5-エチニル-2'-デオキシウリジン/ホスホヒストンH3細胞周期進行解析用二重標識プロトコル

要約

5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)およびホスホヒストンH3(pH3)標識による細胞周期解析は、広範な最適化を必要とし得る多段階の手順である。ここでは、異なる細胞周期段階で細胞を区別するための画像解析および定量化を含む、この手順のすべてのステップを説明する詳細なプロトコルを提示する。

要約

生体細胞 周期進行解析は、有糸分裂およびDNA複製を調節する遺伝子に関する研究において日常的に行われている。5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)は、複製/S相進行を調査するために利用されているのに対し、ホスホヒストンH3に対する抗体は、有核および細胞をマークするために利用されてきた。両方のラベルの組み合わせは、G0/G1(ギャップフェーズ)、S(複製)、およびM(有糸分裂)相の分類を可能にし、有糸分裂遺伝子のノックダウンまたはヌル突然変異体が細胞周期進行に及ぼす影響を評価する重要なツールとして機能する。しかし、EdU標識細胞をマークするために使用される試薬は、いくつかの二次抗体蛍光タグと互換性がありません。これは、一次およびタグ付き二次抗体がpH3陽性有糸分裂細胞をマークするために使用される免疫染色を複雑にします。本論文では、染色体 の幼虫 神経幹細胞におけるEdUとpH3の二重標識のステップバイステッププロトコルについて説明する。さらに、画像分析と定量化のために、G0/G1、S、S、S>G2/M(SからG2/Mへの進行)、およびM相の3つの異なるカテゴリーにラベル付けされたセルを割り当てるためのプロトコルが用意されています。

概要

細胞分割サイクルは、G1相(第1ギャップ相)、複製/S相、G2(第2ギャップ相)、M(ミトティック)相で構成されています。これらの段階を経て、細胞は細胞転写、翻訳、および細胞骨格機構^1,2の再構成において劇的な変化を起こします。発達的および環境的な手掛かりに応じて、細胞は一時的に分裂を停止し、静止(G0)になるか、分化し、永久に³を分割しなくなる。DNA損傷などの他のシナリオでは、早期分化またはアポトーシス^3,4を引き起こす可能性があります。このようなキューへの応答は、細胞周期チェックポイントによって仲介され、細胞が分割サイクル⁵の次の段階にコミットする前に、本質的な細胞プロセスの完全性を確保するための監視システムとして機能する。したがって、DNA複製、チェックポイント、および有糸分裂性機械を調節する遺伝子に関する研究では、変異細胞またはこれらの遺伝子のsiRNAノックダウン時に起こり得る細胞周期進行欠陥を分析する必要があります。さらに、このような分析は、全体的な細胞の健康だけでなく、薬物治療に対する細胞応答をテストするために使用することができます。

5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)は、複製中にDNAに組み込まれるチミジンアナログ^6.この方法は、S相の細胞を同定するために広く使用された。しかし、細胞は、抗BrdU抗体⁶を用いてBrdUを検出できるように、過酷なDNA変性手順を行う。この過酷な治療は、細胞エピトープを損傷し、免疫染色を介してサンプルのさらなる特性を防ぐことができます。銅触媒によるEdUの組み込みおよびその後の検出は、小さく、細胞透過性、蛍光タグ付きアジド染料による「クリック反応」は、過酷な変性手順⁷の必要性を排除する。したがって、この方法は、BrdUの組み込みに代わるより実用的な代替手段として浮上した。

また、pH3は、有糸分裂/M相細胞⁸に対する信頼できるマーカーとして説明されている。ヒストンH3は、G2後期から初期のM相の周囲でリン酸化されて、アナフェーズ⁸の終わりに向かって脱リン酸化されるDNA関連コアヒストンタンパク質である。いくつかの市販の抗体を使用して、標準的な免疫染色プロトコルを使用してpH3を検出することができます。したがって、EdUとpH3の二重染色は、M相と同様にS相の細胞の検出を可能にするであろう。さらに、G1およびG2初期期の細胞は、いずれのマーカーにも積極的に染色されないであろう。

ショウジョウバエ 神経幹細胞または神経芽細胞(NBs)は、細胞が非対称的に分裂して1つの同一の自己更新NBおよび神経節母細胞(GMC)を産生する、分化⁹のために運命づけられた十分に特徴付けられる幹細胞モデルを提供する。さらに、いくつかの遺伝子ツールとNB特異的抗体は、このシステムを遺伝子操作および生細胞イメージングに適しています。その結果、いくつかの研究は、非対称分裂および細胞運命決定⁹を調節する遺伝子を研究するためにNBを利用した。脳の中枢(CB)と幼^虫脳の視頭葉(OL)に、異なる集団が存在する。CB NBは、現在の研究のために使用されました.これら第3のインスター幼虫CB NBは、有糸分裂性紡錘の組立を調節する因子を研究するのにも適している大細胞である。細胞周期の進行欠陥を分析するプロトコルは、このような研究において重要なツールとなるだろう。

先に公開されたプロトコルは、Click-iT EdU Alexa Fluor細胞増殖キットのような商用キットを採用しており、EdUの組み込みおよび検出^用の様々なアレクサフルオール染料でタグ付けされたいくつかの反応成分とアジド染料を提供する。しかし、このようなキットに付属の試薬は、二次抗体とよく使用される蛍光タグと互換性がありません。このEdU検出キット(アレクサフルオール647-共役アジジド色素を供給するClick-iT EdU Alexa Fluor細胞増殖キット)をショ ウジョウバエ 第3のインスター幼虫NBで試験し、NBのマーカーであるpH3およびミランダに対する抗体を共染色実験した。また、Alexa Fluor 568-またはCy3タグ付き二次抗体を^NBs11の血漿膜上でのミランダ標識の検出に用いた。しかし、期待されるシグナル強度および染色パターン(未発表の結果)は、EdU検出後に免疫染色を行った場合、これらの二次抗体では観察されなかった。

EdUの組み込みについては、DaulとDaulと同僚が説明したプロトコルは、EdUとブロモフェノールブルー(BPB)10と混合されたカンケル白培地で幼虫の供給を必要とした。幼虫は、幼虫の腸内で摂取すると青い色で見ることができるEdUとBPBスパイク食品に餌を与えました。この方法は、第3のインスター幼虫であるMms19機能喪失(Mms19^P)のEdU組み込みには用いられたが、幼虫の腸内で青色の色がほとんど検出されなかったため、Mms19^P幼虫は明らかにほとんど供給されなかった(未発表の結果)。Mms19^P幼虫は劇的な発達の変形を示し、最終的に第3のインスター段階で逮捕する。これは、第3のインスター幼虫の摂食行動に何らかの影響を及ぼし、そのような場合にはEdU-給餌プロトコルを不適当にする可能性がある。

利用可能な文献を研究し、本質的なステップの標準化に広く取り組んだ後、幼虫にEdUを供給する必要のないショウジョウバエNBsのEdU / pH3デュアルラベリングのための代替アプローチが提案されました。以前の研究では、NBsの細胞周期を分析するために二重EdU / pH3染色を採用したが、詳細なプロトコル⁴は示さなかった。これは、このメソッドを実装しようとするラボにとって、不要なハードルを示します。さらに、各種試薬とEdUキットとの相溶性を評価し、さらなる最適化を行う場合には、時間のかかる処理が可能です。この論文では、解剖された幼虫脳におけるEdUの組み込みと抗pH3抗体による免疫染色をカバーするステップバイステップのプロトコルを提示し、続いて共焦点顕微鏡と画像分析を行い、G0/G1相、S相、S>G2/M(SからG2/Mへの進行)、およびM相の4つのカテゴリーにNBを割り当てる。最適化が必要な手順の概要と、大規模データセットの画像分析に関するヒントが示されています。さらに、野生型のNBsにおけるEdU/pH3読み出しは、分析され、最近報告されたMms19^P NBsと比較され、細胞周期遅延¹¹を示す。

プロトコル

1. クリックイットEdUアッセイ用試薬とストックの調製

注:キットに付属のキットと試薬の詳細については、 材料表 と 表1 を参照してください。

1. 溶液を準備する前に、バイアルを室温にしてください。
2. 2 mLのジメチルスルホキシド(DMSO、C成分)を加えて10mM EdU(成分A)ストック液を調製します。よく混ぜて-20°Cで保存してください。
3. DMSO(成分C)の70μLを加えて、Alexa Fluor 647-azide(成分B)の働く溶液を準備します。よく混ぜて-20°Cで保存してください。
4. この溶液の4 mLを36mLの脱イオン水と混合して、Click-iT EdU反応バッファー(成分D)の1x溶液を調製します。残りの溶液を2~6°Cで保存してください。
5. 2 mLの脱イオン水を加えて、Click-iT EdU バッファー添加剤 (成分 F) の 10x ストック (200 mg/mL) を作ります。よく混ぜて-20°Cで保存してください。
6. 2-6 °CでHoechst 33342(成分G)を保管してください。 DMSO(コンポーネントC)をデシケータに-20 °Cで保管してください。
   メモ: 手袋は、DMSOとHoechstを扱うために使用されるべきです。

2. 第3のインスター幼虫脳の解剖とEdUの組み込み

注: 脳の切り分けのためのプロトコルは、以前に説明されています¹².解剖を開始する前に、2.6 および 3.1 で説明されているように、十分な量の EdU および PFA ソリューションが準備され、解凍されていることを確認してください。

1. 25.6 g Na₂HPO₄.7H₂0、80 g NaCl、2 g KCl、および 2 g KH₂PO4 を 1 L の脱イオン水を加えて、10x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を調製します。pHを7.4に調整し、続いて1x溶液を脱イオン水で調製します。
2. シュナイダース解剖媒体(SM)をガラス(3または9)のうつ病の2つの連続したくぼみ(3または9)のくぼみガラスのスポットプレートに加えます。次の連続したうつ病に1倍のPBSを追加します。
3. 鉗子のペアを使用して、3番目のインスター幼虫をさまようを選び、PBSで濡れた組織に置いてフライフード残渣をきれいにします。PBSでうつ病に幼虫を置き、その後、SMで連続うつ病に置きます.
4. 細かい鉗子を使って幼虫の下半身の3/4^分の1 を取り除きます。
   1. 1組の鉗子で幼虫の口のフックをそっとつかみ、もう一方の端にもう一方の鉗子を持たします。
   2. 口のフックを内側に押し込み、同時にもう一方の端の組織を剥がすことによって、幼虫の頭を裏返しにします。
5. 取り付けられた想像力ディスクを持つ幼虫の脳を観察します。脳に付着した他の組織を取り除き、脳をSMで次の連続したうつ病に移す。
6. 10 mM EdU ストック溶液を解凍します。この10mMストックをSMに希釈して、100μMの溶液を準備します。
7. この100 μM EdU+SM溶液を、パイレックスプレートの別のくぼみに100 μL追加します。25°Cで2時間100μMの脳を100μLで5~10回解剖した脳を2時間培養します。
   注: NBs は 2 時間に 1 回分かれるため、このプロトコルは 1 つの完全なセル周期を分析することを目的としています。それ以上のステップのために無傷の脳のみを使用してください。解剖中に損傷した脳を捨てる。

3. 固定と免疫染色

1. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液をヒュームフードに準備します。
   1. パラホルムアルデヒド粉末4gを80mLの1x PBSに加え、磁気スターラーに置いたビーカーに加え、60°Cに加熱します。 PFAを溶解するには、1 N NaOHの数滴を加えます。pH を確認し、必要に応じて 1 M HCl の数滴で 7.0 に調整します。
   2. 1x PBSで音量を100 mLに調整します。2~6 °Cで最大1ヶ月間、PFA溶液をアリコートして保管します。幼虫脳などの大きな組織を効率的に固定するために、0.3%非イオン性洗剤( 材料表を参照)をPFA溶液に添加します。
2. EdUを組み込んだ後、4%PFAを含む0.6 mLマイクロ遠心チューブに脳を移す。15分間、常温でヌテーターでインキュベートします。脳がチューブの下部に落ち着くように、実験室のベンチのチューブをタップします。
3. PFAを取り出し、室温でPBS+ 0.3%非イオン性洗剤(PBST)で3回洗浄します。各洗浄が10分以上続くよう、ヌテタで確認します。最後の洗浄後、PBSTを取り除き、ブロッキング溶液(PBST + 5%ウシ血清アルブミン)を加え、室温で30分間インキュベートします。
4. PBSTにおける希薄な抗ミランダ抗体(1:250)および抗pH3抗体(1:200)(同一のチューブ内の両方の抗体)。ブロッキングバッファーを取り外し、一次抗体溶液を添加します。2~6 °Cで一晩インキュベートします。
   注:ミランダはCB NBに存在する膜タンパク質です。CB領域¹³内のこれらの大きな丸い細胞を同定する役割を果たす。
5. 一次抗体溶液を取り出し、PBSTで3回洗浄します。各洗浄は、室温でヌテターで10分間持続することを確認します。
6. PBSTに1:500希釈アレクサフルーオール488抗ウサギとアレクサフルオール568抗ラットを加えることによって二次抗体溶液を調製します。PBSTを取り出し、解剖した脳に二次抗体溶液を加える。暗闇の中で2〜6°Cで一晩インキュベートし、ヌテーターで、PBSTで3回洗浄します(ステップ3.5)。

4. EdU検出、DNA染色、取り付け

1. EdU検出カクテルを準備するには、1.5 mLチューブにコンポーネント( 表2を参照)を混ぜます。
2. 最後の洗浄(ステップ3.6)の後、PBSTを取り出し、解剖した脳にEdU検出カクテルを加えます。室温で暗闇の中で30分間、ヌテーターでインキュベートします。PBSTで2回、暗闇の中で10分間洗浄します。
3. DNA染色の場合、PBSTでHoechst 33342(成分G)1:2,000を希釈し、5μg/mL溶液を調製します。
4. 2回目の洗浄後にPBSTを取り除き(ステップ4.2)、解剖した脳に5μg/mLのHoechst溶液を500μL加えます。暗闇の中で10分間インキュベートし、Hoechstを取り除き、PBSTで10分間1回洗います。
5. ラボベンチにチューブをタップし、脳が落ち着くようにします。PBSTをチューブから取り出しますが、残すのは50-100μLだけです。
6. 200 μL マイクロピペットチップの端部を切り、きれいなガラススライドに慎重に脳を移します。濾紙ストリップでブロッティングして、スライドから余分なPBSTを除去します。フィルター用紙が脳に触れないように注意してください。
7. 水溶性の非蛍光実装媒体を脳に一滴置き、腹側神経コードがスライドに向き、ローブが上向きになるように脳を向ける。脳を連続的に画像化しやすいように、脳を単一のファイルに配置します。
8. 脳の上にカバースリップをそっと置きます。スライドを一晩2~6°Cに置きます。
   注:取り付け媒体は、マニキュアでカバースリップを密封する必要がないように、一晩保管時に硬化します。

5. イメージング

注: このプロトコルで使用されるレーザー走査顕微鏡および油浸性の目的の詳細については 、材料表 を参照してください。

1. 取得ソフトウェアから、63x 目標を選択します。
2. 取り付けられた脳のすぐ上のカバースリップに浸漬油を一滴入れ、接眼を通して組織を見つけやすくします。
3. DAPI/Hoechst 33342チャネルを使用して、接眼を通して脳を見つけ、ソフトウェアの 取得モード に切り替えます。
4. 画像Hoechst 33342(DNA)、アレクサフルーター488(pH3)、アレクサフルオール568(ミランダ)、アレクサフルオール647(EdU)をイメージする4チャンネルを設定します。選択した 色素の 励起レーザーとエミッション フィルタを自動的に設定する、色素アシスタント ツールを使用します。
5. 脳葉全体を包含するような視野を設定する。0.8 μm離れた場所に配置されたzスタックを取得して、脳ローブの全容を画像化します。イメージング セッションのすべてのイメージを *.lif ライブラリ 形式で保存します。

6. 画像解析

注: 次の手順では、取得した画像の解析と、セルを G0/G1 フェーズ、S 位相、S>G2/M (S から G2/M への進行)、および ImageJ ソフトウェアを使用した M 位相に分類する方法について説明します。

1. フィジー (フィジーは ImageJ) を次の URL からダウンロード https://fiji.sc/ します。フィジーを開き、.lifファイルをフィジーにドラッグアンドドロップします。
   注:フィジーは、いくつかのプラグイン¹⁴でプリインストールされているImageJのバージョンです。.lifファイルをフィジーに転送すると、.lifファイルを処理するために必要なバイオフォーマットプラグインが開きます。バイオフォーマットプラグインは、他のマイクロスコープブランド、例えばニコン顕微鏡から生成されたnd2ファイルから生成された画像ファイルを開くためにも必要です。このプラグインはフィジーとプリインストールされています。
2. スタック表示タブから[データブラウザ]を選択し、バイオフォーマットプラグインのメモリ管理タブから仮想スタックを使用します。
   注: 8- 10 の脳からの z スタックを持つ Lif ファイルは、多くの場合、300 ~ 400 メガバイトのサイズです。RAMが少ないコンピュータでは、そのようなファイルをいくつか開くと、ImageJで利用可能なRAMが急速に使い果たされ、それ以上の画像処理が妨げられます。仮想スタックは「読み取り専用」であり、処理に高い RAM を必要とせず、大きなデータセットをフィジーに読み込むには理想的なオプションです。
3. ImageJ に表示されるマルチチャンネル画像を確認します。[イメージ] |のカラー チャネル ツール を使用して、メニュー バーから チャネルの色|変更します。CB領域の大きな丸い細胞としてミランダ標識されたNBを観察してください。
4. NB を 2 回カウントしないように、 各 NB の楕円ツールを使用して関心領域 (ROI) を描画します。
   1. ImageJ メニュー バーから[分析]を選択|ツール|ROI マネージャー.現在の Z セクションのすべての NB をマークし、各セルをマークした後でtを押します。
5. 現在の z セクション内のすべての NB がマークされたら、チャネルを pH3 および EdU に変更し、手動で EdU 陽性 NB、pH3 陽性 NB、EdU と pH3 の両方について正に染色される NB、および両方のマーカーに対して染色しない NB の数をカウントします。
6. 後続の z セクションで NB を検索し、古い RO を削除し、新しい RO を追加して、別のスタック内の NB をカウントします。
7. 次の列を使用してスプレッドシートを準備します: 1. EdU- pH3-: このセクションは、セル周期の G0/G1 フェーズにある二重陰性セルを表します。2. EdU+:このカテゴリの細胞は、EdUを組み込み、DNA複製(S相)を受けている。3. EdU+ pH3+: これらの二重陽性細胞は、S相を完了し、G2またはM相に進行している;4. pH3+: これらの NB は有糸分裂を受けている。
8. 各ローブについて上記の4つのカテゴリすべてに存在するNBの割合を計算します。各カテゴリの MB の割合のプールされたデータを示すスプレッドシート ソフトウェアを使用して棒グラフを準備します。

結果

二葉性 ショウジョウバエ 第3次インスター幼虫脳は、基本的な細胞および発達過程9を研究するためのモデルシステムとして利用^{されてきた。}現在の研究の焦点は、CB領域のEdU-およびpH3標識されたNBsにおける細胞周期進行の分析のためのプロトコルを提示することであった(図1)。CB NB はタイプ I とタイプ II にサブタイプ化され、特性非対称分割?...

ディスカッション

EdU の組み込みとその続く細胞透過性アジドとの "クリック" 反応は、前の⁷で使用した BrdU メソッドよりもこの手法の実用的な利点を提示します。しかし、この反応はCu(I)イオンによって触媒され、いくつかの色素は、この銅触媒の存在下で不安定である可能性があり、Click-it EdUキットメーカーによって明確に助言される。EdU検出ステップを実行した後に免疫染色実験を行っ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
fly stocks
P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)	Bloomington stock center	#15477	P-element insertion in the third exon of Mms19
+; Mms19::eGFP, Mms19p	Generated in house		eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background
w1118	Bloomington stock center	#3605	wild-type stock (w;+;+)
Primary antibodies			Dilution
Rat anti-Miranda	Abcam	Ab197788	1/250
Rabbit anti-pH3	Cell Signaling	9701	1/200
Secondary antibodies
Goat anti-Rat Cy3	Jackson Immuno	112-165-167	1/150
Goat anti-Rat Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11077	1/500
Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A27034	1/500
Reagent/Kit
Aqua Poly/Mount mounting medium	Polysciences Inc	18606-20
Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647	Thermo Fischer Scientific	C10340
Schneider’s Drosophila medium	Thermo Fischer Scientific	21720-024
Bovine serum albumin (BSA) fraction V	Merck	10735078001
Triton X-100	Fischer Scientific	9002-93-1	non-ionic detergent
Software
Fiji (Imagej)	https://imagej.net/Fiji
Leica Application Suite (LAS X)	Leica microsystems
PRISM	Graph pad software	Version 5
Microsoft Excel	Microsoft office	2016
Equipment
Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective
Materials
Aqua Poly/Mount mounting medium			water-soluble, non-fluorescing mounting medium
Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate
Whatman filter paper