5-乙炔基-2'-脱氧尿苷/磷酸-组蛋白H3双标记方案用于 果蝇 神经干细胞的细胞周期进展分析

摘要

使用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）和磷酸化组蛋白H3（pH3）标记进行细胞周期分析是一个多步骤程序，可能需要广泛的优化。在这里，我们提出了一个详细的方案，描述了该过程的所有步骤，包括图像分析和定量，以区分不同细胞周期阶段的细胞。

摘要

体内 细胞周期进展分析通常在调节有丝分裂和DNA复制的基因研究中进行。5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）已被用于研究复制性/S相进展，而针对磷酸组蛋白H3的抗体已被用于标记有丝分裂细胞核和细胞。两种标签的组合将能够对G0 / G1（间隙期），S（复制性）和M（有丝分裂）相进行分类，并作为评估有丝分裂基因敲低或零突变体对细胞周期进展的影响的重要工具。然而，用于标记EdU标记细胞的试剂与几种二抗荧光标记不相容。这使得免疫染色复杂化，其中原代和标记的二抗用于标记pH3阳性有丝分裂细胞。本文描述了 果蝇 幼虫神经干细胞中EdU和pH3双重标记的分步方案，该系统被广泛用于研究有丝分裂因子。此外，还提供了用于图像分析和定量的方案，以分配3个不同类别的标记细胞，G0 / G1，S，S，S>G2 / M（从S到G2 / M的进展）和M相。

引言

细胞分裂周期包括G1期（第一间隙期），复制期/S期，G2期（第二间隙期）和M期（有丝分裂期）。通过这些阶段，细胞经历细胞转录，翻译和细胞骨架机制^1，2的重组发生巨大变化。作为对发育和环境线索的反应，细胞可能暂时停止分裂并变得静止（G0）或分化并永久停止分裂^3。其他情况，如DNA损伤，可能导致过早分化或凋亡^3，4。对这些线索的反应由细胞周期检查点介导，其充当监视系统，以确保细胞进入分裂周期⁵的下一阶段之前基本细胞过程的完整性。因此，对调节DNA复制，检查点和有丝分裂机制的基因的研究需要分析突变细胞中或siRNA敲低这些基因时可能发生的细胞周期进展缺陷。此外，这种分析可用于测试整体细胞健康以及细胞对药物治疗的反应。

5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）是一种胸腺嘧啶类似物，在复制过程中掺入DNA^6。该方法被广泛用于鉴定S期细胞。然而，然后将细胞进行苛刻的DNA变性程序，以允许通过使用抗BrdU抗体^6来检测BrdU。这种苛刻的处理可能会损害细胞表位，并阻止通过免疫染色进一步表征样品。EdU掺入和随后通过铜催化的"咔哒反应"与小的，可渗透的，荧光标记的叠氮化物染料进行检测，消除了对苛刻变性程序的需要^7。因此，这种方法成为BrdU合并的更实用的替代方案。

此外，pH3已被描述为有丝分裂/M相细胞⁸的可靠标志物。组蛋白H3是一种DNA相关的核心组蛋白，在G2期晚期至M期早期左右磷酸化，并在^8期末期脱磷酸化。几种商业抗体可用于使用标准免疫染色方案检测pH3。因此，EdU和pH3的双重染色将能够检测S相和M相的细胞。此外，G1和早期G2期的细胞不会对任何一种标志物进行阳性染色。

果蝇 神经干细胞或神经母细胞（NBs）提供了一种表征良好的干细胞模型，其中细胞不对称地分裂以产生一个相同的自我更新NB和一个神经节母细胞（GMC），其注定要分化^9。此外，几种遗传工具和NB特异性抗体使该系统适用于遗传操作和活细胞成像。因此，一些研究利用NB来研究调节不对称分裂和细胞命运决定的基因^9。在幼虫脑的中央脑（CB）和视叶（OL）中存在不同的NB种群⁹;CB NB用于本研究。这些三龄幼虫CB NBs是大细胞，也适用于研究调节有丝分裂纺锤体组装的因素。分析细胞周期进展缺陷的方案将是此类研究的重要工具。

先前发布的实验方案采用商业试剂盒，如Click-iT EdU Alexa Fluor Cell增殖试剂盒，其提供几种反应组分和用各种Alexa Fluor染料标记的叠氮化物染料，用于EdU掺入和检测^10。然而，与此类试剂盒一起提供的试剂与通常与二抗一起使用的一些荧光标签不相容。该EdU检测试剂盒（Click-iT EdU Alexa Fluor细胞增殖试剂盒，随Alexa Fluor 647偶联叠氮化物染料一起提供）在 果蝇 三龄幼虫NB中进行了测试，并尝试使用针对pH3和Miranda（一种NB标记物）的抗体进行共染色。此外，Alexa Fluor 568或Cy3标记的二抗用于检测NB¹¹质膜上的Miranda标记。然而，在EdU检测后进行免疫染色时，这些二抗未观察到预期的信号强度和染色模式（未发表的结果）。

对于EdU掺入，Daul及其同事描述的方案需要用与EdU和溴酚蓝（BPB）混合的Kankel-White培养基喂养幼虫^10。幼虫以EdU和BPB刺激的食物为食，在幼虫肠道中摄入时可以通过其蓝色看到。虽然这种方法被用于将EdU掺入 Mms19 功能丧失（Mms19^P）三龄幼虫中，但 Mms19^P 幼虫显然没有进食，因为在幼虫肠道中几乎没有检测到任何蓝色（未发表的结果）。 Mms19^P 幼虫表现出剧烈的发育畸形，最终在第三龄期停滞。这可能会以某种方式影响三龄幼虫的摄食行为，并使EdU喂养方案不适合这种情况。

在研究了现有文献并广泛研究了基本步骤的标准化之后，提出了一种替代方法，用于果蝇NB中的EdU / pH3双标记，这不需要将EdU喂养到幼虫。之前的一项研究采用双EdU / pH3染色来分析NB中的细胞周期，但没有提供详细的方案^4。这为尝试实现此方法的实验室带来了不必要的障碍。此外，评估各种试剂与EdU试剂盒的相容性并进行进一步优化可能是一个耗时的过程。本文提出了一个分步方案，涵盖了在解剖的幼虫脑中掺入EdU和用抗pH3抗体进行免疫染色，然后进行共聚焦显微镜和图像分析，将NB分配到四个不同的类别:G0 / G1期，S期，S>G2 / M（从S到G2 / M的进展）和M期。概述了需要优化的步骤，并提供了有关大型数据集的图像分析的提示。此外，还分析了野生型NB中的EdU / pH3读数，并将其与Mms19^P NBs进行了比较，Mms19 P NB最近报道显示细胞周期延迟¹¹。

研究方案

1. 用于即点式EdU测定的试剂和储备的制备

注:有关试剂盒和试剂盒随附试剂盒的详细信息，请参阅材料表和表1。

1. 在准备溶液之前，将小瓶置于室温。
2. 通过加入2mL二甲基亚砜（DMSO，组分C）来制备10mM EdU（组分A）储备溶液。充分混合并储存在-20°C。
3. 通过加入70μLDMSO（组分C）制备Alexa Fluor 647-叠氮化物（组分B）的工作溶液。充分混合并储存在-20°C。
4. 通过将4mL该溶液与36mL去离子水混合来制备1x Click-iT EdU反应缓冲液（组分D）溶液。将剩余的溶液储存在2-6°C。
5. 通过加入2 mL去离子水，制作10倍的Click-iT EdU缓冲液添加剂（组分F）的储备（200mg / mL）。充分混合并储存在-20°C。
6. 将Hoechst 33342（组分G）储存在2-6°C。 将DMSO（组分C）储存在-20°C的干燥器中。
   注意:应使用手套来处理DMSO和Hoechst。

2. 三龄幼虫脑的解剖及EdU掺入

注意:脑部解剖方案在前面已经描述过了¹².在开始解剖之前，请确保按照2.6和3.1中所述准备并解冻足够量的EdU和PFA溶液。

1. 通过加入25.6克Na 2 HPO 4 .7H_20，80克NaCl，2克KCl和2克KH₂PO4至1升去离子水，制备10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）。将pH值调节至7.4，随后在去离子水中制备1x溶液。
2. 将施耐德解剖介质（SM）加入玻璃（3或9）凹陷玻璃点板的两个连续凹陷中。将 1 倍 PBS 添加到下一个连续的抑郁中。
3. 使用一对镊子，挑选游荡的三龄幼虫，并放在用PBS润湿的纸巾上，以清除苍蝇的食物残留物。将幼虫置于PBS的抑郁症中，然后与SM一起置于连续的抑郁症中。
4. 使用一对细镊子，去除幼虫下半身的3/4。
   1. 用一对镊子轻轻抓住幼虫嘴钩，并用另一对镊子将角质层固定在另一端。
   2. 通过将嘴钩向内推并同时剥离另一端的组织，将幼虫头从内向外翻转。
5. 观察附着假想盘的幼虫大脑。去除附着在大脑上的其他组织，并将大脑转移到下一个连续的SM抑郁症。
6. 解冻10 mM EdU储备溶液。通过将10mM储备液稀释在SM中来制备100μM溶液。
7. 将100μL这种100μM EdU + SM溶液加入Pyrex板上的另一个凹陷中。在100μL的100μM EdU + SM溶液中孵育〜5-10个解剖的大脑，在25°C下孵育2小时。
   注意:由于NB在〜2小时内分裂一次，该协议旨在分析一个完整的细胞周期。只使用完整的大脑进行进一步的步骤。丢弃在解剖过程中受损的大脑。

3. 固定和免疫染色

1. 在通风橱中制备4%多聚甲醛（PFA）溶液。
   1. 将4g多聚甲醛粉末加入80mL的1x PBS中，放入放置在磁力搅拌器上的烧杯中，并加热至60°C。 要溶解PFA，加入几滴1 N NaOH。检查pH值，如果需要，用几滴1 M HCl调节至7.0。
   2. 使用 1 倍 PBS 将音量调节至 100 mL。等分PFA溶液并在2-6°C下储存长达1个月。在PFA溶液中加入0.3%的非离子洗涤剂（见 材料表），以有效固定大型组织，如幼虫脑。
2. EdU掺入后，将大脑转移到含有4%PFA的0.6mL微量离心管中。在螺母器上室温孵育15分钟。轻拍实验室工作台上的管子，使大脑在管子的底部稳定下来。
3. 取出PFA，在室温下用PBS + 0.3%非离子洗涤剂（PBST）洗涤3次。确保每次洗涤在螺母上持续至少10分钟。最后一次洗涤后，除去PBST，加入封闭溶液（PBST + 5%牛血清白蛋白），并在室温下孵育30分钟。
4. 将抗米兰达抗体（1:250）和抗pH3抗体（1:200）稀释在PBST中（两种抗体在同一管中）。除去封闭缓冲液，加入一抗溶液。在螺母上在2-6°C孵育过夜。
   注意:Miranda是CB NBs上的膜蛋白。它用于识别CB区域¹³中的这些大圆形细胞。
5. 取出一抗溶液，用PBST洗涤3次。确保每次洗涤在室温下在螺母上持续10分钟。
6. 通过在PBST中加入1:500稀释的Alexa Fluor 488抗兔和Alexa Fluor 568抗大鼠来制备二抗溶液。取出PBST，并将二抗溶液加入解剖的大脑中。在黑暗中在2-6°C下在螺母上孵育过夜，并用PBST洗涤3次（步骤3.5）。

4. EdU 检测、DNA 染色和安装

1. 要制备EdU检测鸡尾酒，请将组分（见 表2）混合在1.5 mL管中。
2. 在最后一次洗涤（步骤3.6）后，取出PBST，并将EdU检测鸡尾酒添加到解剖的大脑中。在室温下在黑暗中在螺母上孵育30分钟。在黑暗中用PBST洗涤2次，每次10分钟。
3. 对于DNA染色，将Hoechst 33342（组分G）1:2，000稀释在PBST中，以制备5μg/ mL溶液。
4. 第二次洗涤后除去PBST（步骤4.2），并向解剖的大脑中加入500μL5μg/ mL Hoechst溶液。在黑暗中孵育10分钟，取出Hoechst，用PBST清洗一次，每次10分钟。
5. 将管子敲到实验室工作台上，让大脑安定下来。从试管中取出PBST，但只留下50-100μL。
6. 切下200μL微量移液器尖端的末端，并小心地将大脑转移到干净的载玻片上。通过用滤纸条印迹从载玻片中取出多余的PBST。小心不要让滤纸接触到大脑。
7. 将一滴水溶性、非荧光的安装介质滴到大脑上，并调整大脑方向，使腹侧神经索面向载玻片，叶朝上。将大脑排列在单个文件中，以便更容易地连续成像大脑。
8. 轻轻地将盖玻片放在大脑的顶部。将载玻片置于2-6°C过夜。
   注意:安装介质在过夜储存后会变硬，因此无需用指甲油密封盖玻片。

5. 成像

注:有关本方案中使用的激光扫描显微镜和油浸物镜的详细信息，请参见 材料表 。

1. 从 采集 软件中，选择 63x 物镜。
2. 在安装的大脑正上方的盖玻片上滴一滴浸没油，以便更容易通过目镜定位组织。
3. 使用DAPI/Hoechst 33342通道，通过目镜找到大脑，然后在软件中切换到 采集模式 。
4. 设置 4 个通道来对 Hoechst 33342 （DNA）、Alexa Fluor 488 （pH3）、Alexa Fluor 568 （Miranda） 和 Alexa Fluor 647 （EdU） 进行成像。使用 染料助手 工具，该工具可自动为所选染料设置激发激光器和发射滤光片。
5. 设置视野，使其包含整个脑叶。通过获取间隔为0.8μm的z-stack来成像脑叶的整个体积。以 *.lif 库 格式存储映像会话中的所有图像。

6. 图像分析

注意:以下步骤描述了对采集图像的分析，以及如何使用ImageJ软件将细胞分为G0 / G1相，S>G2 / M（从S到G2 / M的进展）和M相。

1. 从以下 URL 下载斐济（斐济是 ImageJ）:https://fiji.sc/。打开斐济，然后将.lif文件拖放到斐济。
   注意:斐济是ImageJ的一个版本，预装了几个插件¹⁴。将.lif文件传输到斐济将打开Bio-formats插件，这是处理.lif文件所必需的。生物格式插件也需要打开从其他一些显微镜品牌生成的图像文件，例如，从尼康显微镜生成的nd2文件。此插件预装了斐济。
2. 从堆栈查看选项卡中选择数据浏览器，然后从 bio-formats 插件的内存管理选项卡中使用虚拟堆栈。
   注意:具有 8-10 个大脑的 z 堆栈的 Lif 文件的大小通常为 300-400 MB。在 RAM 较低的计算机上，打开一些此类文件会迅速耗尽 ImageJ 上的可用 RAM，并阻止任何进一步的图像处理。虚拟堆栈是"只读"的，不需要高RAM进行处理，是将大型数据集加载到斐济的理想选择。
3. 观察 ImageJ 中显示的多通道图像。使用图像|颜色 |通道工具从菜单栏中更改通道的颜色。观察米兰达标记的NB作为CB区域中的大圆形细胞。
4. 在每个 NB 上使用 椭圆 工具绘制感兴趣区域 （ROI），以避免将 NB 计数两次。
   1. 从ImageJ 菜单栏中，选择"分析|工具|投资回报率经理.标记当前 z 截面中的所有 NB，并在标记每个单元格后按t。
5. 一旦标记了当前z截面中的所有NB，将通道更改为pH3和EdU，并手动计数EdU阳性NB，pH3阳性NB的数量，EdU和pH3染色阳性的NB的数量，以及NB未对两种标记物染色。
6. 在随后的 z 部分中搜索 NB，删除旧的 ROI，并添加新的 ROI 以计算不同堆栈中的 NB。
7. 准备一个以下列的电子表格: 1.EdU-pH3-:此部分代表处于细胞周期G0 / G1阶段的双阴性细胞;2. EdU+:该类别中的细胞已经掺入了EdU，并且正在经历DNA复制（S期）;3. EdU+ pH3+:这些双阳性细胞已完成S期，并已进展到G2或M期;4. pH3+:这些NB正在经历有丝分裂。
8. 计算每个波瓣在上述所有4个类别中存在的NB的百分比。使用电子表格软件准备条形图，显示每个类别中NB百分比的池化数据。

结果

双叶 果蝇 第三龄幼虫脑已被用作研究基本细胞和发育过程的模型系统^9。当前研究的重点是提出一种方案，用于分析CB区域EdU和pH3标记NB的细胞周期进展（图1）。CB NB细分为I型和II型，它们显示出特征性的不对称分割模式^9。每个I型NB分区都会生成一个能够自我更新的NB，以及另一个注定用于分化⁹的GMC。相比之下，II...

讨论

与先前使用的BrdU方法相比，EdU掺入及其随后与细胞渗透性叠氮化物的"咔哒"反应提供了该技术的实际优势⁷。然而，该反应是由Cu（I）离子催化的，并且几种染料在该铜催化剂的存在下可能不稳定，正如Click-it EdU试剂盒制造商明确建议的那样。在执行EdU检测步骤后进行免疫染色实验时，使用红色通道染料Alexa Fluor 568和Cy3未观察到预期的信号强度。然而，当免疫染色反应在EdU检测步...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
fly stocks
P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)	Bloomington stock center	#15477	P-element insertion in the third exon of Mms19
+; Mms19::eGFP, Mms19p	Generated in house		eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background
w1118	Bloomington stock center	#3605	wild-type stock (w;+;+)
Primary antibodies			Dilution
Rat anti-Miranda	Abcam	Ab197788	1/250
Rabbit anti-pH3	Cell Signaling	9701	1/200
Secondary antibodies
Goat anti-Rat Cy3	Jackson Immuno	112-165-167	1/150
Goat anti-Rat Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11077	1/500
Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A27034	1/500
Reagent/Kit
Aqua Poly/Mount mounting medium	Polysciences Inc	18606-20
Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647	Thermo Fischer Scientific	C10340
Schneider’s Drosophila medium	Thermo Fischer Scientific	21720-024
Bovine serum albumin (BSA) fraction V	Merck	10735078001
Triton X-100	Fischer Scientific	9002-93-1	non-ionic detergent
Software
Fiji (Imagej)	https://imagej.net/Fiji
Leica Application Suite (LAS X)	Leica microsystems
PRISM	Graph pad software	Version 5
Microsoft Excel	Microsoft office	2016
Equipment
Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective
Materials
Aqua Poly/Mount mounting medium			water-soluble, non-fluorescing mounting medium
Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate
Whatman filter paper