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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
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  • Einleitung
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  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier untersuchen wir die Auswirkungen der Leishmania-Wirt-Interaktion, indem wir die Migration von Leishmania-infizierten dendritischen Zellen untersuchen. Die Differenzierung und Infektion dendritischer Zellen, die Migrationsanalyse und die Bewertung von Adhäsionskomplexen und Aktindynamiken werden beschrieben. Diese Methode kann auf andere Studien zur Migration von Wirtszellen angewendet werden, wenn sie mit Leishmanien oder anderen intrazellulären Parasitenarten infiziert sind.

Zusammenfassung

Leishmaniose ist ein intrazellulärer Protozoenparasit, der ein breites Spektrum klinischer Manifestationen verursacht, das von selbstauflösenden lokalisierten Hautläsionen bis hin zu einer hochgradig tödlichen viszeralen Form der Krankheit reicht. Schätzungsweise 12 Millionen Menschen weltweit sind derzeit infiziert, weitere 350 Millionen sind einem Infektionsrisiko ausgesetzt. Es ist bekannt, dass Wirtszellen, die mit Leishmania-Parasiten infiziert sind, wie Makrophagen oder dendritische Zellen, in verschiedene Wirtsgewebe wandern können, aber wie die Migration zur Ausbreitung und zum Homing von Parasiten beiträgt, ist noch wenig verstanden. Daher wird die Bewertung der Fähigkeit dieser Parasiten, die Reaktion, Adhäsion und Migration von Wirtszellen zu modulieren, Aufschluss über die Mechanismen geben, die an der Ausbreitung und Viszeralisierung von Krankheiten beteiligt sind. Die zelluläre Migration ist ein komplexer Prozess, bei dem Zellen polarisiert und protrusiert werden, wodurch sie wandern können. Dieser Prozess, der durch die Aktin- und Tubulin-basierte Mikrotubuli-Dynamik reguliert wird, beinhaltet verschiedene Faktoren, einschließlich der Modulation der zellulären Adhäsion an das Substrat. Zelluläre Adhäsions- und Migrationsprozesse wurden mit Hilfe mehrerer Modelle untersucht. Hier beschreiben wir eine Methode, um die Migrationsaspekte von Wirtszellen während einer Leishmania-Infektion zu charakterisieren. Dieses detaillierte Protokoll stellt die Differenzierung und Infektion dendritischer Zellen, die Analyse der Motilität und Migration von Wirtszellen sowie die Bildung von Adhäsionskomplexen und der Aktindynamik dar. Dieses In-vitro-Protokoll zielt darauf ab, die Mechanismen, die an der Verbreitung von Leishmanien in Wirtsgeweben von Wirbeltieren beteiligt sind, weiter aufzuklären und kann auch modifiziert und auf andere Zellmigrationsstudien angewendet werden.

Einleitung

Leishmaniose, eine vernachlässigte Tropenkrankheit, die durch Protozoenparasiten der Gattung Leishmania verursacht wird, führt zu einem breiten Spektrum klinischer Manifestationen, das von selbstheilenden lokalisierten Hautläsionen bis hin zu tödlichen viszeralen Formen der Krankheit reicht. Es wird geschätzt, dass jährlich bis zu einer Million neue Leishmaniose-Fälle auftreten, wobei weltweit derzeit 12 Millionen Menschen infiziert sind1. Die viszerale Leishmaniose (VL), die unbehandelt in über 95 % der Fälle tödlich verlaufen kann, verursacht jährlich mehr als 50.000 Todesfälle, von denen Millionen in Südamerika, Ostafrika, Südasien und im Mittelmeerraum betroffensind 2. Der wichtigste ätiologische Erreger von VL in der Neuen Welt, Leishmania infantum, wird von infizierten weiblichen Sandmücken während der Blutfütterung auf den Menschen übertragen3. Diese Parasiten werden von Fresszellen, z.B. Makrophagen und dendritischen Zellen, erkannt und internalisiert 3,4,5. In diesen Zellen differenzieren sich Parasiten in ihre intrazellulären Formen, die als Amastigoten bekannt sind, die sich dann vermehren und über das Lymphsystem und den Blutkreislauf zu verschiedenen Wirtsgeweben transportiert werden 6,7. Die Mechanismen, durch die Leishmania-Parasiten im Wirt von Wirbeltieren verbreitet werden, sowie die Rolle, die die Migration der Wirtszellen dabei spielt, sind jedoch unklar.

Die Zellmigration ist ein komplexer Prozess, der von allen kernhaltigen Zellen, einschließlich der Leukozyten, ausgeführtwird 8. Nach dem klassischen Kreislaufmodell der Zellmigration umfasst dieser Prozess mehrere integrierte molekulare Ereignisse, die sich in fünf Schritte unterteilen lassen: Vorsprung der Vorderkante; Haftung der Eintrittskante an Matrixkontakten; Kontraktion des zellulären Zytoplasmas; Lösen der hinteren Kante der Zelle von den Kontaktstellen; und das Recycling von Membranrezeptoren von der Rückseite zur Vorderseite der Zelle9.

Damit eine Zellmigration stattfinden kann, müssen Protrusionen gebildet und dann durch Anheftung an die extrazelluläre Matrix stabilisiert werden. Unter den verschiedenen Rezeptortypen, die an der Förderung der Zellmigration beteiligt sind, sind Integrine bemerkenswert. Die Aktivierung von Integrin führt zu migrationsbedingten Signalwegen; Die intrazelluläre Signalübertragung erfolgt dann über die fokale Adhäsionskinase (FAK) und die Kinasen der Src-Familie sowie über Talin-, Vinculin- und Paxillin-Molecues 10,11,12. Die Phosphorylierung von Paxillin durch aktivierte Kinasen, einschließlich FAK, führt zur Rekrutierung von Effektormolekülen, die externe Signale weiterleiten, die die Zellmigration auslösen. Es wurde gezeigt, dass Paxillin ein intrazelluläres Molekül ist, das für die Zelladhäsion, die Aktinpolymerisation und die Zellmigrationsprozesse entscheidend ist 13,14,15.

Das Aktin-Zytoskelett spielt eine zentrale Rolle bei der Polarisation und Migration von Fresszellen16. Während des Zellmigrationsprozesses werden die durch die Aktinpolymerisation gebildeten Vorsprünge durch die Zelladhäsion an der extrazellulären Matrix stabilisiert. Dieser Prozess kann durch Integrinrezeptoren moduliert werden, die mit dem Aktin-Zytoskelett assoziiert sind 17,18,19. Mehrere Aktin-bindende Proteine regulieren die Geschwindigkeit und Organisation der Aktinpolymerisation in zellulären Vorsprüngen20. Studien haben gezeigt, dass RhoA, Rac und Cdc42 die Aktinreorganisation nach der Stimulation adhärenter Zellen durch extrazelluläre Faktoren regulieren21,22. Während der Migration befinden sich Rac1 und Cdc42 an der Vorderkante der Zelle und steuern die Ausdehnung von Lamellipodien bzw. Filopodien, während RhoA, das sich an der Rückseite der Zelle befindet, die Kontraktion des Aktomyosin-Zytoskelettsreguliert 15,23,24,25.

Studien haben gezeigt, dass eine Leishmaniose-Infektion die Funktionen der Wirtszellen moduliert, wie z. B. die Adhäsion an das zelluläre Substrat und die Migration 26,27,28,29,30,31. Unreife DCs befinden sich in peripheren Geweben; Bei Interaktion mit PAMPS werden diese Zellen aktiviert und wandern zu den drainierenden Lymphknoten, was zu einer Antigenpräsentation bei T-Zellen führt. Eine frühere Studie mit einem Mausmodell zeigte, dass eine Infektion mit L. amazonensis eine Verringerung der Migration von DCs zu drainierenden Lymphknoten provoziert29. Es konnte auch gezeigt werden, dass die Hemmung des Adhäsionsprozesses die DC-Migration nach einer Infektion mit L. major30 reduzierte. Nichtsdestotrotz sind die Auswirkungen der DC-Migration auf die Parasitenverbreitung im Wirt sowie die Mechanismen, die an diesem Prozess beteiligt sind, nach wie vor wenig verstanden.

Hier stellen wir ein zusammengestelltes Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Durchführung eines in vitro Adhäsions- und Migrationsassays mit menschlichen DCs vor, die mit Leishmaniose infiziert sind. Diese Methode umfasst nicht nur die Differenzierung und Infektion von DCs, sondern ermöglicht auch die Analyse der Motilität und Migration von Wirtszellen, der Bildung von Adhäsionskomplexen sowie der Aktindynamik. Das derzeit beschriebene In-vitro-Protokoll ermöglicht es den Forschern, die Mechanismen der Ausbreitung von Leishmanien in Wirtsgeweben von Wirbeltieren weiter zu untersuchen und kann auch manipuliert und auf andere Zellmigrationsstudien angewendet werden.

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Protokoll

Die hier beschriebenen Verfahren wurden vom Institutionellen Überprüfungsausschuss des Instituts Gonçalo Moniz (IGM-FIOCRUZ, Protokoll Nr. 2.751.345) genehmigt. Blutproben wurden von gesunden freiwilligen Spendern entnommen. Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Grundsätzen für Tierversuche durchgeführt, die durch das brasilianische Gesetz 11.784/2008 verabschiedet und von der Ethikkommission für Tierversuche des Instituts Gonçalo Moniz (IGM-FIOCRUZ, Protokoll Nr. 014/2019) genehmigt und lizenziert wurden.

1. Isolierung und Differenzierung humaner dendritischer Zellen

  1. Pipettieren Sie 10 mL des Dichtegradientenmediums in 50 mL Zentrifugenröhrchen.
  2. Beschriften Sie die 50-ml-Röhrchen entsprechend der Probe des jeweiligen Spenders.
  3. Entnehmen Sie ~ 50 ml venöses Blut von gesunden Spendern und befolgen Sie nach der Entnahme die unten beschriebenen Verfahren im Durchflussschrank.
  4. Füllen Sie das gesammelte Blut vorsichtig in Zentrifugenröhrchen und verdünnen Sie es in Kochsalzlösung (0,9 % Natriumchlorid) im Verhältnis 1:1 bei Raumtemperatur.
  5. Überlagern Sie das verdünnte Blut langsam auf der Oberseite des Dichtegradientenmediums.
  6. Zentrifugenröhrchen mit dem Blut- und Dichtegradientenmedium bei 400 x g für 30 min bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Schalten Sie die Bremse vor dem Zentrifugieren aus, um eine Vermischung von Gradientenschichten zu verhindern. Nach der 1. Zentrifugation die Zentrifugentemperatur auf 4 °C senken.
  7. Nehmen Sie die Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge.
  8. Identifizieren Sie den Ring der mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) in der Probe (Buffy Coat); Entfernen Sie vorsichtig mit einer Pipette das restliche Plasma.
    HINWEIS: Nach der Zentrifugation haben sich die folgenden Gradientenschichten gebildet: Erythrozyten, Dichtegradientenmedium, PBMC-Ring und Plasma. Der PBMC-Ring befindet sich zwischen dem Dichtegradientenmedium und den Plasmaschichten.
  9. Übertragen Sie die wolkenartige PBMC-Schicht auf ein neues Röhrchen und erhöhen Sie das Volumen mit Kochsalzlösung auf 30 mL.
  10. Die Röhrchen mit der Zellsuspension bei 250 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 1 ml Kochsalzlösung.
  11. Sammeln Sie ein Aliquot für die Zellzählung mit der Trypanblau-Ausschlussmethode. Zuerst im Verhältnis 1:1.000 verdünnen. Verwenden Sie dann 10 μl der verdünnten Zellen für die Trypanblau-Färbung und zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer-Kammer, um die Zellviabilität zu bestimmen.
  12. Erneut bei 200 x g für 10 min unter 4 °C zentrifugieren.
  13. Suspendieren Sie das Pellet wieder in MACS-Puffer. Verwenden Sie 80 μl des Puffers pro 1 x 107 Zellen.
    HINWEIS: Zusammensetzung des MACS-Puffers: Bereiten Sie eine Lösung vor, die phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), einen pH-Wert von 7,2, 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA enthält. Verdünnen Sie die Pufferlösung im Verhältnis 1:20 mit der Spüllösung. Den Puffer kalt halten und bei 2-8 °C lagern.
  14. CD14-Mikrokügelchen zu der in Schritt 1.13 hergestellten Zellsuspension geben. Verwenden Sie 20 μl CD14-Mikrokügelchen pro 1 x 107 Zellen.
    HINWEIS: CD14-Mikrokügelchen werden für die positive Selektion menschlicher Monozyten aus PBMCs verwendet, da Kügelchen an CD14-positive Zellen binden, die auf den meisten Monozyten exprimiert werden.
  15. Homogenisieren Sie die Lösung, die das Pellet und die Mikrokügelchen enthält, mit einer Pipette. 15 Minuten auf Eis halten.
  16. Die Suspension wird bei 300 x g für 10 min unter 4 °C zentrifugiert.
  17. Resuspendieren Sie Zellen im MACS-Puffer. Verwenden Sie 1-2 mL für 1 x 107 Zellen in der Zell-Mikrokügelchen-Mischung.
  18. Die Suspension wird bei 300 x g für 10 min unter 4 °C zentrifugiert.
  19. Der Überstand wird aspiriert und das Pellet in 500 μl MACS-Puffer resuspendiert.
    HINWEIS: Dies ist das maximale Volumen der Zellsuspension, das durch eine Spalte verarbeitet werden kann.
  20. Montieren Sie die Magnetsäule.
  21. Waschen Sie die Säule einmal, indem Sie 500 μl MACS-Puffer hinzufügen. Lassen Sie den Puffer unter der Schwerkraft durch die Säule fließen.
    HINWEIS: Lassen Sie die Säule nicht trocknen, da eindringende Luft die Säule verstopfen kann.
  22. Geben Sie 500 μl der Zellprobenlösung aus Schritt 1.19 pro Säule hinzu. Lassen Sie die Zellprobenlösung unter Schwerkraft durch die Säule fließen.
  23. Waschen Sie die Säule durch Zugabe von 500 μl MACS-Puffer (2x). Fügen Sie den frischen Puffer nur hinzu, wenn das Säulenreservoir leer ist. Vermeiden Sie das Austrocknen.
  24. Pipettieren Sie 1 mL des MACS-Puffers auf die Säule und legen Sie ihn in ein neues Röhrchen darunter. Spülen Sie die magnetisch markierten Zellen sofort aus, indem Sie den Kolben fest in die Säule drücken.
  25. Zentrifugieren Sie die CD14-angereicherten Zellen bei 300 x g für 10 min unter 4 °C.
  26. Zählen Sie Zellen mit einer Neubauer-Kammer.
  27. Resuspendieren Sie Zellen in 1 ml vollständigem RPMI mit Interleukin-4 (IL-4) (100 μl/ml) + Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) (50 ng/ml).
    HINWEIS: GM-CSF ist ein Zytokin, das von Makrophagen, T-Zellen, Mastzellen, natürlichen Killerzellen, Endothelzellen und Fibroblasten sezerniert wird und die Differenzierung und Proliferation myeloischer Vorläuferzellen im Knochenmark induziert. GM-CSF und IL-4 werden verwendet, um die Differenzierung dendritischer Zellen zu induzieren32.
  28. Seed-Zellen in einer 24-Well-Platte mit einer Konzentration von 2 × 105 Zellen pro Well in 500 μl vollständigem RPMI-Medium, das die Zellen enthält, und inkubieren die Zellen 7 Tage lang im Zellkultur-Inkubator bei 37 °C.

2. Anbau von Leishmania infantum

HINWEIS: In diesem Test werden Leishmania infantum (MCAN/BR/89/BA262)-Parasiten verwendet. Hamster wurden intravenös mit 20 μl der Lösung infiziert, die 1 x 106 L. infantum promastigotes in steriler Kochsalzlösung enthielt. Nach 1 bis 2 Monaten wurden die Tiere eingeschläfert und die amastigoten Formen der Leishmania aus ihrer Milz gewonnen und zu Promastigoten differenziert33.

  1. Züchten Sie L . infantum promastigotes, die aus zuvor infizierter Hamstermilz isoliert wurden, in einem geneigten 25cm 2-Zell-Kulturkolben, der 3 ml Novy-Nicolle-MacNeal-Medium (NNN) und 5 ml supplementiertes Minimum Essential Medium (MEM) enthält.
    HINWEIS: In diesem Assay wurde MEM-Medium mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 24,5 nM Hämin-Rind ergänzt.
  2. Inkubieren Sie 7 Tage lang bei 24 °C im BSB-Inkubator (Bio-Oxygen Demand).
  3. 100 μl Promastigotenkultur in einen neuen 25 cm 2-Zell-Kulturkolben pipettieren, der 5 ml supplementiertes MEM-Medium enthält.
  4. Die Promastigotenkultur wird bei 24 °C im BSB-Inkubator inkubiert, bis die Promastigoten die stationäre Phase erreichen. Periodische Zählung von kultivierten Promastigoten durch Übertragung eines Aliquots der in Kochsalzlösung verdünnten Parasitensuspension in eine Neubauer-Kammer (d. h. ein Hämozytometer), um die stationäre Wachstumsphase zu bestimmen.
    HINWEIS: Es wird nicht empfohlen, Parasiten aus der ersten Passage nach der Kultivierung in NNN-Medium zu verwenden, um Restspuren von Kaninchenblut zu vermeiden.
  5. 1 x 105 der stationären Wachstumsphasenkultur von L. infantum promastigotes werden in einen neuen 25cm 2-Zell-Kulturkolben überführt und 5 ml MEM-supplementiertes Medium zugegeben.
  6. Überwachen Sie das Wachstum der Kultur regelmäßig für ca. 7 Tage mit einer Neubauer-Kammer, bis die stationäre Phase erreicht ist. Die Parasiten sind nun bereit für den Einsatz in experimentellen Infektionsverfahren.
    HINWEIS: Promastigoten-Kulturen gelten als infektionierbar für bis zu 7 Passagen in vitro ; zusätzliche Passagen können zu einem Virulenzverlust führen.

3. Infektion mit dendritischen Zellen beim Menschen

  1. In einem biologischen Laminar-Flow-Schrank wird der gesamte Inhalt aus dem Parasitenkulturkolben in 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt.
  2. Fügen Sie kalte Kochsalzlösung zu einem Endvolumen von 40 ml hinzu.
  3. Zentrifugieren Sie bei 1.600 xg für 10 min unter 4 °C.
  4. Entsorgen Sie den Überstand nach der Zentrifugation und suspendieren Sie das Pellet in 1 ml kalter Kochsalzlösung (wiederholen Sie die Schritte 3.3-3.4 dreimal).
  5. Nachdem Sie die Zellen gewaschen haben, um nicht lebensfähige Parasiten zu entfernen, resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml kalter Kochsalzlösung.
  6. Geben Sie den Inhalt 5 Mal langsam mit einer 16 G Nadel durch eine 1 mL Spritze, um die Parasitencluster zu trennen.
  7. Entfernen Sie ein Aliquot, um die Parasitenkonzentration in einem Hämozytometer zu bestimmen (berechnen Sie die mittlere Anzahl von Parasiten in 4 Quadranten x Verdünnungsfaktor x 104).
  8. Waschen Sie dendritische Zellen, indem Sie 1 mL Kochsalzlösung hinzufügen und die Zellen bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren (3 Mal).
  9. Berechnen Sie die Menge an L. infantum, die für die experimentelle Infektion erforderlich ist; Verhältnis: 20 Parasiten pro Zelle.
  10. Geben Sie das erforderliche Volumen L . infantum in jede Vertiefung der Zellkulturplatten.
  11. Dendritische Zellen mit Parasiten werden 4 h lang in einem Inkubator bei 37 °C unter 5 % CO2 inkubiert.
  12. Nach Schritt 3.11 die Platten bei 300 x g für 10 min unter 4 °C zentrifugieren.

4. Migrationsassay mit Zellkultureinsätzen

  1. Waschen Sie dendritische Zellen (infiziert oder nicht) nach der Infektion 3 Mal mit 1 ml Kochsalzlösung bei Raumtemperatur, um nicht internalisierte Parasiten zu entfernen. Nach jedem Waschen die Platten bei 300 x g für 10 min unter 4 °C zentrifugieren.
  2. Sobald nicht internalisierte Parasiten entfernt sind, lösen Sie die Zellen, indem Sie 200 μl des Zelldissoziationsreagenzes in jede Vertiefung geben und 15 Minuten lang inkubieren. Bewahren Sie die Zellen in einem Inkubator bei 37 °C unter 5 % CO2 auf.
  3. Homogenisieren Sie die Zellen mit einer 1.000-μl-Pipettenspitze, damit sich die Zellen lösen können.
  4. Übertragen Sie die dissoziierten Zellen in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
  5. Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 10 min unter 4 °C.
  6. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml RPMI-Medium, das mit 10 % FBS ergänzt wird.
  7. Führen Sie den Inhalt jedes Röhrchens 5 Mal langsam durch eine 1-ml-Spritze mit einer 25-g-Nadel, um die Zellen zu trennen.
  8. Ein Aliquot entfernen, mit Trypanblau verdünnen, um die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer zu bestimmen (Mittelwert lebensfähiger Zellen in 4 Quadranten × Verdünnungsfaktor × 104).
  9. Vorbereitung von Zellkultur-Mikroplatteneinsätzen:
    HINWEIS: Zellkultureinsätze (5,0 μM Poren-Polycarbonat-Membran) werden für Migrationsassays mit dendritischen Zellen, Makrophagen und Monozyten empfohlen, da diese Einsätze es den Phagozyten ermöglichen, die Membranen zu passieren.
    1. Die Einsätze mit einer sterilen Pinzette entfernen und in leere Vertiefungen legen.
    2. Geben Sie 600 μl RPMI-Medium, ergänzt mit 10 % FBS, in jede Vertiefung; Fügen Sie den Chemolockstoff Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 3 (CCL3) hinzu (1 μl pro 1 ml Medium).
      HINWEIS: CCL3 ist ein Chemokin, das die DC-Migrationreguliert 34.
    3. Platzieren Sie die Einsätze mit einer sterilen Pinzette in Vertiefungen, die das Medium enthalten.
  10. Geben Sie 2 x 105 dendritische Zellen (infiziert oder nicht) in 100 μl Medium zu jedem Einsatz.
  11. 4 Stunden inkubieren, damit die Zellen wandern können.
  12. Nehmen Sie nach 4 h die Platte heraus und saugen Sie das Medium an. 100 μl 4%iges Paraformaldehyd zugeben und 15 min inkubieren.
  13. Entfernen Sie Paraformaldehyd und fügen Sie 100 μl Kochsalzlösung hinzu.
    HINWEIS: Die Platten können für eine spätere Montage bei 4 °C gehalten werden.
  14. Sammeln Sie den Überstand aus Einsätzen oder aus Vertiefungen, um nicht migrierende Zellen bzw. solche, die die Membran durchquert haben, zu zählen. Mit Paraformaldehyd 4% 15 min inkubieren.
  15. Konzentrieren Sie die Zellen mit einer Zytozentrifugationstechnik35.
  16. Geben Sie 10 μl des Einbettmediums mit DAPI auf die Membranen und legen Sie Deckgläser über die Vertiefungen.
  17. Montage der Einlegebahn.
    HINWEIS: Dieser Schritt kann außerhalb der Biosicherheitswerkbänke durchgeführt werden.
    1. Entfernen Sie die Einlegemembranen aus den Vertiefungen.
    2. Kratzen Sie die Oberfläche des Einsatzes mit einem Tupfer ab, um alle Zellen zu entfernen, die nicht migriert sind.
    3. Entfernen Sie mit einem Skalpell die Membran vom Einsatz.
    4. Lege die Membran mit den Zellen nach oben auf einen Objektträger.
    5. Geben Sie 10 μl Eindeckmedium mit DAPI auf jede Membran und platzieren Sie dann Overlay-Deckgläser.
    6. Abdeckplatten mit Alufolie.
    7. Platten 30 min bei Raumtemperatur inkubieren, dann bei -20 °C lagern
  18. Um die Zellmigration zu analysieren, zählen Sie die Anzahl der Zellen pro Feld (nicht weniger als 10 Felder) mit einem Fluoreszenzmikroskop bei einer Laseranregungswellenlänge von 405 nm.

5. Adhäsionsassay und Bewertung der Aktinpolymerisation durch Immunfluoreszenz

HINWEIS: Verwenden Sie für diesen Assay 24-Well-Platten mit Deckgläsern.

  1. Nachdem Sie die Zellen 4 Stunden lang infiziert haben, waschen Sie jede Vertiefung 3 Mal mit steriler Kochsalzlösung bei Raumtemperatur, um nicht internalisierte Parasiten zu entfernen.
  2. Die Platte bei 300 x g für 10 min unter 4°C zentrifugieren. Geben Sie 500 μl 4% Paraformaldehyd für 15 Minuten in jede Vertiefung.
  3. Entfernen Sie Paraformaldehyd und fügen Sie 1 ml Kochsalzlösung hinzu.
  4. Bereiten Sie Lösungen vor, wie in Tabelle 1 beschrieben.
Primäre LösungenChemische VerbindungVerdünnungsmittel
Ammoniumchlorid-Lösung0,134 g NH4Cl50 ml PBS 1X
Saponin 15%150 mg Saponin1 mL von PBS 1X
Albumin aus Rinderserum (ABS) 10%1 g ABS10 mL PBS 1X
Sekundäre LösungenKomponente 1Komponente 2Komponente 3
Saponin 0,15%1 ml Saponin 15%100 mL PBS 1X-
PBS 1X / ABS 3% / Saponin 0,15%13,8 mL PBS 1X6 mL ABS 10%200 μl Saponin 15%
PBS1X / ABS 0,3% / Saponin 0,15%:19,2 mL PBS 1X0,6 mL ABS 10%200 μl Saponin 15%
PBS 1X / ABS 1% / Saponin 0,15%17,8 mL PBS 1X2 mL ABS 10%200 μl Saponin 15%

Tabelle 1: Puffer-Rezepte.

  1. Immunfärbung
    HINWEIS: Die folgenden Schritte müssen unter Rühren durchgeführt werden.
    1. Deckgläser 3 mal mit 1x PBS für 5 min waschen.
    2. Geben Sie 10 Minuten lang 500 μl Ammoniumchloridlösung pro Vertiefung hinzu.
    3. Deckgläser 3 mal mit 1x PBS für 5 min waschen.
    4. Permeabilisieren Sie die Membran mit Saponin 0,15% für 15 min.
    5. Inkubieren Sie die Zellen mit der Blockierungslösung (PBS 1x / ABS 3% / Saponin 0,15%) für 1 h.
    6. Deckgläser 3 x mit PBS 1x/Saponin 0,15% für 5 min waschen.
    7. Verdünnen Sie Primärantikörper in PBS 1x /ABS 1 % /Saponin 0,15 % als: Kaninchen-Anti-FAK (pTyr397): 1:500 Verdünnung, Kaninchen-Anti-Paxilin (pTyr118): 1:100 Verdünnung. Maus Anti-Rac1: Verdünnung 1:100. Kaninchen Anti-CDC42: Verdünnung 1:200. Kaninchen Anti-RhoA: 1:200 Verdünnung.
    8. Inkubieren Sie Zellen mit Primärantikörpern, verdünnt in PBS 1x/ABS 1 % /Saponin 0,15 % für 1 h.
      HINWEIS: FAK und Paxillin sind Schlüsselmoleküle, die an der Bildung von Adhäsionskomplexen beteiligt sind 13,14,15. Die Rho-GTPase-Familie ist für die Organisation des Aktin-Zytoskeletts verantwortlich. RAC1 und Cdc42, die sich am vorderen Rand der Zelle befinden, kontrollieren die Bildung von Lamellipodien bzw. Filopodien; RhoA befindet sich im hinteren Teil der Zelle und ist an der Kontraktion des Zytoskeletts beteiligt15, 23,24,25.
    9. Deckgläser 3 x mit 1x PBS/Saponin 0,15% für 5 min waschen.
    10. Verdünnen Sie den Sekundärantikörper oder das Phalloidin wie folgt: Anti-Kaninchen-IgG, Alexa Fluor 568: Verdünnung 1:500; Anti-Maus-IgG, Alexa Fluor 488: Verdünnung 1:500; Anti-Maus-IgG, Alexa Fluor 594: Verdünnung 1:500; Phalloidin Alexa Fluor 488: Verdünnung 1:1200.
    11. Inkubieren Sie Zellen mit Sekundärantikörper oder Phalloidin, verdünnt in 1x PBS/ABS, 0,3%, Saponin, 0,15%, für 45 min.
      HINWEIS: Die Inkubation des Sekundärantikörpers oder Phalloidins sollte unter Ausschluss von Licht durchgeführt werden. Abdeckplatten mit Alufolie zum Schutz vor Licht bei den folgenden Schritten.
    12. Deckgläser 3 mal mit 1x PBS für 5 min waschen.
    13. Entfernen Sie Deckgläser von Vertiefungen.
    14. Wenn kein Licht vorhanden ist, geben Sie 10 μl Einbettmedium mit DAPI auf saubere mikroskopisch kleine Objektträger.
    15. Platzieren Sie Deckgläser mit den Zellen nach unten, um den Kontakt zwischen den Zellen und der DAPI-Lösung zu ermöglichen.
      HINWEIS: Decken Sie die Objektträger zum Schutz vor Licht mit Alufolie ab.
    16. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    17. Bei -20 °C lagern.

6. Konfokale Mikroskopie, Bildaufnahme und Quantifizierung mit FIJI

HINWEIS: Um Immunfluoreszenzbilder zu erfassen/aufzunehmen, verwenden Sie ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop. Für eine optimale Auflösung wird ein 63-fach-Ölimmersionsobjektiv empfohlen.

  1. Lassen Sie Deckgläser vor der Bildaufnahme mindestens 30 Minuten lang lichtgeschützt Raumtemperatur erreichen.
  2. Reinigen Sie die Deckgläser mit einem saugfähigen Tuch.
  3. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das Objektiv und legen Sie jeden Objektträger unter das Mikroskop.
  4. Bewegen Sie das Objektiv, bis das Öl den Objektträger berührt.
  5. Beobachten und stellen Sie den Mikroskopfokus ein. Wählen Sie das 63x Objektiv mit Öl.
  6. Schalten Sie Laser mit Wellenlängen von 488 nm, 552 nm und 405 nm ein.
  7. Wählen Sie die Bildauflösung: 1024 x 1024.
  8. Klicken Sie auf die Schaltfläche Live , stellen Sie den Z-Stack ein und drücken Sie Begin. Wiederholen Sie den Vorgang und drücken Sie dann auf Ende.
  9. Nachdem Sie die Option Maximale Projektion im Werkzeugmenü ausgewählt haben, warten Sie, bis das Bild aufgenommen wurde.
  10. Speichern Sie das Experiment.
  11. Exportieren Sie Bilder im .lif-Format auf einem Computer. Verwenden Sie die Open-Source-Bildanalysesoftware von FIJI, um Bilder zu analysieren.
  12. Wählen Sie die zu analysierenden Bilder aus und wählen Sie Bild duplizieren.
  13. Um das Bild in Graustufen zu erhalten, wählen Sie Bild | Anpassen | Farb-Schwellenwert. Wählen Sie 0 und 255 (Sättigung) aus.
  14. Wählen Sie die Schwellenwertmethode aus: Standard.
  15. Wählen Sie die Schwellenwertfarbe: B und W (Schwarzweiß).
  16. Wählen Sie nicht Dunkler Hintergrund aus.
  17. Wählen Sie: Prozess | Binär | Optionen und wählen Sie dann die relevanten Daten aus, die gemessen werden sollen: Fläche, Min, Max, Grauwert, Dichte integrieren.
  18. Wählen Sie das Werkzeug "Freie Hände" in der Fidschi-Symbolleiste aus und zeichnen Sie jede Zelle manuell sorgfältig nach.
  19. Wählen Sie im Menü Analysieren die Option Messungen festlegen aus. Stellen Sie sicher, dass die Intensität des integrierten Bereichs und der mittlere Grauwert ausgewählt sind. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Zelle.
  20. Wählen Sie alle Daten im Ergebnisfenster aus, kopieren Sie sie und fügen Sie sie in eine Tabellenkalkulationsdatei ein.
  21. Berechnen Sie die korrigierte Gesamtzellfluoreszenz (CTCF): CTCF (Integrierte Dichte = Fläche der ausgewählten Zelle x Mittlere Fluoreszenz der Hintergrundmesswerte).
  22. Öffnen Sie die Datei mit den Daten mithilfe einer Statistikanalysesoftware, um eine statistische Analyse durchzuführen.

7. Statistische Auswertung

  1. Öffnen Sie ein neues Projekt , wenn ein Willkommensdialogfeld angezeigt wird.
  2. Wählen Sie den Typ des Diagramms und des Mediums mit SD aus.
  3. Wenden Sie die aus den Versuchsergebnissen erhaltenen Werte auf die Tabelle an.
  4. Wählen Sie Deskriptive Statistik und wählen Sie die Optionsspalte Statistik [alle Tests], um die Datenverteilung zu analysieren.
  5. Wenn die Daten einer Gaußschen Verteilung folgen, wählen Sie den t-Test aus, um Stichproben durch den Vergleich zweier Paare zu analysieren. Wenn die Verteilung nicht Gauß ist, analysieren Sie die Daten mit dem Mann-Whitney-Test.
  6. Wählen Sie die beste Diagrammoption für eine optimale Datendarstellung.

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Ergebnisse

Dieses hierin beschriebene Protokoll ermöglicht die Bewertung der Zellmigration und ihrer damit verbundenen Mechanismen, wie z. B. Aktindynamik und Adhäsion, und stellt dadurch ein Werkzeug zur Verfügung, um die Migration von Leishmania-infizierten Wirtszellen innerhalb des Wirbeltierwirts zu bestimmen. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass dieser in vitro Assay schnelle und konsistente Hinweise auf Veränderungen der zellulären Adhäsion, Migration und Akt...

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Diskussion

Die hier beschriebene Methode zur Bewertung der Zellmigration mit dem Zellkulturmembran-Inserts-System ermöglicht es den Forschern, die Migrationsreaktion von Zellen in einer zweidimensionalen Umgebung zu untersuchen. Bei dieser Technik werden einige Schritte als kritisch angesehen. Zum einen ist die Unterscheidung zwischen humanen DCs und einer Infektion mit Leishmanien entscheidend, da die Infektionsrate spenderabhängig ist. Die Verwendung von mehr als einem Spender pro Vers...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von der Bahia Research Support Foundation (Fapesb), Fördernummer 9092/2015. Die Autoren danken CNPq, Capes und Fapesb für die finanzielle Unterstützung durch Stipendien. Die Autoren danken Andris K. Walter für die kritische Analyse, die Überarbeitung der englischen Sprache und die Unterstützung beim Lektorat des Manuskripts.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
16 Gauge needleDescarpack353101
24 well cell culture plateJET-BIOFILJ011024
25 Gauge needleDescarpack353601
Albumin from bovine serumSigma AldrichA2153-100G
Ammonium chlorideSigma AldrichA-0171
Anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488InvitrogenA32723
Anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594InvitrogenA11032
Anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 568InvitrogenA11011
CD14 MicroBeadsMACS Myltenyi Biotec130-050-201
Cell Culture Flask 25cm2SPL70125
CellstripperCorning25-056-CI
Confocal microscopeLeicaTCS SP8
Coverslip circles 13mmPerfecta10210013CE
Dissecting ForcepsVWR82027-406
EDTASigma AldrichE6758
Falcon tubeKASVIK19-0051
Fetal Bovine Serumgibco16000044
Fluorescence microscopeOlympus BX51
Glass slide  25,4x76,2mmPerfecta200
Hemin bovineSigma AldrichH2250
HemocytometerPerfecta7302HD
Histopaque® 1077Sigma Aldrich10771
MACS bufferMACS Myltenyi Biotec130-091-221
Minimum Essential MediumGibco41090093
Mouse anti-Rac1BD610650
ParaformaldehydeSigma Aldrich158127
Phalloidin Alexa Fluor 488InvitrogenA12379
Phosphate Buffered SalineThermoFisherAM9624
Polycarbonate Membrane Transwell Inserts - Pore size 5.0 µmCorning3421
ProLong Gold DAPI kitInvitrogenP36931
Rabbit anti-Cdc42InvitrogenPA1-092X
Rabbit anti-FAK (pTyr397)InvitrogenRC222574
Rabbit anti-paxilin (pTyr118)InvitrogenQF221230
Rabbit anti-RhoAInvitrogenOSR00266W
Recombinant Human CCL3R&D Systems270-LD-010
Recombinant Human GM-CSFPeproTech300-03
Recombinant Human IL-4PeproTech200-04
Recombinant Human M-CSFPeproTech300-25
RPMI 1640 MediumGibco21870076
SaponinSigma Aldrich47036 – 50G – F
Syringe 3 mLDescarpack324201
Trypan BlueGibco15250061

Referenzen

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