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요약

여기에서는 리슈마니아에 감염된 수지상 세포의 이동을 탐색하여 리슈마니아-숙주 상호 작용의 의미를 연구합니다. 수지상 세포의 분화 및 감염, 이동 분석, 접착 복합체 및 액틴 역학의 평가에 대해 설명합니다. 이 방법은 리슈마니아 또는 기타 세포 내 기생충 종에 감염된 경우 다른 숙주 세포 이동 연구에 적용할 수 있습니다.

초록

리슈마니아 는 세포 내 원생동물 기생충으로, 자가 분해되는 국소 피부 병변에서 매우 치명적인 내장 형태의 질병에 이르기까지 광범위한 임상 증상을 유발합니다. 현재 전 세계적으로 약 1,200만 명이 감염되어 있는 것으로 추산되며, 3억 5,000만 명이 감염 위험에 직면해 있습니다. 대식세포나 수지상 세포와 같은 리슈마니아 기생충에 감염된 숙주 세포는 다른 숙주 조직으로 이동할 수 있는 것으로 알려져 있지만, 이동이 기생충 전파 및 귀환에 어떻게 기여하는지는 잘 알려져 있지 않습니다. 따라서 숙주 세포 반응, 부착 및 이동을 조절하는 이러한 기생충의 능력을 평가하면 질병 전파 및 내장화와 관련된 메커니즘을 밝힐 수 있습니다. 세포 이동은 세포가 분극과 돌출을 겪어 이동할 수 있도록 하는 복잡한 과정입니다. 액틴(actin) 및 튜불린(tubulin) 기반 미세소관 역학(microtubule dynamics)에 의해 조절되는 이 과정에는 기질에 대한 세포 접착의 조절을 포함한 다양한 요인이 포함됩니다. 세포 접착 및 이동 과정은 여러 모델을 사용하여 조사되었습니다. 여기에서는 리슈마니아 감염 중 숙주 세포의 이동 측면을 특성화하는 방법을 설명합니다. 이 상세한 프로토콜은 수지상 세포의 분화 및 감염, 숙주 세포 운동성 및 이동 분석, 접착 복합체 및 액틴 역학의 형성을 제시합니다. 이 시험관 내 프로토콜은 척추동물 숙주 조직 내 리슈마니아 전파와 관련된 메커니즘을 추가로 밝히는 것을 목표로 하며 다른 세포 이동 연구에도 수정 및 적용할 수 있습니다.

서문

리슈마니아증은 리슈마니아(Leishmania) 속에 속하는 원생동물 기생충에 의해 유발되는 방치된 열대성 질환으로, 자가 치유 국소 피부 병변에서 치명적인 내장 형태의 질병에 이르기까지 광범위한 임상 증상을 초래합니다. 매년 최대 100만 건의 새로운 리슈마니아증 사례가 발생하는 것으로 추정되며, 현재 전 세계적으로 1,200만 명이 감염된 것으로 보고되고 있습니다1. 치료하지 않고 방치할 경우 95% 이상에서 치명적일 수 있는 내장 리슈마니아증(VL)은 매년 50,000명 이상의 사망을 초래하며, 남미, 동아프리카, 남아시아 및 지중해 지역에서 수백만 명의 사망자에게 영향을 미치고 있습니다2. 신세계에서 VL의 주요 병인인 Leishmania infantum은 혈액을 섭취하는 동안 감염된 암컷 모래파리에 의해 인간에게 전염됩니다3. 이러한 기생충은 식세포(phagocyte), 예를 들어 대식세포(macrophage) 및 수지상 세포(dendritic cell)에 의해 인식되고 내재화됩니다 3,4,5. 이 세포 내부에서 기생충은 amastigotes로 알려진 세포 내 형태로 분화한 다음 증식하여 림프계와 혈류를 통해 다른 숙주 조직으로 운반됩니다 6,7. 그러나 리슈마니아 기생충이 척추동물 숙주에 전파되는 메커니즘과 이 과정에서 숙주 세포 이동이 수행하는 역할은 불분명합니다.

세포 이동은 백혈구8을 포함한 모든 핵세포에 의해 수행되는 복잡한 과정입니다. 세포 이동의 고전적인 순환 모델에 따르면, 이 과정은 5단계로 나눌 수 있는 몇 가지 통합된 분자 이벤트를 포함합니다. 매트릭스 접촉에 대한 선행 가장자리의 접착; 세포 세포질의 수축; 접촉 부위로부터 세포의 뒤쪽 가장자리를 방출하는 단계; 및 세포의 후방에서 전방으로의 막 수용체의 재활용9.

세포 이동이 일어나기 위해서는 돌기가 형성되어야 하고 그런 다음 세포외 기질에 부착되어 안정화되어야 합니다. 세포 이동의 촉진에 관여하는 다양한 수용체 유형 중에서 인테그린(integrin)이 주목할 만합니다. 인테그린 활성화는 이주 관련 신호전달을 초래합니다. 그런 다음 세포 내 신호는 탈린, 빈쿨린 및 팍실린 몰레큐 외에도 국소 접착 키나아제(FAK) 및 Src 계열 키나아제를 통해 발생합니다 10,11,12. FAK를 포함한 활성화된 키나아제에 의한 팍실린의 인산화는 세포 이동을 촉진하는 외부 신호를 전달하는 효과기 분자의 모집으로 이어집니다. 팍실린(paxillin)은 세포 부착, 액틴 중합 및 세포 이동 과정에 중요한 세포 내 분자인 것으로 나타났습니다 13,14,15.

액틴 세포골격(actin cytoskeleton)은 식세포의 분극과 이동에 중심적인 역할을 합니다16. 세포 이동 과정에서 액틴 중합으로 인해 형성된 돌출부는 세포외 기질에 대한 세포 접착을 통해 안정화됩니다. 이 과정은 액틴 세포골격 17,18,19와 관련된 인테그린 수용체에 의해 조절될 수 있습니다. 여러 액틴 결합 단백질은 세포 돌출부에서 액틴 중합 속도와 조직을 조절합니다20. 연구에 따르면 RhoA, Rac 및 Cdc42는 세포외 인자에 의한 부착 세포의 자극 후 액틴 재편성을 조절하는 것으로 나타났습니다21,22. 이동하는 동안 Rac1 및 Cdc42는 세포의 앞쪽 가장자리에 위치하여 각각 lamellipodia와 filopodia의 확장을 조절하는 반면, 세포 뒤쪽에 위치한 RhoA는 actomyosin 세포골격 15,23,24,25의 수축을 조절합니다.

연구에 따르면 리슈마니아 감염은 세포 기질에 대한 접착 및 이동과 같은 숙주 세포 기능을 조절합니다 26,27,28,29,30,31. 미성숙 DC는 말초 조직에 상주합니다. PAMPS와 상호 작용하면 이러한 세포가 활성화되고 배출 림프절로 이동하여 T 세포에 항원 제시를 유도합니다. 마우스 모델을 사용한 이전 연구에서는 L. amazonensis 감염이 림프절 배수로의 DC 이동을 감소시키는 것으로 나타났습니다29. 또한 접착 과정의 억제가 L. major30 감염 후 DC 이동을 감소시킨다는 것이 입증되었습니다. 그럼에도 불구하고, DC 이동이 숙주 내 기생충 확산에 미치는 영향과 이 과정에 관련된 메커니즘은 잘 이해되지 않고 있습니다.

여기에서는 리슈마니아에 감염된 인간 DC와 관련된 체외 접착 및 이동 분석을 수행하기 위한 컴파일된 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 DC의 분화 및 감염으로 구성될 뿐만 아니라 숙주 세포 운동성 및 이동, 접착 복합체의 형성 및 액틴 역학의 분석을 가능하게 합니다. 현재 설명된 시험관 내 프로토콜을 통해 연구자들은 척추동물 숙주 조직 내 리슈마니아 전파와 관련된 메커니즘을 추가로 조사할 수 있으며 다른 세포 이동 연구에 조작 및 적용할 수도 있습니다.

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프로토콜

여기에 설명된 절차는 Gonçalo Moniz Institute의 기관 검토 위원회(IGM-FIOCRUZ, 프로토콜 번호 2.751.345)의 승인을 받았습니다. 혈액 샘플은 건강한 자발적 기증자로부터 채취했습니다. 동물 실험 절차는 브라질 법률 11.784/2008에서 채택한 동물 연구 윤리 원칙에 따라 수행되었으며 Gonçalo Moniz Institute의 동물 연구 윤리 위원회(IGM-FIOCRUZ, 프로토콜 번호 014/2019)의 승인 및 허가를 받았습니다.

1. 인간 수지상 세포의 분리 및 분화

  1. 50mL 원심분리 튜브에 밀도 구배 배지 10mL를 피펫팅합니다.
  2. 각 기증자의 샘플에 따라 50mL 튜브에 라벨을 부착합니다.
  3. 건강한 기증자로부터 ~ 50mL의 정맥혈을 수집하고 채취 후 흐름 캐비닛에 설명된 절차를 따르십시오.
  4. 수집된 혈액을 원심분리 튜브에 조심스럽게 옮기고 실온에서 1:1의 비율로 식염수(0.9% 염화나트륨)에 희석합니다.
  5. 밀도 구배 매체의 상단에 희석된 혈액을 천천히 오버레이합니다.
  6. 혈액 및 밀도 구배 배지를 담은 원심분리기 튜브를 실온에서 30분 동안 400 x g 에서 사용합니다.
    알림: 그라디언트 레이어의 혼합을 방지하기 위해 원심분리하기 전에 브레이크를 끄십시오. 1차 원심분리 후 원심분리기 온도를 4°C로 낮춥니다.
  7. 원심분리기에서 튜브를 조심스럽게 제거합니다.
  8. 샘플에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 고리를 확인합니다(버피 코트). 피펫으로 잔류 혈장을 부드럽게 제거합니다.
    참고: 원심분리 후 적혈구, 밀도 구배 매질, PBMC 고리 및 혈장과 같은 구배층이 형성됩니다. PBMC 링은 밀도 구배 매질과 플라즈마 층 사이에 위치합니다.
  9. 구름과 같은 PBMC 층을 새 튜브로 옮기고 식염수로 부피를 30mL로 높입니다.
  10. 세포 현탁액이 들어 있는 튜브를 250 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리고 펠릿을 1mL의 식염수에 재현탁합니다.
  11. 트리판 블루 배제 방법을 사용하여 세포 계수를 위한 부분 표본을 수집합니다. 먼저 1:1,000의 비율로 희석합니다. 그런 다음 트리판 블루 염색을 위해 희석된 세포 10μL를 사용하고 Neubauer 챔버를 사용하여 세포 생존율을 측정합니다.
  12. 200 x g 에서 4°C에서 10분 동안 다시 원심분리기를 합니다.
  13. 펠릿을 MACS 버퍼에 재현탁시킵니다. 1 x 107 셀마다 80μL의 버퍼를 사용합니다.
    참고: MACS 완충액 조성물: 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.2, 0.5% 소 혈청 알부민(BSA) 및 2mM EDTA를 포함하는 용액을 준비합니다. 완충 용액을 헹굼 용액과 1:20 비율로 희석합니다. 버퍼를 차갑게 유지하고 2-8 °C에서 보관하십시오.
  14. 1.13단계에서 준비한 세포 현탁액에 CD14 마이크로비즈를 추가합니다. 1 x 107 세포마다 20 μL의 CD14 마이크로비드를 사용합니다.
    참고: CD14 마이크로비드는 대부분의 단핵구에서 발현된 CD14 양성 세포에 비드가 결합하기 때문에 PBMC에서 인간 단핵구를 양성 선별하는 데 사용됩니다.
  15. 펠릿과 마이크로비드를 포함하는 용액을 피펫을 사용하여 균질화합니다. 15분 동안 얼음 위에 두십시오.
  16. 현탁액을 300 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
  17. MACS 버퍼에서 셀을 다시 suspend합니다. 세포 마이크로비드 혼합물의 1 x 107 세포에 대해 1-2mL를 사용합니다.
  18. 현탁액을 300 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
  19. 상층액을 흡입하고 펠릿을 500μL의 MACS 완충액에 재현탁합니다.
    참고: 이것은 하나의 컬럼을 통해 처리할 수 있는 세포 현탁액의 최대 부피입니다.
  20. 마그네틱 컬럼을 조립합니다.
  21. 500μL의 MACS 완충액을 추가하여 컬럼을 한 번 세척합니다. 버퍼가 컬럼을 통해 중력 하에서 흐르도록 합니다.
    알림: 유입되는 공기가 컬럼을 막을 수 있으므로 컬럼을 건조시키지 마십시오.
  22. 1.19단계의 세포 샘플 용액 500μL를 컬럼당 추가합니다. 세포 샘플 용액이 중력 하에서 컬럼을 통해 흐르도록 합니다.
  23. 500μL의 MACS 버퍼(2x)를 추가하여 컬럼을 세척합니다. 컬럼 저장소가 비어 있는 경우에만 새 버퍼를 추가합니다. 건조를 피하십시오.
  24. MACS 완충액 1mL를 피펫으로 컬럼에 넣고 그 아래에 있는 새 튜브에 넣습니다. 플런저를 컬럼에 단단히 밀어 넣어 자기적으로 라벨링된 세포를 즉시 씻어냅니다.
  25. CD14 농축 세포를 300 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
  26. Neubauer 챔버를 사용하여 세포를 계산합니다.
  27. 인터루킨-4(IL-4)(100μL/mL) + 과립구-대식세포 집락자극인자(GM-CSF)(50ng/mL)로 1mL 완전 RPMI로 세포를 재현탁합니다.
    참고: GM-CSF는 대식세포, T세포, 비만세포, 자연살해세포, 내피세포, 섬유아세포에서 분비되는 사이토카인으로 골수에서 골수성 전구세포의 분화 및 증식을 유도합니다. GM-CSF 및 IL-4는 수지상 세포 분화를 유도하는 데 사용됩니다32.
  28. 500 μL의 완전한 RPMI 배지에 웰당 2 ×10 5 세포의 농도로 24 웰 플레이트에 종자 세포를 넣고 37 °C의 세포 배양 인큐베이터에서 7일 동안 세포를 배양합니다.

2. Leishmania infantum 재배

참고: 이 분석에는 Leishmania infantum (MCAN/BR/89/BA262) 기생충이 사용됩니다. 햄스터는 멸균 식염수에 1 x 106 L. infantum promastigotes를 함유한 용액 20 μL를 정맥 주사했습니다. 1-2개월 후, 동물을 안락사시키고 리슈마니아(Leishmania )의 아마스티고트(amastigote) 형태를 비장에서 회수하여 프로유스티고테스(promastigotes)로 분화시켰다33.

  1. 이전에 감염된 햄스터 비장에서 분리한 L. infantum promastigotes를 3mL의 Novy-Nicolle-MacNeal 배지(NNN)와 5mL의 보충된 최소 필수 배지(MEM)가 포함된 경사진 25cm2 세포 배양 플라스크에서 성장시킵니다.
    참고: 이 분석에서, MEM 배지에는 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 24.5nM 헴민 소가 보충되었습니다.
  2. BOD (Bio-Oxygen Demand) 인큐베이터에서 24 ° C에서 7 일 동안 배양하십시오.
  3. 100μL의 프로마스티고트 배양액을 5mL의 MEM 배지가 함유된 새로운 25cm2 세포 배양 플라스크에 피펫팅합니다.
  4. promastigote가 고정상에 도달할 때까지 bod incubator에서 24°C에서 promastigote 배양을 배양합니다. 성장의 정지기를 결정하기 위해 식염수에 희석된 기생충 현탁액의 분취액을 Neubauer 챔버(즉, 혈구계)로 옮겨 배양된 promastigotes를 주기적으로 계수합니다.
    참고: 토끼 혈액의 잔류 흔적을 피하기 위해 NNN 배지에서 배양 후 첫 번째 통로 기생충을 사용하는 것은 권장하지 않습니다.
  5. L. infantum promastigotes의 고정 성장기 배양 1 x 105를 새로운 25cm2 세포 배양 플라스크로 옮기고 MEM 보충 배지 5mL를 추가합니다.
  6. 고정상이 달성될 때까지 Neubauer 챔버를 사용하여 약 7일 동안 주기적으로 배양물의 성장을 모니터링합니다. 기생충은 이제 실험적인 감염 절차에 사용할 준비가 되었습니다.
    참고: 프로마스티고트 배양물은 in vitro 에서 최대 7개의 계대까지 감염에 생존할 수 있는 것으로 간주됩니다. 추가 계대는 독성 소실을 유발할 수 있습니다.

3. 인간 수지상 세포 감염

  1. 생물학적 층류 캐비닛 내부에서 기생충 배양 플라스크의 모든 내용물을 50mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
  2. 최종 부피 40mL에 저온 식염수를 추가합니다.
  3. 1,600 xg 에서 4°C에서 10분간 원심분리기.
  4. 원심분리 후 상등액을 버리고 펠릿을 1mL의 냉식염수에 재현탁합니다(3.3-3.4단계 3회 반복).
  5. 생존 불가능한 기생충을 제거하기 위해 세포를 세척한 후 펠릿을 1mL의 차가운 식염수에 재현탁합니다.
  6. 16G 바늘이 달린 1mL 주사기에 내용물을 천천히 통과시켜 기생충 클러스터를 분리합니다.
  7. 혈구계에서 기생충 농도를 측정하기 위해 부분 표본을 제거합니다(4개 사분면의 평균 기생충 수 x 희석 계수 x 104 계산).
  8. 1mL의 식염수를 첨가하고 300 x g 의 세포를 실온에서 10분(3회) 원심분리하여 수지상 세포를 세척합니다.
  9. 실험적 감염에 필요한 L. infantum 의 양을 계산합니다. 비율 : 세포 당 20 개의 기생충.
  10. 필요한 부피의 L. infantum 을 세포 배양 플레이트의 각 웰에 놓습니다.
  11. 기생충이 있는 수지상 세포를 37°C의 인큐베이터에서 5% CO2 이하로 4시간 동안 배양합니다.
  12. 3.11단계 후 300 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리 플레이트를 만듭니다.

4. 세포 배양 삽입물을 사용한 마이그레이션 분석

  1. 감염 후 수지상 세포(감염 여부와 관계없이)를 실온에서 식염수 1mL로 3회 세척하여 내재화되지 않은 기생충을 제거합니다. 세척할 때마다 300 x g 의 원심분리기 플레이트를 4°C에서 10분 동안 가열합니다.
  2. 내부화되지 않은 기생충이 제거되면 각 웰에 200μL의 세포 해리 시약을 첨가하여 세포를 분리하고 15분 동안 배양합니다. 세포를 37 ° C의 5 % CO2 이하로 인큐베이터에 보관하십시오.
  3. 1,000 μL 피펫 팁을 사용하여 세포를 균질화하여 세포가 느슨해질 수 있도록 합니다.
  4. 해리된 세포를 50mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
  5. 300 x g 에서 4°C에서 10분간 원심분리기.
  6. 10% FBS가 보충된 1mL의 RPMI 배지에 펠릿을 재현탁합니다.
  7. 각 튜브의 내용물을 1mL 주사기에 25G 바늘로 5회 천천히 통과시켜 세포를 분리합니다.
  8. 부분 표본을 제거하고 트리판 블루를 사용하여 혈구계를 사용하여 세포 농도를 측정하기 위해 희석합니다(4사분면의 생존 가능한 세포의 평균 × 희석 계수 ×10 4).
  9. 세포 배양 마이크로플레이트 인서트 준비:
    참고: 세포 배양 삽입물(5.0μM 공극 폴리카보네이트 멤브레인)은 수지상 세포, 대식세포 및 단핵구를 사용하는 이동 분석에 권장되는데, 이러한 삽입체는 식세포가 멤브레인을 통과할 수 있도록 하기 때문입니다.
    1. 멸균 핀셋으로 삽입물을 제거하고 빈 우물에 넣습니다.
    2. 각 웰에 10% FBS가 보충된 600μL의 RPMI 배지를 추가합니다. 화학유인물질 케모카인(C-C 모티프) 리간드 3(CCL3)(배지 1mL당 1μL)을 추가합니다.
      참고: CCL3는 DC 이동을 조절하는 케모카인입니다34.
    3. 멸균 핀셋을 사용하여 매체가 들어 있는 웰에 삽입물을 놓습니다.
  10. 각 삽입물에 100μL의 배지에 2 x 105 수지상 세포(감염 여부와 관계없이)를 추가합니다.
  11. 세포가 이동할 수 있도록 4시간 동안 배양합니다.
  12. 4시간 후 플레이트를 꺼내 매체를 흡인합니다. 100μL의 4% 파라포름알데히드를 첨가하고 15분 동안 배양합니다.
  13. 파라포름알데히드를 제거하고 식염수 100μL를 첨가합니다.
    알림: 플레이트는 나중에 조립할 수 있도록 4°C로 유지할 수 있습니다.
  14. 삽입물 또는 웰에서 상층액을 수집하여 이동하지 않는 세포 또는 멤브레인을 교차하는 세포를 각각 계산합니다. 파라포름알데히드 4%로 15분 동안 배양합니다.
  15. 세포원심분리(cytocentrifugation) 기법을 사용하여 세포를 농축35.
  16. DAPI가 있는 장착 매체 10μL를 멤브레인에 추가하고 웰 위에 커버슬립을 놓습니다.
  17. 인서트 멤브레인의 조립.
    참고: 이 단계는 생물 안전 캐비닛 외부에서 수행할 수 있습니다.
    1. 웰에서 인서트 멤브레인을 제거합니다.
    2. 면봉으로 삽입물 표면을 긁어 이동하지 않은 세포를 제거합니다.
    3. 메스를 사용하여 인서트에서 멤브레인을 제거합니다.
    4. 세포가 위를 향하도록 하여 슬라이드에 멤브레인을 놓습니다.
    5. DAPI가 있는 10μL의 마운팅 매체를 각 멤브레인에 추가한 다음 오버레이 커버슬립을 배치합니다.
    6. 알루미늄 호일로 플레이트를 덮습니다.
    7. 플레이트를 실온에서 30분 동안 배양한 다음 -20°C에서 보관하십시오.
  18. 세포 이동을 분석하려면 405nm의 레이저 여기 파장에서 형광 현미경을 사용하여 필드당 세포 수(10개 필드 이상)를 계산합니다.

5. 면역형광에 의한 액틴 중합화의 접착 분석 및 평가

참고: 이 분석의 경우 커버슬립이 있는 24웰 플레이트를 사용합니다.

  1. 4시간 동안 세포를 감염시킨 후 실온에서 멸균 식염수로 각 웰을 3회 세척하여 내재화되지 않은 기생충을 제거합니다.
  2. 플레이트를 300 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 500μL의 4% 파라포름알데히드를 각 웰에 15분 동안 추가합니다.
  3. 파라포름알데히드를 제거하고 식염수 1mL를 넣는다.
  4. 표 1에 설명된 대로 솔루션을 준비합니다.
기본 솔루션화합물희석제
염화 암모늄 용액NH4Cl 0,134gPBS 50X 1ml
사포닌 15%사포닌 150 mg1 mL 드 PBS 1X
소 혈청 알부민(ABS) 10%ABS 1gPBS 1X 10mL
2차 솔루션구성 요소 1구성 요소 2구성 요소 3
사포닌 0,15%사포닌 1mL 15%PBS 1X 100mL-
PBS 1X / ABS 3% / 사포닌 0,15%PBS 1X 13,8mLABS 6mL 10%사포닌 200μL 15%
PBS1X / ABS 0,3% / 사포닌 0,15%:PBS 1X 19,2mLABS 0,6 mL 10 %사포닌 200μL 15%
PBS 1X / ABS 1% / 사포닌 0,15%PBS 1X 17,8mLABS 10% 2mL사포닌 200μL 15%

표 1: 버퍼 레시피.

  1. 면역염색
    참고: 다음 단계는 교반 상태에서 수행해야 합니다.
    1. 1x PBS로 커버슬립을 3분 동안 5회 세탁합니다.
    2. 웰당 500μL의 염화암모늄 용액을 10분 동안 추가합니다.
    3. 1x PBS로 커버슬립을 3분 동안 5회 세탁합니다.
    4. 멤브레인을 Saponin 0.15%로 15분 동안 투과시킵니다.
    5. 차단 용액(PBS 1x / ABS 3% / Saponin 0.15%)으로 세포를 1시간 동안 배양합니다.
    6. PBS 1x/사포닌 0.15%로 커버슬립을 5분 동안 3회 세탁합니다.
    7. PBS 1x /ABS 1%/Saponin 0.15%에서 1차 항체를 다음과 같이 희석합니다: Rabbit anti-FAK (pTyr397): 1:500 희석, Rabbit anti-paxilin (pTyr118): 1:100 희석. 마우스 Anti-Rac1: 1:100 희석. 토끼 Anti-Cdc42 : 1:200 희석. 토끼 Anti-RhoA: 1:200 희석.
    8. PBS 1x/ABS 1%/Saponin 0.15%로 희석된 1차 항체로 세포를 1시간 동안 배양합니다.
      참고: FAK와 Paxillin은 접착 복합체 13,14,15의 형성에 관여하는 핵심 분자입니다. Rho GTPase 제품군은 액틴 세포골격(actin cytoskeleton)의 조직을 담당합니다. 세포의 앞쪽 가장자리에 위치한 RAC1 및 Cdc42는 각각 lamellipodia와 filopodia의 형성을 조절합니다. RhoA는 세포의 뒤쪽에 위치하며 세포골격 수축15, 23,24,25에 관여합니다.
    9. 1x PBS/사포닌 0.15%로 커버슬립을 5분 동안 3회 세척합니다.
    10. 다음과 같이 2차 항체 또는 팔로이딘을 희석합니다: 항토끼 IgG, Alexa Fluor 568: 1:500 희석; 안티 마우스 IgG, Alexa Fluor 488 : 1 : 500 희석; 안티 마우스 IgG, Alexa Fluor 594 : 1:500 희석; Phalloidin Alexa Fluor 488 : 1 : 1200 희석.
    11. 1x PBS/ABS 0.3%, 사포닌 0.15%에 희석된 2차 항체 또는 팔로이딘으로 세포를 45분 동안 배양합니다.
      참고: 2차 항체 또는 팔로이딘의 배양은 빛이 없는 곳에서 수행해야 합니다. 다음 단계에서 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 플레이트를 덮으십시오.
    12. 1x PBS로 커버슬립을 3분 동안 5회 세탁합니다.
    13. 우물에서 커버 슬립을 제거합니다.
    14. 빛이 없는 경우 DAPI가 있는 10μL의 장착 매체를 깨끗하고 미세한 유리 슬라이드에 추가합니다.
    15. 세포와 DAPI 용액이 접촉할 수 있도록 세포가 아래를 향하도록 커버슬립을 놓습니다.
      알림: 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 슬라이드를 덮으십시오.
    16. 실온에서 30분 동안 배양합니다.
    17. -20 °C에서 보관하십시오.

6. FIJI를 이용한 컨포칼 현미경, 이미지 획득 및 정량화

참고: 면역형광 이미지를 획득/캡처하려면 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하십시오. 최적의 해상도를 위해 Oil-immersion 63x 대물 렌즈를 사용하는 것이 좋습니다.

  1. 이미지 획득 전에 최소 30분 동안 커버슬립이 빛으로부터 보호되는 실온에 도달하도록 합니다.
  2. 흡수성 티슈로 커버슬립을 청소하십시오.
  3. 대물렌즈에 이멀젼 오일 한 방울을 넣고 각 슬라이드를 현미경 아래에 놓습니다.
  4. 오일이 슬라이드에 닿을 때까지 대물렌즈를 움직입니다.
  5. 현미경 초점을 관찰하고 조정하십시오. 오일이 포함된 63X 대물렌즈를 선택합니다.
  6. 488nm, 552nm 및 405nm 파장에서 레이저를 켭니다.
  7. 이미지 해상도 선택: 1024 x 1024.
  8. 라이브 버튼을 클릭하고 Z 스택을 설정한 다음 시작을 누릅니다. 이 과정을 반복한 다음 End를 누릅니다.
  9. 도구 메뉴에서 최대 투영 옵션을 선택한 후 이미지가 획득될 때까지 기다립니다.
  10. 실험을 저장합니다.
  11. 컴퓨터에서 이미지를 .lif 형식으로 내보냅니다. FIJI 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석합니다.
  12. 분석할 이미지를 선택하고 이미지 복제를 선택합니다.
  13. 이미지를 회색조로 표시하려면 이미지 | 조정 | 색상 임계값. 0 및 255 (채도)를 선택합니다.
  14. 임계값 방법( 기본값)을 선택합니다.
  15. 임계값 색상 선택: B 및 W (흑백).
  16. 어두운 배경을 선택하지 마십시오.
  17. 선택: 프로세스 | 바이너리 | 옵션을 선택한 다음 측정할 관련 데이터를 선택합니다: Area, Min, Max, gray value, integrate density.
  18. 피지 도구 모음에서 자유 손 도구를 선택하고 각 셀을 수동으로 주의 깊게 추적하십시오.
  19. Analyze( 분석 ) 메뉴에서 Set measurements(측정값 설정)를 선택합니다. area integrated intensity 및 mean grey 값이 선택되어 있는지 확인하십시오. 각 셀에 대해 이 과정을 반복합니다.
  20. 결과 창에서 모든 데이터를 선택하고 복사하여 스프레드시트 파일에 붙여넣습니다.
  21. 보정된 총 세포 형광(CTCF) 계산: CTCF(적분 밀도 = 선택한 세포의 면적 x 배경 판독값의 평균 형광).
  22. 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터가 포함된 파일을 열어 통계 분석을 수행합니다.

7. 통계 분석

  1. 환영 대화 상자가 나타나면 새 프로젝트를 엽니다.
  2. SD가 있는 그래프 유형과 매체를 선택합니다.
  3. 실험 결과에서 얻은 값을 표에 적용합니다.
  4. 기술 통계량을 선택하고 옵션 열 통계량 [모든 테스트]을 선택하여 데이터 분포를 분석합니다.
  5. 데이터가 가우스 분포를 따르는 경우 두 쌍을 비교하여 표본을 분석하려면 t-검정을 선택합니다. 분포가 가우스가 아닌 경우 Mann-Whitney 검정을 사용하여 데이터를 분석합니다.
  6. 최적의 데이터 표현을 위한 최상의 그래프 옵션을 선택합니다.

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결과

본원에 기술된 이 프로토콜은 세포 이동 및 액틴 역학 및 부착과 같은 관련 메커니즘의 평가를 가능하게 하며, 이에 따라 척추동물 숙주 내에서 리슈마니아에 감염된 숙주 세포의 이동을 결정하기 위한 도구를 제공한다. 여기에 제시된 결과는 이 시험관 내 분석이 생체 내 실험 전에 세포 접착, 이동 및 액틴 역학의 변화에 대한 빠르고 일관된 징후를 ?...

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토론

세포 배양 멤브레인 인서트 시스템을 사용하여 세포 이동을 평가하기 위해 여기에 설명된 방법을 통해 연구원들은 2차원 환경에서 세포의 이동 반응을 연구할 수 있습니다. 이 기술에서는 몇 가지 단계가 중요한 것으로 간주됩니다. 첫째, 인간 DC와 리슈마니아 감염의 구별은 감염률이 기증자에 따라 다르기 때문에 결정적입니다. 실험당 한 명 이상의 기증자를 사?...

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공개

저자들은 자신들이 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언한다.

감사의 말

이 작업은 Bahia Research Support Foundation(Fapesb)의 지원, 보조금 번호 9092/2015의 지원을 받았습니다. 저자는 장학금을 통한 재정적 지원을 위해 CNPq, Capes 및 Fapesb에 감사를 표합니다. 저자들은 비평적 분석, 영어 개정 및 원고 카피에디팅 지원에 대해 Andris K. Walter에게 감사를 표합니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
16 Gauge needleDescarpack353101
24 well cell culture plateJET-BIOFILJ011024
25 Gauge needleDescarpack353601
Albumin from bovine serumSigma AldrichA2153-100G
Ammonium chlorideSigma AldrichA-0171
Anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488InvitrogenA32723
Anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594InvitrogenA11032
Anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 568InvitrogenA11011
CD14 MicroBeadsMACS Myltenyi Biotec130-050-201
Cell Culture Flask 25cm2SPL70125
CellstripperCorning25-056-CI
Confocal microscopeLeicaTCS SP8
Coverslip circles 13mmPerfecta10210013CE
Dissecting ForcepsVWR82027-406
EDTASigma AldrichE6758
Falcon tubeKASVIK19-0051
Fetal Bovine Serumgibco16000044
Fluorescence microscopeOlympus BX51
Glass slide  25,4x76,2mmPerfecta200
Hemin bovineSigma AldrichH2250
HemocytometerPerfecta7302HD
Histopaque® 1077Sigma Aldrich10771
MACS bufferMACS Myltenyi Biotec130-091-221
Minimum Essential MediumGibco41090093
Mouse anti-Rac1BD610650
ParaformaldehydeSigma Aldrich158127
Phalloidin Alexa Fluor 488InvitrogenA12379
Phosphate Buffered SalineThermoFisherAM9624
Polycarbonate Membrane Transwell Inserts - Pore size 5.0 µmCorning3421
ProLong Gold DAPI kitInvitrogenP36931
Rabbit anti-Cdc42InvitrogenPA1-092X
Rabbit anti-FAK (pTyr397)InvitrogenRC222574
Rabbit anti-paxilin (pTyr118)InvitrogenQF221230
Rabbit anti-RhoAInvitrogenOSR00266W
Recombinant Human CCL3R&D Systems270-LD-010
Recombinant Human GM-CSFPeproTech300-03
Recombinant Human IL-4PeproTech200-04
Recombinant Human M-CSFPeproTech300-25
RPMI 1640 MediumGibco21870076
SaponinSigma Aldrich47036 – 50G – F
Syringe 3 mLDescarpack324201
Trypan BlueGibco15250061

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