JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ניתוח מחזור התא עם תיוג 5-אתניל-2'-deoxyuridine (EdU) ו פוספו-histone H3 (pH3) הוא הליך רב-שלבי שעשוי לדרוש אופטימיזציה נרחבת. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המתאר את כל השלבים עבור הליך זה כולל ניתוח תמונה וכימות כדי להבחין בין תאים בשלבי מחזור תאים שונים.

Abstract

In vivo ניתוח התקדמות מחזור התא מבוצע באופן שגרתי במחקרים על גנים המסדירים מיטוזה ושכפול DNA. 5-אתניל-2'-deoxyuridine (EdU) נוצל כדי לחקור התקדמות שכפול/ S-פאזה, בעוד נוגדנים נגד פוספו-histone H3 נוצלו כדי לסמן גרעינים מיוטיים ותאים. שילוב של שתי התוויות יאפשר סיווג של של שלב G0/G1 (שלב פער), S (שכפול) ו- M (מיטוטי) וישמש ככלי חשוב להערכת ההשפעות של נוקאאוטים גנטיים מיוטיים או מוטציות ריקות על התקדמות מחזור התא. עם זאת, ריאגנטים המשמשים לסימון תאים המסומנים על-ידי EdU אינם תואמים למספר תגי נוגדנים-פלואורסצנטיים משניים. זה מסבך חיסונים, שבו נוגדנים משניים ראשוניים ומתויגים משמשים לסימון תאי מיטוט חיוביים pH3. מאמר זה מתאר פרוטוקול שלב אחר שלב לתיוג כפול של EdU ו- pH3 בתאי גזע עצביים זחל Drosophila, מערכת בשימוש נרחב כדי לחקור גורמים מיוטיים. בנוסף, פרוטוקול מסופק לניתוח וכימות תמונה כדי להקצות תאים מסומנים ב-3 קטגוריות נפרדות, של שלבים G0/G1, S, S>G2/M (התקדמות מ- S ל- G2/M) ושלבי M.

Introduction

מחזור חלוקת התאים כולל שלב G1 (שלב הפער הראשון), שלב שכפול/S, G2 (שלב פער שני) ושלב M (מיטוטי). עובר בשלבים אלה, התא עובר שינויים דרמטיים תמלול הסלולר, תרגום, וארגון מחדש של מכונות שלד1,2. בתגובה לרמזים התפתחותיים וסביבתיים, תאים עשויים להפסיק באופן זמני להתחלק ולהיות ססגוניים (G0) או להבדיל ולהפסיק לצמיתות לחלק3. תרחישים אחרים, כגון נזק לדנ"א, עלולים לגרום לבידול מוקדם או אפופטוזיס3,4. התגובה לרמזים כאלה מתווכת על ידי מחסומי מחזור סלולריים, הפועלים כמערכת מעקב כדי להבטיח את שלמותם של תהליכים סלולריים חיוניים לפני שהתא מתחייב לשלב הבא של מחזור החלוקה5. לכן, מחקרים על גנים המסדירים שכפול DNA, מחסומים ומכונות מיטוטיות צריכים לנתח פגמים אפשריים בהתקדמות מחזור התא שעלולים להתרחש בתאים מוטנטיים או על פירוק siRNA של גנים אלה. בנוסף, ניתוחים כאלה עשויים להיות מועסקים כדי לבדוק את בריאות התא הכוללת, כמו גם תגובות תאיות לטיפול תרופתי.

5-ברומו-2'-דאוקסיאורידין (BrdU) הוא אנלוגי תימידין המשולב ב- DNA במהלךשכפול 6. שיטה זו שימשה בהרחבה לזיהוי תאים ב- S-phase. עם זאת, התאים נתונים לאחר מכן להליכי דנ"א קשים כדי לאפשר זיהוי של BrdU באמצעות נוגדנים נגד BrdU6. טיפול קשה זה עלול לפגוע באפיטופים הסלולר ולמנוע אפיון נוסף של המדגם באמצעות חיסונים. שילוב EdU וזיהוי לאחר מכן על ידי נחושת מזורז, "תגובת קליק" עם קטן, תא חדיר, צבעי אזיד מתויגים באופן פלואורסצנטי מבטל את הצורך בהליכי דנטורציה קשים7. שיטה זו, אם כן, התגלתה כחלופה מעשית יותר לתאגדות BrdU.

יתר על כן, pH3 תואר כסמן אמין עבור mitotic / M פאזה תאים8. Histone H3 הוא חלבון היסטון ליבה הקשור לדנ"א שהופך לזרחן בסביבות שלב ה- G2 המאוחר לשלב M המוקדם והוא דה-זרחן לקראת סוף אנאפאזה8. מספר נוגדנים מסחריים ניתן להשתמש כדי לזהות pH3 באמצעות פרוטוקולים חיסוניים סטנדרטיים. מכתים כפול של EdU ו- pH3 יאפשר אפוא זיהוי של תאים ב- S-phase כמו גם M-phase. בנוסף, תאים בשלב G1 ו- G2 מוקדם לא יכתימו באופן חיובי עבור אף אחד מהסמנים.

תאי גזע עצביים Drosophila או neuroblasts (NBs) מציעים מודל תאי גזע מאופיין היטב שבו תאים מתחלקים באופן אסימטרי כדי לייצר NB אחד זהה מתחדש עצמי ותא אם גנגליון (GMC), אשר נגזר על בידול9. בנוסף, מספר כלים גנטיים ונוגדנים ספציפיים ל- NB הופכים את המערכת הזו למתאים למניפולציה גנטית והדמיה של תאים חיים. כתוצאה מכך, מספר מחקרים השתמשו NBs כדי לחקור גנים המסדירים חטיבות אסימטריות וקביעת גורל התא9. אוכלוסיות נפרדות של NBs קיימות במוח המרכזי (CB) ובאונה האופטית (OL) של המוח הזחלי9; CB NBs שימשו למחקר הנוכחי. אלה NBs CB זחל השלישי הם תאים גדולים המתאימים גם לחקר גורמים המסדירים את הרכבת ציר מיטוטי. פרוטוקול לניתוח פגמים התקדמות מחזור התא יהיה כלי חיוני במחקרים כאלה.

פרוטוקולים שפורסמו קודם לכן השתמשו בערכות מסחריות, כגון Click-iT EdU Alexa Fluor Cell התפשטות ערכה, המספקים מספר רכיבי תגובה וצבעי אזיד מתויגים עם מגוון של צבעי Alexa Fluor עבור שילוב וזיהויEdU 10. עם זאת, ריאגנטים המסופקים עם ערכות כאלה אינם תואמים כמה תגי פלורסנט המשמשים לעתים קרובות עם נוגדנים משניים. ערכת זיהוי EdU זו (ערכת התפשטות תאי EdU של Click-iT Alexa Fluor שסופקה עם אלכסה פלור 647-מצומד צבע אזיד) נבדקה ב- Drosophila שלישי זחל זחל NBs, וכתמים שותפים נוסה עם נוגדנים נגד pH3 ומירנדה, סמן עבור NBs. יתר על כן, אלכסה פלור 568- או Cy3 מתויג נוגדנים משניים שימשו לגילוי של מירנדה תיוג על קרום הפלזמה של NBs11. עם זאת, עוצמת האות הצפויה ודפוס הכתמים (תוצאות שלא פורסמו) לא נצפו עם נוגדנים משניים אלה כאשר חיסון בוצע לאחר זיהוי EdU.

עבור שילוב EdU, הפרוטוקול המתואר על ידי דאול ועמיתיו נדרש האכלה של הזחלים עם בינוני קנקל-לבן מעורבב עם EdU ו ברומופנול כחול (BPB)10. הזחלים ניזונים ממזון EdU ו- BPB, אשר ניתן לראות על ידי צבעו הכחול על בליעה במעיים הזחל. למרות שיטה זו שימשה לשילוב EdU ב Mms19 אובדן פונקציה (Mms19P)זחלי instar השלישי, זחלי Mms19P כנראה לא להאכיל כמו כמעט כל צבע כחול זוהה במעיים זחל (תוצאות שלא פורסמו). זחלי Mms19P מראים עיוותים התפתחותיים דרסטיים ובסופו של דבר נעצרים בשלב האינסטאר השלישי. זה עשוי איכשהו להשפיע על התנהגות ההזנה של זחלי instar השלישי ולהפוך את פרוטוקול האכלת EdU לא מתאים במקרים כאלה.

לאחר שלמד את הספרות הזמינה ועבד בהרחבה על התקינה של צעדים חיוניים, הוצעה גישה חלופית עבור EdU / pH3 תיוג כפול ב- Drosophila NBs, אשר אינו דורש האכלת EdU לזחלים. מחקר קודם השתמש כפול EdU / pH3 כתמים כדי לנתח את מחזור התא ב NBs, אבל לא הציג פרוטוקול מפורט4. זה מהווה משוכה מיותרת למעבדות המנסות ליישם שיטה זו. יתר על כן, הערכת התאימות של ריאגנטים שונים עם ערכת EdU וביצוע אופטימיזציה נוספת יכול להיות תהליך גוזל זמן. מאמר זה מציג פרוטוקול שלב אחר שלב המכסה שילוב EdU במוחות זחלים ניתחו וחיסון עם נוגדנים נגד pH3, ואחריו מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח תמונה כדי להקצות NBs לארבע קטגוריות נפרדות: שלב G0 / G1, שלב S, S>G2/M (התקדמות מ- S ל- G2/M) ושלב M. השלבים הזקוקים למיטוב מפורטים ועצות הניתנות לניתוח תמונה של ערכות נתונים גדולות. בנוסף, הקריאה EdU /pH3 ב- NBs מסוג פראי מנותחת ומושוות ל- Mms19P NBs, אשר דווחו לאחרונה כדי להראות עיכוב מחזור התא11.

Protocol

1. הכנת ריאגנטים ומלאי לבדיקת קליקים של EdU

הערה: עיין בטבלת החומרים ובטבלה 1 לקבלת פרטים אודות הערכה והריגנטים שסופקו עם הערכה.

  1. הביאו את הבקבוקונים לטמפרטורת החדר לפני הכנת הפתרונות.
  2. הכן 10 mM EdU (רכיב A) פתרון מלאי על ידי הוספת 2 מ"ל של דימתילסולפוקס (DMSO, רכיב C). מערבבים היטב ומאחסנים ב -20 מעלות צלזיוס.
  3. הכן פתרון עבודה של Alexa Fluor 647-azide (רכיב B) על ידי הוספת 70μL של DMSO (רכיב C). מערבבים היטב ומאחסנים ב -20 מעלות צלזיוס.
  4. הכן פתרון 1x של מאגר התגובה Click-iT EdU (רכיב D) על ידי ערבוב 4 מ"ל של פתרון זה עם 36 מ"ל של מים דה-יוניים. יש לאחסן את הפתרון הנותר ב-2-6 °C (6 °F).
  5. צור מלאי של 10x (200 מ"ג/מ"ל) של תוסף מאגר קליק-iT EdU (רכיב F) על-ידי הוספת 2 מ"ל של מים דה-יוניים. מערבבים היטב ומאחסנים ב -20 מעלות צלזיוס.
  6. חנות Hoechst 33342 (רכיב G) ב 2-6 °C (70 °F). אחסן את DMSO (רכיב C) במתמד ב- -20 °C (20 °F).
    הערה: יש להשתמש בכפפות כדי לטפל ב- DMSO ובהוויסט.

2. ניתוח מוחות זחלי זחלים שלישיים והתאגדות EdU

הערה: הפרוטוקול עבור ניתוחי מוח תואר בעבר12. לפני תחילת הניתוחים, ודאו שכמויות מספיקות של פתרונות EdU ו-PFA מוכנות ומופשרות כמתואר ב-2.6 וב-3.1.

  1. הכן תמיסת מלח (PBS) עם אגירת פוספט 10x על-ידי הוספת 25.6 גרם Na2HPO4.7H20, 80 גרם NaCl, 2 גרם KCl ו-2 גרם KH2PO4 ל-1 ליטר של מים דה-יוניים. התאימו את ה-pH ל-7.4, ולאחר מכן הכינו תמיסה 1x במים דה-יוניים.
  2. הוסף שניידרס ניתוח בינוני (SM) לשני שקעים רצופים של (3 או 9) צלחת ספוט זכוכית דיכאון. הוסף PBS 1x לדיכאון הבא ברציפות.
  3. בעזרת זוג מלקחיים, בחרו זחלים נודדים של כוכב שלישי והניחו על טישו רטוב עם PBS כדי לנקות שאריות מזון זבובים. מניחים את הזחל בדיכאון עם PBS ולאחר מכן בדיכאון הרצופים עם SM.
  4. בעזרת זוג מלקחיים עדינים, יש להסיר 3/4מהפלג התחתון של הזחל.
    1. תפסו בעדינות את קרסי הפה הזחלי בזוג מלקחיים אחד, והחזקו את החתך בקצה השני עם זוג המלקחיים האחרים.
    2. להפוך את ראש הזחל מבפנים החוצה על ידי דחיפה פנימה ווים הפה ובו זמנית קילוף את הרקמה בקצה השני.
  5. התבונן במוח הזחל עם דיסקים דמיוניים מחוברים. הסר רקמות אחרות המחוברות למוח, ולהעביר את המוח לדיכאון הבא ברציפות עם SM.
  6. להפשיר את פתרון מניית EdU 10 מ"מ. הכן פתרון 100 מיקרומטר על ידי דילול מלאי זה 10 mM ב- SM.
  7. הוסף 100 μL של פתרון 100 EdU + SM זה בדיכאון אחר על צלחת Pyrex. דגירה ~ 5-10 מוחות ניתחו ב 100 μL של 100 μM EdU + SM פתרון עבור 2 שעות ב 25 °C (70 °F).
    הערה: כאשר NBs מתחלקים פעם ב- ~ 2 שעות, פרוטוקול זה נועד לנתח מחזור תא מלא אחד. השתמש במוח שלם רק לצעדים נוספים. יש להשליך מוחות שניזוקו במהלך הניתוח.

3. קיבעון וחיסון

  1. הכן 4% פתרון paraformaldehyde (PFA) במכסה המנוע אדים.
    1. יש להוסיף 4 גרם אבקת פרפורמלדהיד ל-80 מל של 1x PBS בתוך המונחת על מערבל מגנטי וחום ל-60 מעלות צלזיוס. כדי להמיס PFA, להוסיף כמה טיפות של 1 N NaOH. בדוק את ה- pH, והסתגל ל- 7.0 עם כמה טיפות של 1 M HCl במידת הצורך.
    2. כוונן את עוצמת הקול ל- 100 מ"ל עם PBS 1x. Aliquot הפתרון PFA ולאחסן ב 2-6 °C (7 °F) עד חודש אחד. הוסף 0.3% חומר ניקוי לא יוני (ראה טבלת החומרים) לפתרון PFA לקיבעון יעיל של רקמות גדולות כגון המוח הזחלי.
  2. לאחר התאגדות EdU, להעביר את המוח ל 0.6 מ"ל צינורות microcentrifuge המכילים 4% PFA. דגירה בטמפרטורת החדר על מטור במשך 15 דקות. הקש על הצינור על ספסל המעבדה כך שהמוחות להתיישב בתחתית הצינור.
  3. הסר את PFA ולשטוף 3 פעמים עם PBS + 0.3% חומר ניקוי לא יוני (PBST) בטמפרטורת החדר. ודא כי כל לשטוף נמשך לפחות 10 דקות על nutator. לאחר הכביסה האחרונה, להסיר PBST, להוסיף פתרון חסימה (PBST + 5% אלבומין סרום בקר), ודגרה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. לדלל נוגדן נגד מירנדה (1:250) ונוגדן נגד pH3 (1:200) ב-PBST (שניהם נוגדנים באותו צינור). הסר את מאגר החסימה והוסף את פתרון הנוגדנים הראשי. דגירה לילה ב 2-6 °C (6 °F) על nutator.
    הערה: מירנדה היא חלבון ממברנה נוכח על CB NBs. הוא משמש לזיהוי תאים עגולים גדולים אלה באזור CB13.
  5. הסר את פתרון הנוגדנים העיקרי ושטוף 3 פעמים עם PBST. ודא כי כל לשטוף נמשך 10 דקות על nutator בטמפרטורת החדר.
  6. הכן פתרון נוגדנים משני על ידי הוספת 1:500 מדולל אלכסה פלור 488 אנטי ארנב ואלכסה פלור 568 אנטי חולדה ב PBST. הסר את PBST, והוסף את פתרון הנוגדנים המשני למוחות נותחו. לדגור לילה ב 2-6 °C (6 °F) בחושך, על nutator, ולשטוף 3 פעמים עם PBST (שלב 3.5).

4. זיהוי EdU, כתמי DNA והרכבה

  1. כדי להכין את קוקטייל הזיהוי EdU, לערבב את הרכיבים (ראה טבלה 2) בצינור 1.5 מ"ל.
  2. לאחר הכביסה האחרונה (שלב 3.6), הסירו PBST והוסיפו את קוקטייל הזיהוי של EdU למוחות נותחו. דגירה בטמפרטורת החדר בחושך במשך 30 דקות על nutator. לשטוף 2 פעמים עם PBST במשך 10 דקות כל אחד, בחושך.
  3. להכתמת DNA, לדלל Hoechst 33342 (רכיב G) 1:2,000 PBST כדי להכין פתרון 5 מיקרוגרם / mL.
  4. הסר PBST לאחר השטיפה השנייה (שלב 4.2), ולהוסיף 500 μL של 5 מיקרוגרם / mL Hoechst פתרון למוחות נותחו. לדגור בחושך במשך 10 דקות. להסיר Hoechst, ולשטוף פעם אחת עם PBST במשך 10 דקות.
  5. הקש על הצינור על ספסל המעבדה, ולתת למוח להתיישב. הסר PBST מן הצינור, אבל להשאיר מאחור רק 50-100 μL.
  6. חותכים את הקצה של קצה מיקרופיט 200 μL, ולהעביר בזהירות את המוח על שקופית זכוכית נקייה. הסר PBST עודף מהשקופית על-ידי כתמים עם רצועות נייר מסנן. תיזהר לא לתת לנייר הסינון לגעת במוח.
  7. שים טיפה של מדיום מסיס במים, לא פלואורסצנטי על המוח, וכוון את המוח כך כבל העצבים הגחוני פונה למגלשה, והאונות פונות כלפי מעלה. סדרו את המוח בקובץ אחד כך שיהיה קל יותר לדמיין את המוח באופן סדרתי.
  8. מניחים בעדינות כיסוי על גבי המוח. מניחים את השקופית ב 2-6 °C (6 °F) לילה.
    הערה: בינוני הרכבה מתקשה על אחסון לילה, כך שאין צורך לאטום את כיסוי עם לק.

5. הדמיה

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על המיקרוסקופ לסריקת הלייזר ומטרת טבילת השמן המשמשת בפרוטוקול זה.

  1. מתוך תוכנת הרכישה, בחר את המטרה 63x.
  2. שים טיפה של שמן טבילה על כיסוי ממש מעל המוח רכוב כדי להקל על איתור הרקמה דרך העין.
  3. באמצעות ערוץ DAPI / Hoechst 33342, מצא את המוח דרך העין ולאחר מכן עבור למצב הרכישה בתוכנה.
  4. הגדר 4 ערוצים כדי לדמיין Hoechst 33342 (DNA), אלכסה פלור 488 (pH3), אלכסה פלור 568 (מירנדה), ואלכסה פלור 647 (EdU). השתמש בכלי מסייע הצבע, שמגדיר באופן אוטומטי את לייזרי העירור ומסנני הפליטה עבור הצבעים שנבחרו.
  5. הגדר את שדה הראייה כך שהוא מקיף את כל אונה המוח. תמונה את כל הנפח של אונת המוח על ידי רכישת z-ערימות במרווחים 0.8 מיקרומטר זה מזה. אחסן את כל התמונות מהפעלת הדמיה בתבנית ספריה *.lif.

6. ניתוח תמונה

הערה: השלבים הבאים מתארים את הניתוח של תמונות שנרכשו וכיצד למיין תאים לשלב G0/G1, שלב S, S>G2/M (התקדמות מ- S ל- G2/M) ושלב M באמצעות תוכנת ImageJ.

  1. הורד פיג'י (פיג'י הוא ImageJ) מכתובת ה- URL הבאה: https://fiji.sc/. פתח את פיג'י ולאחר מכן גרור ושחרר את קבצי ה- .lif לתוך פיג'י.
    הערה: פיג'י היא גרסה של ImageJ שמגיע מותקן מראש עם כמה תוספים14. העברת קבצי .lif לפיג'י תפתח את תוסף Bio-formats, הדרוש לעיבוד קבצי .lif. תוסף ביו-פורמטים נדרש גם כדי לפתוח קבצי תמונה שנוצרו מכמה מותגי מיקרוסקופ אחרים, למשל, קבצים nd2 שנוצרו ממיקרוסקופ ניקון. תוסף זה מגיע מותקן מראש עם פיג'י.
  2. בחר דפדפן נתונים מהכרטיסיה הצגת מחסנית והשתמש בערימה וירטואלית מהכרטיסיה ניהול זיכרון בתוסף ביו-פורמטים.
    הערה: קבצי Lif עם ערימות z מ 8-10 מוחות הם לעתים קרובות 300-400 מגה בייט בגודל. במחשבים עם זיכרון RAM נמוך, פתיחת כמה קבצים כאלה יכולה לרוקן במהירות את ה- RAM הזמין ב- ImageJ ולמנוע עיבוד תמונה נוסף. מחסנית וירטואלית היא 'לקריאה בלבד', אינה זקוקה ל- RAM גבוה לעיבוד, והיא אפשרות אידיאלית לטעון ערכות נתונים גדולות לפיג'י.
  3. שים לב לתמונה הרב-ערוצית המוצגת ב- ImageJ. שנה את צבע הערוצים שורת התפריטים באמצעות הכלי | צבע תמונה |. שימו לב ל-NBs המסומנים על ידי מירנדה כתאים עגולים גדולים באזור CB.
  4. צייר אזור עניין (ROI) באמצעות הכלי אליפסה מעל כל NB כדי להימנע מספירת ה- NB פעמיים.
    1. מתוך שורת התפריטים ImageJ, בחר ניתוח כלי | | מנהל ROI. סמן את כל ה- NBs במקטע z הנוכחי והקש t לאחר סימון כל תא.
  5. לאחר שכל ה- NBs בסעיף z הנוכחי מסומנים, שנה את הערוצים ל- pH3 ו- EdU, וספור באופן ידני את מספר ה- NBs החיוביים של EdU, NBs חיובי, NBs מכתים באופן חיובי הן עבור EdU והן עבור pH3, ו- NBs לא מכתים עבור שני הסמנים.
  6. חפש NBs במקטעי z הבאים, מחק בדיקות ROIS ישנות והוסף בדיקות ROIs חדשות לספירת NBs בערימות שונות.
  7. הכן גיליון אלקטרוני עם העמודות הבאות: 1. EdU- pH3-: מקטע זה מייצג את התאים הכפולים-שליליים הנמצאים בשלב G0/G1 של מחזור התא; 2. EdU+: התאים בקטגוריה זו שילבו EdU והם עוברים שכפול DNA (S-phase); 3. EdU+ pH3+: תאים דו-חיוביים אלה השלימו את שלב ה- S והתקדמו לשלב G2 או M; 4. pH3+: NBs אלה עוברים מיטוזה.
  8. חשב אחוזים של NBs נוכחים בכל 4 הקטגוריות לעיל עבור כל אונה. הכן גרף עמודות באמצעות תוכנת הגיליון האלקטרוני המציגה את הנתונים המאוגדים עבור אחוזים של NBs בכל קטגוריה.

תוצאות

המוח הזחלי השלישי של Drosophila נעשה שימוש כמערכת מודל לחקר תהליכים תאיים והתפתחותיים בסיסיים9. במוקד המחקר הנוכחי היה להציג פרוטוקול לניתוח התקדמות מחזור התא ב- EdU- ו- pH3-שכותרתו NBs של אזור CB (איור 1). ה- CB NBs מחולקים לסוג I וסוג II, והם מציגים את תבנית החלוקה האסימטר?...

Discussion

התאגדות EdU ותגובת ה'קליק' הבאה שלה עם אזיד חדיר לתא מציגה יתרונות מעשיים של טכניקה זו על פני שיטת BrdU בשימוש מוקדם יותר7. עם זאת, תגובה זו מזורזת על ידי יונים Cu(I), וכמה צבעים עשויים להיות לא יציבים בנוכחות זרז נחושת זה, כפי שמומלץ בבירור על ידי יצרן ערכת EdU קליק-אי. כאשר ניסויי חיסון ...

Disclosures

המחברים הצהירו כי אין אינטרסים מתחרים קיימים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה במימון הקרן הלאומית למדע השוויצרית (מענק פרויקט 31003A_173188; www.snf.ch) ואוניברסיטת ברן (www.unibe.ch) ל- BS. למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
fly stocks
P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)Bloomington stock center#15477P-element insertion in the third exon of Mms19
 +; Mms19::eGFP, Mms19pGenerated in houseeGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background
w1118Bloomington stock center#3605wild-type stock (w;+;+)
Primary antibodiesDilution
Rat anti-MirandaAbcamAb1977881/250
Rabbit anti-pH3Cell Signaling97011/200
Secondary antibodies
Goat anti-Rat Cy3Jackson Immuno112-165-1671/150
Goat anti-Rat Alexa Fluor 568InvitrogenA110771/500
Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488InvitrogenA270341/500
Reagent/Kit
Aqua Poly/Mount mounting mediumPolysciences Inc18606-20
Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647Thermo Fischer ScientificC10340
Schneider’s Drosophila mediumThermo Fischer Scientific21720-024
Bovine serum albumin (BSA) fraction VMerck10735078001
Triton X-100Fischer Scientific9002-93-1non-ionic detergent
Software
Fiji (Imagej)https://imagej.net/Fiji
Leica Application Suite (LAS X)Leica microsystems
PRISMGraph pad softwareVersion 5
Microsoft ExcelMicrosoft office2016
Equipment
Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective
Materials
Aqua Poly/Mount mounting mediumwater-soluble, non-fluorescing mounting medium
Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate
Whatman filter paper

References

  1. Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. Cell cycle control across the eukaryotic kingdom. Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).
  2. Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).
  3. Pardee, A. B. A restriction point for control of normal animal cell proliferation. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 71 (4), 1286-1290 (1974).
  4. Gogendeau, D., et al. Aneuploidy causes premature differentiation of neural and intestinal stem cells. Nature Communications. 6, 8894 (2015).
  5. Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
  6. Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
  7. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  8. Kim, J. Y., et al. The value of phosphohistone H3 as a proliferation marker for evaluating invasive breast cancers: A comparative study with Ki67. Oncotarget. 8 (39), 65064-65076 (2017).
  9. Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
  10. Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461 (2010).
  11. Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells. PLoS Genetics. 16, 1008913 (2020).
  12. Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue. Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).
  13. Mollinari, C., Lange, B., Gonzalez, C. Miranda, a protein involved in neuroblast asymmetric division, is associated with embryonic centrosomes of Drosophila melanogaster. Biology of the Cell. 94 (1), 1-13 (2002).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Nag, R. N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase. Development. 145 (2), (2018).
  16. Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
  17. Hartenstein, V., Spindler, S., Pereanu, W., Fung, S. The development of the Drosophila larval brain. Advances in Experimental Medicine and Biology. 628, 1-31 (2008).
  18. Hebar, A., Rutgen, B. C., Selzer, E. NVX-412, a new oncology drug candidate, induces S-phase arrest and DNA damage in cancer cells in a p53-independent manner. PLoS One. 7, 45015 (2012).
  19. Wyllie, F. S., et al. S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway. Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).
  20. Xu, X., et al. Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides. Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).
  21. Duronio, R. J. Developing S-phase control. Genes & Development. 26 (8), 746-750 (2012).
  22. Turrero Garcia, M., Chang, Y., Arai, Y., Huttner, W. B. S-phase duration is the main target of cell cycle regulation in neural progenitors of developing ferret neocortex. Journal of Comparative Neurology. 524 (3), 456-470 (2016).
  23. Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
  24. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
  25. Zielke, N., et al. Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues. Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).
  26. Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers. Bio-protocol. 7 (16), 2517 (2017).
  27. Berger, C., et al. FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal. Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).
  28. Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

171

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved