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Résumé

Ici, nous étudions les implications de l’interaction Leishmania-hôte en explorant la migration des cellules dendritiques infectées par Leishmania. La différenciation et l’infection des cellules dendritiques, l’analyse de la migration et l’évaluation des complexes d’adhésion et de la dynamique de l’actine sont décrites. Cette méthode peut être appliquée à d’autres études sur la migration des cellules hôtes lorsqu’ils sont infectés par Leishmania ou d’autres espèces de parasites intracellulaires.

Résumé

Leishmania est un parasite protozoaire intracellulaire qui provoque un large éventail de manifestations cliniques, allant de lésions cutanées localisées auto-résolues à une forme viscérale hautement mortelle de la maladie. On estime que 12 millions de personnes dans le monde sont actuellement infectées et que 350 millions d’autres sont exposées au risque d’infection. On sait que les cellules hôtes infectées par les parasites de Leishmania , tels que les macrophages ou les cellules dendritiques, peuvent migrer vers différents tissus hôtes, mais la façon dont la migration contribue à la dissémination et au retour des parasites reste mal comprise. Par conséquent, l’évaluation de la capacité de ces parasites à moduler la réponse, l’adhésion et la migration de la cellule hôte permettra de mettre en lumière les mécanismes impliqués dans la dissémination et la viscéralisation de la maladie. La migration cellulaire est un processus complexe dans lequel les cellules subissent une polarisation et une protrusion, ce qui leur permet de migrer. Ce processus, régulé par la dynamique des microtubules à base d’actine et de tubuline, implique différents facteurs, dont la modulation de l’adhésion cellulaire au substrat. Les processus d’adhésion et de migration cellulaires ont été étudiés à l’aide de plusieurs modèles. Ici, nous décrivons une méthode pour caractériser les aspects migratoires des cellules hôtes lors de l’infection à Leishmania . Ce protocole détaillé présente la différenciation et l’infection des cellules dendritiques, l’analyse de la motilité et de la migration des cellules hôtes, ainsi que la formation des complexes d’adhésion et la dynamique de l’actine. Ce protocole in vitro vise à élucider davantage les mécanismes impliqués dans la dissémination de Leishmania dans les tissus hôtes des vertébrés et peut également être modifié et appliqué à d’autres études de migration cellulaire.

Introduction

La leishmaniose, une maladie tropicale négligée causée par des parasites protozoaires appartenant au genre Leishmania, entraîne un large éventail de manifestations cliniques, allant des lésions cutanées localisées auto-cicatrisantes aux formes viscérales mortelles de la maladie. On estime que jusqu’à un million de nouveaux cas de leishmaniose surviennent chaque année, et que 12 millions de personnes seraient actuellementinfectées dans le monde1. La leishmaniose viscérale (LV), qui peut être mortelle dans plus de 95 % des cas lorsqu’elle n’est pas traitée, cause plus de 50 000 décès par an, affectant des millions de personnes en Amérique du Sud, en Afrique de l’Est, en Asie du Sud et dans la région méditerranéenne2. Le principal agent étiologique de la LV dans le Nouveau Monde, Leishmania infantum, est transmis à l’homme par des phlébotomes femelles infectées pendant l’alimentation sanguine3. Ces parasites sont reconnus et internalisés par les phagocytes, par exemple les macrophages et les cellules dendritiques 3,4,5. À l’intérieur de ces cellules, les parasites se différencient en leurs formes intracellulaires, appelées amastigotes, qui se multiplient ensuite et sont transportées via le système lymphatique et la circulation sanguine vers différents tissus hôtes 6,7. Cependant, les mécanismes par lesquels les parasites de Leishmania sont disséminés dans l’hôte vertébré, ainsi que le rôle joué par la migration des cellules hôtes dans ce processus, restent incertains.

La migration cellulaire est un processus complexe exécuté par toutes les cellules nucléées, y compris les leucocytes8. Selon le modèle cyclique classique de la migration cellulaire, ce processus implique plusieurs événements moléculaires intégrés qui peuvent être divisés en cinq étapes : la saillie du bord d’attaque ; adhérence du bord d’attaque aux contacts matriciels ; contraction du cytoplasme cellulaire ; libération du bord arrière de la cellule des sites de contact ; et le recyclage des récepteurs membranaires de l’arrière vers l’avant de la cellule9.

Pour que la migration cellulaire se produise, des protubérances doivent être formées puis stabilisées par fixation à la matrice extracellulaire. Parmi les différents types de récepteurs impliqués dans la promotion de la migration cellulaire, les intégrines sont notables. L’activation de l’intégrine entraîne une signalisation liée à la migration ; La signalisation intracellulaire se produit ensuite via la kinase d’adhésion focale (FAK) et les kinases de la famille Src, en plus des molécules de taline, de vinculine et de paxilline 10,11,12. La phosphorylation de la paxilline par les kinases activées, y compris FAK, conduit au recrutement de molécules effectrices, qui transduisent des signaux externes qui provoquent la migration cellulaire. Il a été démontré que la paxilline est une molécule intracellulaire cruciale pour l’adhésion cellulaire, la polymérisation de l’actine et les processus de migration cellulaire 13,14,15.

Le cytosquelette d’actine joue un rôle central dans la polarisation et la migration des phagocytes16. Au cours du processus de migration cellulaire, les protubérances formées en raison de la polymérisation de l’actine se stabilisent par l’adhésion cellulaire à la matrice extracellulaire. Ce processus peut être modulé par les récepteurs de l’intégrine associés au cytosquelette d’actine 17,18,19. Plusieurs protéines liant l’actine régulent le taux et l’organisation de la polymérisation de l’actine dans les protubérances cellulaires20. Des études ont montré que RhoA, Rac et Cdc42 régulent la réorganisation de l’actine après la stimulation des cellules adhérentes par des facteurs extracellulaires21,22. Pendant la migration, Rac1 et Cdc42 sont situés au bord d’attaque de la cellule, contrôlant l’extension des lamellipodes et des filopodes, respectivement, tandis que RhoA, situé à l’arrière de la cellule, régule la contraction du cytosquelette d’actomyosine 15,23,24,25.

Des études ont montré que l’infection à Leishmania module les fonctions de la cellule hôte, telles que l’adhésion au substrat cellulaire et la migration 26,27,28,29,30,31. Les DC immatures résident dans les tissus périphériques ; lors de l’interaction avec le PAMPS, ces cellules s’activent et migrent vers les ganglions lymphatiques drainants, ce qui entraîne la présentation de l’antigène aux lymphocytes T. Une étude antérieure utilisant un modèle murin a montré que l’infection à L. amazonensis provoque une réduction de la migration des DC vers les ganglions lymphatiquesdrainants 29. Il a également été démontré que l’inhibition du processus d’adhésion réduisait la migration des DC après une infection par L. major30. Néanmoins, l’impact de la migration des DC sur la dissémination du parasite dans l’hôte, ainsi que les mécanismes impliqués dans ce processus, restent mal compris.

Nous présentons ici un protocole compilé étape par étape pour effectuer un test d’adhésion et de migration in vitro impliquant des CD humains infectés par Leishmania. Cette méthode comprend non seulement la différenciation et l’infection des DC, mais permet également l’analyse de la motilité et de la migration de la cellule hôte, la formation de complexes d’adhésion, ainsi que la dynamique de l’actine. Le protocole in vitro actuellement décrit permet aux chercheurs d’étudier davantage les mécanismes impliqués dans la dissémination de Leishmania dans les tissus hôtes des vertébrés et peut également être manipulé et appliqué à d’autres études de migration cellulaire.

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Protocole

Les procédures décrites dans le présent document ont été approuvées par le Conseil d’examen institutionnel de l’Institut Gonçalo Moniz (IGM-FIOCRUZ, protocole n° 2.751.345). Des échantillons de sang ont été prélevés sur des donneurs volontaires sains. Les procédures expérimentales sur les animaux ont été menées conformément aux principes éthiques de la recherche animale adoptés par la loi brésilienne 11.784/2008 et ont été approuvées et autorisées par le Comité d’éthique de la recherche animale de l’Institut Gonçalo Moniz (IGM-FIOCRUZ, protocole n° 014/2019).

1. Isolement et différenciation des cellules dendritiques humaines

  1. Pipeter 10 mL du milieu à gradient de densité dans des tubes à centrifuger de 50 mL.
  2. Étiquetez les tubes de 50 ml en fonction de l’échantillon de chaque donneur.
  3. Prélever ~ 50 ml de sang veineux de donneurs sains et, après le prélèvement, suivre les procédures décrites ci-dessous dans l’armoire d’écoulement.
  4. Transférez soigneusement le sang collecté dans des tubes à centrifuger et diluez-le dans une solution saline (chlorure de sodium à 0,9 %) dans un rapport de 1:1 à température ambiante.
  5. Superposez lentement le sang dilué sur le dessus du milieu à gradient de densité.
  6. Tubes à centrifuger contenant le sang et le milieu à gradient de densité à 400 x g pendant 30 min à température ambiante.
    REMARQUE : Coupez le frein avant de centrifuger pour éviter le mélange des couches de gradient. Après la 1ère centrifugation, abaissez la température de la centrifugeuse à 4 °C.
  7. Retirez délicatement les tubes de la centrifugeuse.
  8. Identifier l’anneau de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) dans l’échantillon (couche leucocytaire) ; Prélever délicatement le plasma résiduel à l’aide d’une pipette.
    REMARQUE : Après centrifugation, les couches de gradient suivantes se seront formées : érythrocytes, milieu de gradient de densité, anneau PBMC et plasma. L’anneau PBMC est situé entre le milieu à gradient de densité et les couches de plasma.
  9. Transférez la couche de PBMC semblable à un nuage dans un nouveau tube et augmentez le volume à 30 mL avec une solution saline.
  10. Centrifuger les tubes contenant une suspension cellulaire à 250 x g pendant 10 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de solution saline.
  11. Prélever une aliquote pour le comptage cellulaire à l’aide de la méthode d’exclusion du bleu de trypan. Tout d’abord, diluer dans un rapport de 1:1 000. Ensuite, utilisez 10 μL de cellules diluées pour la coloration au bleu de trypan et comptez les cellules à l’aide d’une chambre de Neubauer pour déterminer la viabilité cellulaire.
  12. Centrifuger à nouveau à 200 x g pendant 10 min à 4 °C.
  13. Remettez le granulé en suspension dans la mémoire tampon MACS. Utilisez 80 μL de tampon pour 1 x 107 cellules.
    REMARQUE : Composition du tampon MACS : Préparez une solution contenant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), un pH de 7,2, 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 2 mM d’EDTA. Diluez la solution tampon dans un rapport de 1:20 avec la solution de rinçage. Conservez le tampon au froid et conservez-le à une température de 2 à 8 °C.
  14. Ajouter les microbilles CD14 à la suspension cellulaire préparée à l’étape 1.13. Utilisez 20 μL de microbilles CD14 pour 1 x 107 cellules.
    REMARQUE : Les microbilles CD14 sont utilisées pour la sélection positive des monocytes humains à partir des PBMC, car les billes se lient aux cellules CD14 positives exprimées sur la plupart des monocytes.
  15. Homogénéiser la solution contenant la pastille et les microbilles à l’aide d’une pipette. Garder sur glace pendant 15 min.
  16. Centrifuger la suspension à 300 x g pendant 10 min à 4 °C.
  17. Résuspendez les cellules dans la mémoire tampon MACS. Utiliser 1 à 2 mL pour 1 x 107 cellules dans le mélange de microbilles de cellules.
  18. Centrifuger la suspension à 300 x g pendant 10 min à 4 °C.
  19. Aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 500 μL de tampon MACS.
    REMARQUE : Il s’agit du volume maximal de la suspension cellulaire qui peut être traité à travers une colonne.
  20. Assemblez la colonne magnétique.
  21. Lavez la colonne une fois en ajoutant 500 μL de tampon MACS. Laissez le tampon s’écouler par gravité à travers la colonne.
    REMARQUE : Ne laissez pas la colonne sécher, car tout air qui pénètre peut obstruer la colonne.
  22. Ajouter 500 μL de la solution d’échantillon cellulaire de l’étape 1.19 par colonne. Laissez la solution d’échantillon de cellule s’écouler par gravité à travers la colonne.
  23. Laver la colonne en ajoutant 500 μL de tampon MACS (2x). N’ajoutez le tampon frais que lorsque le réservoir de la colonne est vide. Évitez le séchage.
  24. Pipetez 1 mL de tampon MACS sur la colonne et placez-le dans un nouveau tube en dessous. Rincez immédiatement les cellules marquées magnétiquement en poussant fermement le piston dans la colonne.
  25. Centrifuger les cellules enrichies en CD14 à 300 x g pendant 10 min à 4 °C.
  26. Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de Neubauer.
  27. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL d’IPRR complet avec de l’interleukine-4 (IL-4) (100 μL/mL) + facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) (50 ng/mL).
    REMARQUE : Le GM-CSF est une cytokine sécrétée par les macrophages, les lymphocytes T, les mastocytes, les cellules tueuses naturelles, les cellules endothéliales et les fibroblastes qui induit la différenciation et la prolifération des progéniteurs myéloïdes dans la moelle osseuse. Le GM-CSF et l’IL-4 sont utilisés pour induire la différenciation des cellules dendritiques32.
  28. Ensemencer les cellules dans une plaque de 24 puits à une concentration de 2 × 105 cellules par puits dans 500 μL de milieu RPMI complet contenant les cellules et incuber les cellules pendant 7 jours dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 °C.

2. Culture de Leishmania infantum

REMARQUE : Les parasites Leishmania infantum (MCAN/BR/89/BA262) sont utilisés dans cet essai. Les hamsters ont été infectés par voie intraveineuse avec 20 μL de la solution contenant 1 x 10 promastigotes de6 L. infantum dans une solution saline stérile. Après 1 à 2 mois, les animaux ont été euthanasiés et les formes amastigotes de Leishmania ont été récupérées de leur rate et différenciées en promastigotes33.

  1. Cultivez des promastigotes de L. infantum isolés de rates de hamster précédemment infectées dans une fiole inclinée de25 cm contenant 3 mL de milieu Novy-Nicolle-MacNeal (NNN) et 5 mL de milieu essentiel minimum (MEM) supplémenté.
    REMARQUE : Dans cet essai, le milieu MEM a été complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 24,5 nM d’hémine bovine.
  2. Incuber à 24 °C pendant 7 jours dans un incubateur BOD (Bio-Oxygen Demand).
  3. Pipeter 100 μL de culture de promastigote dans un nouveau flacon de culture cellulairede 25 cm contenant 5 mL de milieu MEM supplémenté.
  4. Incuber la culture de promastigote à 24 °C dans un incubateur de DBO jusqu’à ce que les promastigotes atteignent la phase stationnaire. Compter périodiquement les promastigotes en culture en transférant une aliquote de suspension parasitaire diluée dans une solution saline dans une chambre de Neubauer (c’est-à-dire un hémocytomètre) pour déterminer la phase stationnaire de croissance.
    REMARQUE : Il n’est pas recommandé d’utiliser des parasites de premier passage après la culture dans un milieu NNN pour éviter les traces résiduelles de sang de lapin.
  5. Transvaser 1 x 105 de culture stationnaire en phase de croissance de L. infantum promastigotes dans une nouvelle fiole deculture cellulaire de 25 cm et ajouter 5 mL de milieu supplémenté en MEM.
  6. Surveiller périodiquement la croissance de la culture pendant environ 7 jours à l’aide d’une chambre Neubauer jusqu’à ce que la phase stationnaire soit atteinte. Les parasites sont maintenant prêts à être utilisés dans des procédures expérimentales d’infection.
    REMARQUE : Les cultures de promastigotes sont considérées comme viables pour l’infection pour un maximum de 7 passages in vitro ; des passages supplémentaires peuvent induire une perte de virulence.

3. Infection des cellules dendritiques humaines

  1. À l’intérieur d’une armoire à flux laminaire biologique, transférez tout le contenu du flacon de culture de parasites dans des tubes à centrifuger de 50 ml.
  2. Ajouter une solution saline froide à un volume final de 40 mL.
  3. Centrifugeuse à 1 600 xg pendant 10 min sous 4 °C.
  4. Jeter le surnageant après la centrifugation et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de solution saline froide (répéter les étapes 3.3 à 3.4 trois fois).
  5. Après avoir lavé les cellules pour éliminer les parasites non viables, remettre la pastille en suspension dans 1 mL de solution saline froide.
  6. Passez lentement le contenu dans une seringue de 1 ml avec une aiguille de 16 G 5 fois pour séparer les grappes de parasites.
  7. Prélever une aliquote pour déterminer la concentration de parasites dans un hémocytomètre (calculer le nombre moyen de parasites dans 4 quadrants x facteur de dilution x 104).
  8. Laver les cellules dendritiques en ajoutant 1 mL de solution saline et centrifuger les cellules à 300 x g pendant 10 min à température ambiante (3 fois).
  9. Calculer la quantité de L. infantum nécessaire pour l’infection expérimentale ; Rapport : 20 parasites par cellule.
  10. Placez le volume requis de L. infantum dans chaque puits de plaques de culture cellulaire.
  11. Incuber des cellules dendritiques avec des parasites pendant 4 h dans un incubateur à 37 °C sous 5 % de CO2.
  12. Après l’étape 3.11, centrifuger les plaques à 300 x g pendant 10 min à 4 °C.

4. Essai de migration à l’aide d’inserts de culture cellulaire

  1. Après l’infection, laver 3 fois les cellules dendritiques (infectées ou non) avec 1 mL de solution saline à température ambiante pour éliminer les parasites non internalisés. Après chaque lavage, centrifuger les plaques à 300 x g pendant 10 min à 4 °C.
  2. Une fois les parasites non internalisés éliminés, détachez les cellules en ajoutant 200 μL du réactif de dissociation cellulaire dans chaque puits et incubez pendant 15 min. Conservez les cellules dans un incubateur à 37 °C sous 5 % de CO2.
  3. Homogénéisez les cellules à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 μL pour permettre aux cellules de se détacher.
  4. Transférez les cellules dissociées dans un tube à centrifuger de 50 ml.
  5. Centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min sous 4 °C.
  6. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu RPMI complété par 10 % de FBS.
  7. Passez lentement le contenu de chaque tube dans une seringue de 1 mL avec une aiguille de 25 G 5 fois pour séparer les cellules.
  8. Prélever une aliquote, diluer à l’aide de bleu trypan pour déterminer la concentration cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre (moyenne des cellules viables dans 4 quadrants × facteur de dilution × 104).
  9. Préparation des inserts de microplaques de culture cellulaire :
    REMARQUE : Les inserts de culture cellulaire (membrane en polycarbonate à pores de 5,0 μM) sont recommandés pour les tests de migration utilisant des cellules dendritiques, des macrophages et des monocytes, car ces inserts permettent aux phagocytes de passer à travers les membranes.
    1. Retirez les inserts à l’aide d’une pince à épiler stérile et placez-les dans des puits vides.
    2. Ajouter 600 μL de milieu RPMI complété par 10 % de FBS dans chaque puits ; ajouter le ligand 3 (CCL3) de la chimiothérapie (motif C-C) (1 μL pour 1 mL de milieu).
      REMARQUE : CCL3 est une chimiokine qui régule la migration DC34.
    3. À l’aide d’une pince à épiler stérile, placez les inserts dans les puits contenant le milieu.
  10. Ajouter 2 x 105 cellules dendritiques (infectées ou non) dans 100 μL de milieu dans chaque insert.
  11. Incuber pendant 4 h pour permettre aux cellules de migrer.
  12. Au bout de 4 h, sortez la plaque et aspirez le milieu. Ajouter 100 μL de paraformaldéhyde à 4 % et incuber pendant 15 min.
  13. Retirer le paraformaldéhyde et ajouter 100 μL de solution saline.
    REMARQUE : Les plaques peuvent être maintenues à 4 °C pour un assemblage ultérieur.
  14. Prélever le surnageant dans les inserts ou dans les puits pour compter les cellules non migratrices ou celles qui ont traversé la membrane, respectivement. Incuber avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 min.
  15. Concentrer les cellules à l’aide d’une technique de cytocentrifugation35.
  16. Ajoutez 10 μL de fluide de montage avec DAPI dans les membranes et placez des lamelles sur les puits.
  17. Montage de la membrane d’insertion.
    REMARQUE : Cette étape peut être effectuée à l’extérieur des enceintes de biosécurité.
    1. Retirez les membranes d’insertion des puits.
    2. Grattez la surface de l’insert avec un écouvillon pour enlever les cellules qui n’ont pas migré.
    3. À l’aide d’un scalpel, retirez la membrane de l’insert.
    4. Placez la membrane sur une lame, les cellules vers le haut.
    5. Ajoutez 10 μL de support de montage avec DAPI à chaque membrane, puis placez les lamelles de recouvrement.
    6. Plaques de recouvrement avec du papier d’aluminium.
    7. Incuber les plaques à température ambiante pendant 30 min, puis les conserver à -20 °C
  18. Pour analyser la migration cellulaire, comptez le nombre de cellules par champ (pas moins de 10 champs) à l’aide d’un microscope à fluorescence à une longueur d’onde d’excitation laser de 405 nm.

5. Test d’adhésion et évaluation de la polymérisation de l’actine par immunofluorescence

REMARQUE : Pour ce test, utilisez des plaques de 24 puits avec des lamelles.

  1. Après avoir infecté les cellules pendant 4 heures, laver chaque puits 3 fois avec une solution saline stérile à température ambiante pour éliminer tous les parasites non internalisés.
  2. Centrifuger la plaque à 300 x g pendant 10 min sous 4°C. Ajouter 500 μL de paraformaldéhyde à 4 % dans chaque puits pendant 15 min.
  3. Retirer le paraformaldéhyde et ajouter 1 mL de solution saline.
  4. Préparez les solutions comme décrit dans le tableau 1.
Solutions primairesComposé chimiqueDiluant
Solution de chlorure d’ammonium0,134 g de NH4Cl50 ml de PBS 1X
Saponine 15 %150 mg de saponine1 mL de PBS 1X
Albumine sérique bovine (ABS) 10 %1 g d’ABS10 mL de PBS 1X
Solutions secondairesVolet 1Volet 2Volet 3
Saponine 0,15 %1mL de saponine 15 %100 mL de PBS 1X-
PBS 1X / ABS 3 % / Saponine 0,15 %13,8 mL de PBS 1X6 mL d’ABS 10 %200 μL de saponine 15 %
PBS1X / ABS 0,3 % / Saponine 0,15 % :19,2 mL de PBS 1X0,6 mL d’ABS 10 %200 μL de saponine 15 %
PBS 1X / ABS 1 % / Saponine 0,15 %17,8 mL de PBS 1X2 mL d’ABS 10 %200 μL de saponine 15 %

Tableau 1 : Recettes de tampon.

  1. Immunomarquage
    REMARQUE : Les étapes suivantes doivent être effectuées sous agitation.
    1. Lavez les lamelles 3 fois avec 1x PBS pendant 5 min.
    2. Ajouter 500 μL de solution de chlorure d’ammonium par puits pendant 10 min.
    3. Lavez les lamelles 3 fois avec 1x PBS pendant 5 min.
    4. Perméabiliser la membrane avec de la saponine 0,15 % pendant 15 min.
    5. Incuber les cellules avec la solution bloquante (PBS 1x / ABS 3 % / Saponine 0,15 %) pendant 1 h.
    6. Laver les lamelles 3 fois avec PBS 1x/Saponin 0,15 % pendant 5 min.
    7. Anticorps primaires dilués dans PBS 1x /ABS 1 % /Saponine 0,15 % comme : Anti-FAK de lapin (pTyr397) : dilution 1:500, Anti-paxiline de lapin (pTyr118) : dilution de 1:100. Anti-Rac1 souris : dilution 1:100. Anti-CDC42 pour lapin : dilution 1:200. Anti-RhoA pour lapin : dilution 1:200.
    8. Incuber des cellules avec des anticorps primaires dilués dans du PBS 1x/ABS 1 % /Saponine 0,15 % pendant 1 h.
      REMARQUE : FAK et Paxillin sont des molécules clés impliquées dans la formation des complexes d’adhésion 13,14,15. La famille des GTPases Rho est responsable de l’organisation du cytosquelette d’actine. RAC1 et Cdc42, situés sur le bord avant de la cellule, contrôlent la formation de lamellipodes et de filopodes, respectivement ; RhoA est situé à l’arrière de la cellule et est impliqué dans la contraction du cytosquelette15, 23, 24, 25.
    9. Lavez les lamelles 3 fois avec 1x PBS/Saponin 0,15 % pendant 5 min.
    10. Diluer l’anticorps secondaire ou la phalloïdine comme suit : IgG anti-lapin, Alexa Fluor 568 : dilution 1:500 ; IgG anti-souris, Alexa Fluor 488 : dilution 1:500 ; IgG anti-souris, Alexa Fluor 594 : dilution 1:500 ; Phalloïdine Alexa Fluor 488 : dilution 1:1200.
    11. Incuber des cellules avec un anticorps secondaire ou de la phalloïdine diluée dans 1x PBS/ABS 0,3 %, Saponine 0,15 % pendant 45 min.
      REMARQUE : L’incubation de l’anticorps secondaire ou de la phalloïdine doit être effectuée en l’absence de lumière. Couvrez les plaques avec du papier d’aluminium pour les protéger de la lumière lors des étapes suivantes.
    12. Lavez les lamelles 3 fois avec 1x PBS pendant 5 min.
    13. Retirez les lamelles des puits.
    14. En l’absence de lumière, ajoutez 10 μL de support de montage avec DAPI sur des lames de verre microscopiques propres.
    15. Placez les lamelles avec les cellules vers le bas pour permettre le contact entre les cellules et la solution DAPI.
      REMARQUE : Couvrez les diapositives avec du papier d’aluminium pour les protéger de la lumière.
    16. Incuber 30 min à température ambiante.
    17. Conserver à -20 °C.

6. Microscopie confocale, acquisition d’images et quantification à l’aide de FIJI

REMARQUE : Pour acquérir/capturer des images d’immunofluorescence, utilisez un microscope confocal à balayage laser. L’objectif 63x à immersion dans l’huile est recommandé pour une résolution optimale.

  1. Laissez les lamelles atteindre la température ambiante, à l’abri de la lumière, pendant au moins 30 minutes avant l’acquisition de l’image.
  2. Nettoyez les lamelles avec un chiffon absorbant.
  3. Ajoutez une goutte d’huile d’immersion dans l’objectif et placez chaque lame sous le microscope.
  4. Déplacez l’objectif jusqu’à ce que l’huile touche la glissière.
  5. Observer et régler la mise au point du microscope ; Sélectionnez l’objectif 63x avec de l’huile.
  6. Allumez les lasers aux longueurs d’onde de 488 nm, 552 nm et 405 nm .
  7. Sélectionnez la résolution de l’image : 1024 x 1024.
  8. Cliquez sur le bouton En direct, définissez la pile Z et appuyez sur Commencer. Répétez le processus, puis appuyez sur Fin.
  9. Après avoir sélectionné l’option Projection maximale dans le menu Outil , attendez que l’image soit acquise.
  10. Enregistrez l’expérience.
  11. Exportez des images au format .lif sur un ordinateur. Utilisez le logiciel d’analyse d’images open source FIJI pour analyser les images.
  12. Sélectionnez les images à analyser et sélectionnez Dupliquer l’image.
  13. Pour avoir l’image en niveaux de gris, sélectionnez Image | Ajuster | Seuil de couleur. Sélectionnez 0 et 255 (saturation).
  14. Sélectionnez la méthode de seuil : Par défaut.
  15. Sélectionnez la couleur du seuil : B et W (noir et blanc).
  16. Ne sélectionnez pas Fond sombre.
  17. Sélectionner : Traiter | Binaire | Options puis sélectionnez les données pertinentes à mesurer : Surface, Min, Max, valeur de gris, densité d’intégration.
  18. Sélectionnez l’outil mains libres dans la barre d’outils Fidji et tracez soigneusement chaque cellule manuellement.
  19. Dans le menu Analyser , sélectionnez Définir les mesures. Assurez-vous que l’intensité intégrée à la zone et la valeur moyenne de gris sont sélectionnées. Répétez ce processus pour chaque cellule.
  20. Sélectionnez toutes les données dans la fenêtre Résultats, puis copiez-collez-les dans un fichier de feuille de calcul.
  21. Calculez la fluorescence totale corrigée des cellules (CTCF) : CTCF (Densité intégrée = Aire de la cellule sélectionnée x Fluorescence moyenne des lectures de fond).
  22. Ouvrez le fichier contenant les données à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique pour effectuer une analyse statistique.

7. Analyse statistique

  1. Ouvrez un nouveau projet lorsqu’une boîte de dialogue de bienvenue s’affiche.
  2. Choisissez le type de graphique et de support avec SD.
  3. Appliquez les valeurs obtenues à partir des résultats expérimentaux au tableau.
  4. Sélectionnez Statistiques descriptives et choisissez l’option Colonne Statistiques [tous les tests] pour analyser la distribution des données.
  5. Si les données suivent une distribution gaussienne, choisissez le test t pour analyser les échantillons en comparant deux paires. Si la distribution n’est pas gaussienne, analysez les données à l’aide du test de Mann-Whitney.
  6. Choisissez l’option de graphique la mieux adaptée pour une représentation optimale des données.

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Résultats

Ce protocole décrit ici permet d’évaluer la migration cellulaire et ses mécanismes associés, tels que la dynamique de l’actine et l’adhésion, fournissant ainsi un outil pour déterminer la migration des cellules hôtes infectées par Leishmania au sein de l’hôte vertébré. Les résultats présentés ici démontrent que cet essai in vitro fournit des indications rapides et cohérentes des changements dans l’adhésion cellulaire, la migration et la dynami...

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Discussion

La méthode décrite ici pour évaluer la migration cellulaire à l’aide du système d’inserts membranaires de culture cellulaire permet aux chercheurs d’étudier la réponse migratoire des cellules dans un environnement bidimensionnel. Dans cette technique, certaines étapes sont considérées comme critiques. Tout d’abord, la différenciation des CD humaines et de l’infection par Leishmania est déterminante puisque le taux d’infection dépend du donneur. L’utili...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation de soutien à la recherche de Bahia (Fapesb), numéro de subvention 9092/2015. Les auteurs remercient le CNPq, le Capes et la Fapesb pour leur soutien financier via des bourses. Les auteurs tiennent à remercier Andris K. Walter pour l’analyse critique, la révision de la langue anglaise et l’aide à la révision des manuscrits.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
16 Gauge needleDescarpack353101
24 well cell culture plateJET-BIOFILJ011024
25 Gauge needleDescarpack353601
Albumin from bovine serumSigma AldrichA2153-100G
Ammonium chlorideSigma AldrichA-0171
Anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488InvitrogenA32723
Anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594InvitrogenA11032
Anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 568InvitrogenA11011
CD14 MicroBeadsMACS Myltenyi Biotec130-050-201
Cell Culture Flask 25cm2SPL70125
CellstripperCorning25-056-CI
Confocal microscopeLeicaTCS SP8
Coverslip circles 13mmPerfecta10210013CE
Dissecting ForcepsVWR82027-406
EDTASigma AldrichE6758
Falcon tubeKASVIK19-0051
Fetal Bovine Serumgibco16000044
Fluorescence microscopeOlympus BX51
Glass slide  25,4x76,2mmPerfecta200
Hemin bovineSigma AldrichH2250
HemocytometerPerfecta7302HD
Histopaque® 1077Sigma Aldrich10771
MACS bufferMACS Myltenyi Biotec130-091-221
Minimum Essential MediumGibco41090093
Mouse anti-Rac1BD610650
ParaformaldehydeSigma Aldrich158127
Phalloidin Alexa Fluor 488InvitrogenA12379
Phosphate Buffered SalineThermoFisherAM9624
Polycarbonate Membrane Transwell Inserts - Pore size 5.0 µmCorning3421
ProLong Gold DAPI kitInvitrogenP36931
Rabbit anti-Cdc42InvitrogenPA1-092X
Rabbit anti-FAK (pTyr397)InvitrogenRC222574
Rabbit anti-paxilin (pTyr118)InvitrogenQF221230
Rabbit anti-RhoAInvitrogenOSR00266W
Recombinant Human CCL3R&D Systems270-LD-010
Recombinant Human GM-CSFPeproTech300-03
Recombinant Human IL-4PeproTech200-04
Recombinant Human M-CSFPeproTech300-25
RPMI 1640 MediumGibco21870076
SaponinSigma Aldrich47036 – 50G – F
Syringe 3 mLDescarpack324201
Trypan BlueGibco15250061

Références

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