5-Ethynyl-2'-Desoxyuridine/Phospho-Histone H3 Protocolo de rotulagem dupla para análise de progressão do ciclo celular em células-tronco neurais Drosophila

Resumo

A análise do ciclo celular com 5-ethynyl-2'-desoxyuridina (EdU) e rotulagem phospho-histone H3 (pH3) é um procedimento de várias etapas que pode exigir uma otimização extensiva. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado que descreve todas as etapas para este procedimento, incluindo análise de imagens e quantificação para distinguir células em diferentes fases do ciclo celular.

Resumo

A análise de progressão do ciclo in vivo é realizada rotineiramente em estudos sobre genes que regulam mitose e replicação de DNA. 5-Ethynyl-2'-desoxyuridina (EdU) foi utilizado para investigar a progressão replicativa/fase S, enquanto anticorpos contra fosfo-histona H3 foram utilizados para marcar núcleos e células mitóticas. Uma combinação de ambos os rótulos permitiria a classificação das fases G0/G1 (Fase gap), S (replicativa) e M (mitostítico) e serviria como uma ferramenta importante para avaliar os efeitos de knockdowns de genes mitotísticos ou mutantes nulos na progressão do ciclo celular. No entanto, os reagentes usados para marcar células rotuladas pela EdU são incompatíveis com várias etiquetas secundárias de anticorpos fluorescentes. Isso complica a imunostaining, onde anticorpos secundários primários e marcados são usados para marcar células mitóticas pH3 positivas. Este artigo descreve um protocolo passo-a-passo para a rotulagem dupla de EdU e pH3 em células-tronco neurais larval Drosophila, um sistema utilizado extensivamente para estudar fatores mitóticos. Além disso, é fornecido um protocolo para análise de imagem e quantificação para alocar células rotuladas em 3 categorias distintas, G0/G1, S, S>G2/M (progressão de S para G2/M) e M.

Introdução

O ciclo de divisão celular compreende uma fase G1 (primeira fase de lacuna), uma fase replicativa/S, um G2 (segunda fase de lacuna) e uma fase M (mitótica). Passando por essas fases, a célula sofre mudanças drásticas na transcrição celular, tradução e reorganização das máquinas citoesquelletais^1,2. Em resposta às sugestões de desenvolvimento e meio ambiente, as células podem deixar temporariamente de dividir e tornar-se quiescentes (G0) ou diferenciar e parar permanentemente de dividir³. Outros cenários, como danos ao DNA, podem causar diferenciação prematura ou apoptose^3,4. A resposta a tais pistas é mediada por pontos de verificação de ciclo celular, que atuam como um sistema de vigilância para garantir a integridade dos processos celulares essenciais antes que a célula se comprometa com a próxima fase do ciclo de divisão⁵. Portanto, estudos sobre genes que regulam a replicação do DNA, pontos de verificação e máquinas mitóticas precisam analisar possíveis defeitos de progressão do ciclo celular que podem ocorrer em células mutantes ou no knockdown do siRNA desses genes. Além disso, tais análises podem ser empregadas para testar a saúde geral das células, bem como as respostas celulares ao tratamento medicamentoso.

5-bromo-2'-desoxyuridina (BrdU) é um analógico de timmidina que é incorporado ao DNA durante a replicação⁶. Este método foi utilizado extensivamente para identificar células em fase S. No entanto, as células são então submetidas a procedimentos severos de desnaturação de DNA para permitir a detecção de BrdU através do uso de anticorpos anti-BrdU⁶. Este tratamento severo pode danificar epítopos celulares e evitar uma caracterização adicional da amostra através da imunostainagem. A incorporação da EdU e a posterior detecção por uma "reação de clique" catalisada por cobre com corantes de azide pequenos, permeáveis e fluorescentes elimina a necessidade de procedimentos de desnaturação severos⁷. Esse método, portanto, emergiu como uma alternativa mais prática à incorporação da BrdU.

Além disso, o pH3 tem sido descrito como um marcador confiável para células de fase mitótica/M⁸. Histone H3 é uma proteína histona de núcleo associada ao DNA que se torna fosfoilada em torno da fase G2 tardia até a fase M inicial e é desfosforilada no final da anáfase⁸. Vários anticorpos comerciais podem ser usados para detectar pH3 usando protocolos padrão de imunossuagem. A coloração dupla de EdU e pH3 permitiria, portanto, a detecção de células em fase S, bem como em fase M. Além disso, as células do G1 e início da fase G2 não manchariam positivamente nenhum dos marcadores.

As células-tronco neurais drosophila ou neuroblastos (NBs) oferecem um modelo de células-tronco bem caracterizados onde as células se dividem assimetricamente para produzir um NB auto-renovador idêntico e uma célula-mãe de gânglio (GMC), que é fadada à diferenciação⁹. Além disso, várias ferramentas genéticas e anticorpos específicos do RN tornam este sistema adequado para manipulação genética e imagens de células vivas. Consequentemente, vários estudos utilizaram NBs para estudar genes que regulam divisões assimétricas e determinação do destino celular⁹. Populações distintas de NBs existem no cérebro central (CB) e no lobo óptico (OL) do cérebro larval⁹; Foram utilizados NBs cb para o presente estudo. Estas terceiras NBs cb larval instar são células grandes que também são adequadas para estudar fatores que regulam a montagem de fuso mitótico. Um protocolo para analisar defeitos de progressão do ciclo celular seria uma ferramenta vital em tais estudos.

Protocolos publicados anteriormente empregavam kits comerciais, como o Kit de Proliferação celular Click-iT EdU Alexa Fluor, que fornecem vários componentes de reação e corantes de azida marcados com uma variedade de corantes Alexa Fluor para incorporação e detecção^{edu 10}. No entanto, os reagentes fornecidos com tais kits não são compatíveis com algumas etiquetas fluorescentes frequentemente usadas com anticorpos secundários. Este kit de detecção de células EdU (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit fornecido com corante de azide alexa fluor 647) foi testado em Drosophila terceiro NBs larval instar, e co-coloração foi tentado com anticorpos contra pH3 e Miranda, um marcador para NBs. Além disso, foram utilizados anticorpos secundários alexa Fluor 568 ou Cy3 para detecção da rotulagem de Miranda na membrana plasmática de NBs¹¹. No entanto, a intensidade esperada do sinal e o padrão de coloração (resultados inéditos) não foram observados com esses anticorpos secundários quando a imunossagem foi realizada após a detecção da EdU.

Para a incorporação da EdU, o protocolo descrito por Daul e colegas exigia alimentação das larvas com meio Kankel-Branco misturado com EdU e azul bromofenol (BPB)¹⁰. As larvas se alimentavam do alimento EdU e bpb-spiked, que podiam ser vistos por sua cor azul após a ingestão no intestino larval. Embora este método tenha sido utilizado para a incorporação da EdU em Mms19 loss-of-function(Mms19^P) terceira larva instar, as larvas Mms19^P aparentemente não se alimentaram, pois quase nenhuma cor azul foi detectada no intestino larval (resultados inéditos). As larvas mms19^P mostram drásticas deformidades de desenvolvimento e eventualmente prendem na terceira fase instar. Isso pode de alguma forma afetar o comportamento alimentar da terceira larva instar e tornar o protocolo de alimentação da EdU inadequado para esses casos.

Após estudar a literatura disponível e trabalhar extensivamente na padronização de etapas essenciais, foi proposta uma abordagem alternativa para a rotulagem dupla EdU/pH3 em NBs Drosophila, o que não requer alimentação de EdU para larvas. Um estudo anterior utilizou coloração dupla de EdU/pH3 para analisar o ciclo celular em NBs, mas não apresentou um protocolo detalhado⁴. Isso representa um obstáculo desnecessário para os laboratórios que tentam implementar esse método. Além disso, avaliar a compatibilidade de vários reagentes com o kit EdU e realizar uma maior otimização pode ser um processo demorado. Este artigo apresenta um protocolo passo-a-passo que abrange a incorporação da EdU em cérebros larvais dissecados e imunostaining com anticorpos anti-pH3, seguido de microscopia confocal e análise de imagem para alocar NBs para quatro categorias distintas: fase G0/G1, fase S, S>G2/M (progressão de S para G2/M) e fase M. As etapas que precisam de otimização são delineadas e dicas fornecidas para análise de imagens de grandes conjuntos de dados. Além disso, a leitura de EdU/pH3 em NBs do tipo selvagem é analisada e comparada com os NBs Mms19^P, que foram recentemente relatados para mostrar um atraso no ciclo^{celular 11}.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

1. Preparação de reagentes e estoques para ensaio click-it EdU

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais e a Tabela 1 para obter detalhes sobre o kit e os reagentes fornecidos com o kit.

1. Leve os frascos à temperatura ambiente antes de preparar as soluções.
2. Prepare a solução de estoque EdU de 10 mM (componente A) adicionando 2 mL de dimetilsulfoxida (DMSO, componente C). Misture bem e armazene a -20 °C.
3. Prepare uma solução de trabalho do Alexa Fluor 647-azide (componente B) adicionando 70μL de DMSO (componente C). Misture bem e armazene a -20 °C.
4. Prepare uma solução 1x de click-iT EdU tampão de reação (componente D) misturando 4 mL desta solução com 36 mL de água desionizada. Armazene a solução restante a 2-6 °C.
5. Faça um estoque de 10x (200 mg/mL) do aditivo tampão Click-iT EdU (componente F) adicionando 2 mL de água desionizada. Misture bem e armazene a -20 °C.
6. Armazene Hoechst 33342 (componente G) a 2-6 °C. Armar DMSO (componente C) em um desiccador a -20 °C.
   NOTA: As luvas devem ser usadas para lidar com DMSO e Hoechst.

2. Dissecção de terceiro cérebro larval instar e incorporação da EdU

NOTA: O protocolo para dissecções cerebrais foi descrito anteriormente¹². Antes de iniciar as dissecções, certifique-se de que quantidades suficientes das soluções EdU e PFA sejam preparadas e descongeladas conforme descrito em 2.6 e 3.1.

1. Prepare 10x Soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) adicionando 25,6 g Na₂HPO₄.7H₂0, 80 g NaCl, 2 g KCl, e 2 g KH₂PO4 a 1 L de água desionizada. Ajuste o pH para 7,4 e, posteriormente, prepare uma solução 1x em água desionizada.
2. Adicione o meio de dissecção de Schneiders (SM) a duas depressões consecutivas de uma placa de vidro (3 ou 9) de depressão. Adicione 1x PBS à próxima depressão consecutiva.
3. Usando um par de fórceps, escolha a terceira larva instar errante e coloque em um tecido molhado com PBS para limpar o resíduo de alimentos de mosca. Coloque a larva na depressão com PBS e, em seguida, na depressão consecutiva com SM.
4. Usando um par de fórceps finos, remova 3/4^do corpo inferior da larva.
   1. Pegue delicadamente os ganchos da boca larval com um par de fórceps, e segure a cutícula na outra extremidade com o outro par de fórceps.
   2. Gire a cabeça larval do avesso empurrando para dentro os ganchos da boca e, simultaneamente, descascando o tecido na outra extremidade.
5. Observe o cérebro larval com discos imagináveis ligados. Remova outros tecidos ligados ao cérebro, e transfira o cérebro para a próxima depressão consecutiva com SM.
6. Descongele a solução de ações 10 mM EdU. Prepare uma solução de 100 μM diluindo este estoque de 10 mM em SM.
7. Adicione 100 μL desta solução EdU+SM de 100 μM em outra depressão na placa Pyrex. Incubar ~5-10 cérebros dissecados em 100 μL de 100 μM EdU+SM solução para 2 h a 25 °C.
   NOTA: Como os NBs se dividem uma vez em ~2 h, este protocolo visa analisar um ciclo de células completa. Só use cérebros intactos para mais passos. Descarte cérebros danificados durante a dissecção.

3. Fixação e imunosstação

1. Prepare 4% de solução paraformaldeída (PFA) em um capô de fumaça.
   1. Adicione 4 g de pó de paraformaldeído a 80 mL de 1x PBS em um béquer colocado em um agitador magnético e aqueça a 60 °C. Para dissolver o PFA, adicione algumas gotas de 1 N NaOH. Verifique o pH e ajuste para 7.0 com algumas gotas de 1 M HCl, se necessário.
   2. Ajuste o volume para 100 mL com 1x PBS. Aliquot a solução PFA e armazene a 2-6 °C por até 1 mês. Adicione 0,3% de detergente não iônico (ver a Tabela de Materiais) à solução PFA para fixação eficiente de tecidos grandes, como o cérebro larval.
2. Após a incorporação da EdU, transfira os cérebros para tubos de microcentrífugo de 0,6 mL contendo 4% de PFA. Incubar à temperatura ambiente em um nutador por 15 minutos. Toque o tubo no banco do laboratório para que os cérebros se acalmem na parte inferior do tubo.
3. Retire o PFA e lave 3 vezes com PBS + 0,3% detergente não iônico (PBST) à temperatura ambiente. Certifique-se de que cada lavagem dure pelo menos 10 minutos em um nutador. Após a última lavagem, remova o PBST, adicione a solução de bloqueio (PBST + 5% de albumina de soro bovino) e incubar por 30 minutos à temperatura ambiente.
4. Anticorpo anti-Miranda diluído (1:250) e anticorpo anti pH3 (1:200) em PBST (ambos anticorpos no mesmo tubo). Remova o buffer de bloqueio e adicione a solução de anticorpos primários. Incubar durante a noite a 2-6 °C em um nutador.
   NOTA: Miranda é uma proteína de membrana presente em CB NBs. Serve para identificar essas grandes células redondas na região¹³do CB .
5. Remova a solução de anticorpos primários e lave 3 vezes com PBST. Certifique-se de que cada lavagem dure por 10 minutos em um nutador à temperatura ambiente.
6. Prepare a solução de anticorpos secundários adicionando 1:500 Alexa Fluor 488 diluída anti-Rabbit e Alexa Fluor 568 anti-Rat no PBST. Remova o PBST e adicione a solução de anticorpos secundários aos cérebros dissecados. Incubar durante a noite a 2-6 °C no escuro, em um nutador, e lavar 3 vezes com PBST (passo 3.5).

4. Detecção de EdU, coloração de DNA e montagem

1. Para preparar o coquetel de detecção da EdU, misture os componentes (ver Tabela 2) em um tubo de 1,5 mL.
2. Após a última lavagem (etapa 3.6), remova o PBST e adicione o coquetel de detecção da EdU aos cérebros dissecados. Incubar à temperatura ambiente no escuro por 30 minutos em um nutador. Lave 2 vezes com PBST por 10 min cada, no escuro.
3. Para coloração de DNA, diluir hoechst 33342 (componente G) 1:2.000 em PBST para preparar uma solução de 5 μg/mL.
4. Remova o PBST após a segunda lavagem (etapa 4.2) e adicione 500 μL de solução hoechst de 5 μg/mL aos cérebros dissecados. Incubar no escuro por 10 minutos. Remova Hoechst e lave uma vez com PBST por 10 minutos.
5. Bata o tubo no banco do laboratório, e deixe os cérebros se acalmarem. Remova o PBST do tubo, mas deixe para trás apenas 50-100 μL.
6. Corte a ponta de uma micropipette de 200 μL e transfira cuidadosamente os cérebros para um escorregador de vidro limpo. Remova o excesso de PBST do slide por manchas com tiras de papel do filtro. Cuidado para não deixar o papel do filtro tocar no cérebro.
7. Coloque uma gota de temperatura-de-água solúvel, não fluorescing meio de montagem no cérebro, e oriente os cérebros de tal forma que o fio nervoso ventral enfrenta o slide, e os lóbulos voltados para cima. Organize o cérebro em um único arquivo para que seja mais fácil imaginar o cérebro em série.
8. Coloque suavemente uma mancha em cima do cérebro. Coloque o slide em 2-6 °C durante a noite.
   NOTA: O meio de montagem endurece no armazenamento durante a noite para que não haja necessidade de selar a mancha com esmalte.

5. Imagem

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre o microscópio de varredura a laser e o objetivo de imersão em óleo utilizado neste protocolo.

1. A partir do software de Aquisição, selecione o objetivo de 63x.
2. Coloque uma gota de óleo de imersão na tampa logo acima do cérebro montado para facilitar a localização do tecido através da ocular.
3. Usando o canal DAPI/Hoechst 33342, encontre o cérebro através da ocular e, em seguida, mude para o modo de aquisição no software.
4. Configure 4 canais para imagem Hoechst 33342 (DNA), Alexa Fluor 488 (pH3), Alexa Fluor 568 (Miranda) e Alexa Fluor 647 (EdU). Use a ferramenta assistente de corante, que configura automaticamente os lasers de excitação e filtros de emissão para os corantes selecionados.
5. Defina o campo de visão de tal forma que engloba todo o lobo cerebral. Imagem de todo o volume do lobo cerebral adquirindo z-stacks espaçadas a 0,8 μm de distância. Armazene todas as imagens de uma sessão de imagem em um formato de biblioteca *.lif.

6. Análise de imagem

NOTA: As etapas a seguir descrevem a análise das imagens adquiridas e como classificar as células na fase G0/G1, fase S, S>G2/M (progressão de S para G2/M) e fase M usando o software ImageJ.

1. Baixe Fiji (Fiji is ImageJ) a partir da seguinte URL: https://fiji.sc/. Abra Fiji, depois arraste e solte os arquivos .lif em Fiji.
   NOTA: Fiji é uma versão do ImageJ que vem pré-instalada com vários plugins¹⁴. A transferência de arquivos .lif para Fiji abrirá o plugin Bio-formats, que é necessário para processar os arquivos .lif. O plugin de bioformitos também é necessário para abrir arquivos de imagem gerados a partir de algumas outras marcas de microscópio, por exemplo, arquivos nd2 gerados a partir de um microscópio Nikon. Este plugin vem pré-instalado com Fiji.
2. Selecione o navegador Data na guia de visualização de pilhas e use pilha virtual na guia gerenciamento de memória no plugin de formatos biológicos.
   NOTA: Os arquivos lif com pilhas z de 8-10 cérebros são muitas vezes 300-400 megabytes de tamanho. Em computadores com memória RAM baixa, abrir alguns desses arquivos pode esgotar rapidamente a MEMÓRIA RAM disponível no ImageJ e impedir qualquer processamento adicional de imagem. A pilha virtual é 'somente leitura', não precisa de RAM alta para processamento e é uma opção ideal para carregar grandes conjuntos de dados em Fiji.
3. Observe a imagem multicanal exibida no ImageJ. Altere a cor dos canais da barra de menu usando a ferramenta de | de cores da Imagem |. Observe os NBs rotulados por Miranda como grandes células redondas na região do CB.
4. Desenhe uma região de interesse (ROI) usando a ferramenta elipse sobre cada NB para evitar contar o NB duas vezes.
   1. Na barra de menu ImageJ,selecione analisar | ferramentas | Gerente de ROI. Marque todos os NBs na seção Z atual e pressione t após a marcação de cada célula.
5. Uma vez que todos os NBs na seção z atual estejam marcados, mude os canais para pH3 e EdU, e conte manualmente o número de NBs EdU positivos, NBs pH3 positivos, NBs manchando positivamente tanto para EdU quanto pH3, e NBs não manchando para ambos os marcadores.
6. Pesquise por NBs em seções z subsequentes, exclua ROIs antigos e adicione novos ROIs para contar NBs em pilhas diferentes.
7. Prepare uma planilha com as seguintes colunas: 1. EdU-pH3-: esta seção representa as células dupla-negativas que estão na fase G0/G1 do ciclo celular; 2. EdU+: as células desta categoria incorporaram a EdU e estão passando por replicação de DNA (fase S); 3. EdU+ pH3+: essas células duplas positivas completaram a fase S e progrediram para a fase G2 ou M; 4. pH3+: estes NBs estão passando por mitose.
8. Calcular percentuais de NBs presentes em todas as 4 categorias acima para cada lobo. Prepare um gráfico de barras usando o software de planilha mostrando os dados agrupados para percentuais de NBs em cada categoria.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

O terceiro cérebro larval de Drosophila bi-lobed tem sido utilizado como um sistema modelo para estudar processos celulares e de desenvolvimento fundamentais⁹. O foco do presente estudo foi apresentar um protocolo para análise da progressão do ciclo celular em NBs EdU e pH3 da região do CB (Figura 1). Os NBs CB são subdivididos em tipo I e tipo II, e exibem o padrão característico de divisão assimétrica⁹. Cada divisão tipo I ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

A incorporação da EdU e sua reação subsequente de "clique" com azida permeável celular apresenta vantagens práticas desta técnica sobre o método BrdU utilizado anteriormente⁷. No entanto, essa reação é catalisada por íons Cu(I), e vários corantes podem ser instáveis na presença deste catalisador de cobre, como é claramente aconselhado pelo fabricante do kit Click-it EdU. Quando os experimentos de imunosstaining foram realizados após a execução da etapa de detecção da EdU, a in...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
fly stocks
P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)	Bloomington stock center	#15477	P-element insertion in the third exon of Mms19
+; Mms19::eGFP, Mms19p	Generated in house		eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background
w1118	Bloomington stock center	#3605	wild-type stock (w;+;+)
Primary antibodies			Dilution
Rat anti-Miranda	Abcam	Ab197788	1/250
Rabbit anti-pH3	Cell Signaling	9701	1/200
Secondary antibodies
Goat anti-Rat Cy3	Jackson Immuno	112-165-167	1/150
Goat anti-Rat Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11077	1/500
Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A27034	1/500
Reagent/Kit
Aqua Poly/Mount mounting medium	Polysciences Inc	18606-20
Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647	Thermo Fischer Scientific	C10340
Schneider’s Drosophila medium	Thermo Fischer Scientific	21720-024
Bovine serum albumin (BSA) fraction V	Merck	10735078001
Triton X-100	Fischer Scientific	9002-93-1	non-ionic detergent
Software
Fiji (Imagej)	https://imagej.net/Fiji
Leica Application Suite (LAS X)	Leica microsystems
PRISM	Graph pad software	Version 5
Microsoft Excel	Microsoft office	2016
Equipment
Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective
Materials
Aqua Poly/Mount mounting medium			water-soluble, non-fluorescing mounting medium
Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate
Whatman filter paper