essential MediumGibco41090093
Mouse anti-Rac1BD610650
ParaformaldehydeSigma Aldrich158127
Phalloidin Alexa Fluor 488InvitrogenA12379
Phosphate Buffered SalineThermoFisherAM9624
Polycarbonate Membrane Transwell Inserts - Pore size 5.0 µmCorning3421
ProLong Gold DAPI kitInvitrogenP36931
Rabbit anti-Cdc42InvitrogenPA1-092X
Rabbit anti-FAK (pTyr397)InvitrogenRC222574
Rabbit anti-paxilin (pTyr118)InvitrogenQF221230
Rabbit anti-RhoAInvitrogenOSR00266W
Recombinant Human CCL3R&D Systems270-LD-010
Recombinant Human GM-CSFPeproTech300-03
Recombinant Human IL-4PeproTech200-04
Recombinant Human M-CSFPeproTech300-25
RPMI 1640 MediumGibco21870076
SaponinSigma Aldrich47036 – 50G – F
Syringe 3 mLDescarpack324201
Trypan BlueGibco15250061

Referencias

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