Protocollo a doppia marcatura 5-etinil-2'-deossiuridina/fosfo-istone H3 per l'analisi della progressione del ciclo cellulare nelle cellule staminali neurali della drosofila

Riepilogo

L'analisi del ciclo cellulare con etichettatura 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU) e fosfo-istone H3 (pH3) è una procedura in più fasi che può richiedere un'ampia ottimizzazione. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che descrive tutti i passaggi per questa procedura, compresa l'analisi e la quantificazione delle immagini per distinguere le cellule in diverse fasi del ciclo cellulare.

Abstract

L'analisi della progressione del ciclo cellulare in vivo viene eseguita di routine in studi sui geni che regolano la mitosi e la replicazione del DNA. La 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU) è stata utilizzata per studiare la progressione replicativa / fase S, mentre gli anticorpi contro il fosfo-istone H3 sono stati utilizzati per marcare nuclei e cellule mitotiche. Una combinazione di entrambe le etichette consentirebbe la classificazione delle fasi G0/G1 (fase Gap), S (replicativa) e M (mitotica) e servirebbe come strumento importante per valutare gli effetti dei knockdown dei geni mitotici o dei mutanti nulli sulla progressione del ciclo cellulare. Tuttavia, i reagenti utilizzati per contrassegnare le cellule marcate con EdU sono incompatibili con diversi tag fluorescenti anticorpali secondari. Ciò complica l'immunocolorazione, in cui gli anticorpi primari e secondari marcati vengono utilizzati per contrassegnare le cellule mitotiche pH3-positive. Questo documento descrive un protocollo passo-passo per la doppia etichettatura di EdU e pH3 nelle cellule staminali neurali larvali di Drosophila, un sistema ampiamente utilizzato per studiare i fattori mitotici. Inoltre, viene fornito un protocollo per l'analisi e la quantificazione delle immagini per allocare le cellule etichettate in 3 categorie distinte, G0 / G1, S, S >G2 / M (progressione da S a G2 / M) e M fasi.

Introduzione

Il ciclo di divisione cellulare comprende una fase G1 (prima fase gap), una fase replicativa/S, una G2 (seconda fase gap) e una fase M (mitotica). Passando attraverso queste fasi, la cellula subisce cambiamenti drammatici nella trascrizione cellulare, nella traduzione e nella riorganizzazione del macchinario citoscheletrico^1,2. In risposta a segnali di sviluppo e ambientali, le cellule possono temporaneamente cessare di dividersi e diventare quiescenti (G0) o differenziarsi e cessare permanentemente di dividersi³. Altri scenari, come il danno al DNA, possono causare differenziazione pre....

Protocollo

1. Preparazione dei reagenti e delle scorte per il test Click-it EdU

NOTA: fare riferimento alla Tabella dei materiali e alla Tabella 1 per i dettagli sul kit e sui reagenti forniti con il kit.

1. Portare i flaconcini a temperatura ambiente prima di preparare le soluzioni.
2. Preparare 10 mM di soluzione madre EdU (componente A) aggiungendo 2 mL di dimetilsolfossido (DMSO, componente C). Mescolare bene e conservare a -20 °C.
3. Preparare una soluzione di lavoro di Alexa Fluor 647-azide (componente B) aggiungendo 70μL di DMSO (componente C). Mescolare bene e conservare a -20 °C.

Risultati

Il cervello larvale bilobato di Drosophila terzo instar è stato utilizzato come sistema modello per studiare i processi cellulari e di sviluppo fondamentali⁹. L'obiettivo del presente studio è stato quello di presentare un protocollo per l'analisi della progressione del ciclo cellulare nei NB marcati con EdU e pH3 della regione CB (Figura 1). I CB NB sono suddivisi in tipo I e tipo II e presentano il caratteristico modello di divisione asimmetrica

Discussione

L'incorporazione di EdU e la sua successiva reazione "click" con azide permeabile alle cellule presenta vantaggi pratici di questa tecnica rispetto al metodo BrdU utilizzato in precedenza⁷. Tuttavia, questa reazione è catalizzata dagli ioni Cu(I) e diversi coloranti possono essere instabili in presenza di questo catalizzatore di rame, come è chiaramente consigliato dal produttore del kit Click-it EdU. Quando sono stati eseguiti esperimenti di immunocolorazione dopo aver eseguito la fase di rilev.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
fly stocks
P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)	Bloomington stock center	#15477	P-element insertion in the third exon of Mms19
+; Mms19::eGFP, Mms19p	Generated in house		eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background
w1118	Bloomington stock center	#3605	wild-type stock (w;+;+)
Primary antibodies			Dilution
Rat anti-Miranda	Abcam	Ab197788	1/250
Rabbit anti-pH3	Cell Signaling	9701	1/200
Secondary antibodies
Goat anti-Rat Cy3	Jackson Immuno	112-165-167	1/150
Goat anti-Rat Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11077	1/500
Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A27034	1/500
Reagent/Kit
Aqua Poly/Mount mounting medium	Polysciences Inc	18606-20
Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647	Thermo Fischer Scientific	C10340
Schneider’s Drosophila medium	Thermo Fischer Scientific	21720-024
Bovine serum albumin (BSA) fraction V	Merck	10735078001
Triton X-100	Fischer Scientific	9002-93-1	non-ionic detergent
Software
Fiji (Imagej)	https://imagej.net/Fiji
Leica Application Suite (LAS X)	Leica microsystems
PRISM	Graph pad software	Version 5
Microsoft Excel	Microsoft office	2016
Equipment
Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective
Materials
Aqua Poly/Mount mounting medium			water-soluble, non-fluorescing mounting medium
Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate
Whatman filter paper