Drosophila 신경 줄기 세포에서 세포 주기 진행 분석을 위한 5-에티닐-2'-Deoxyuridine/인성-히스톤 H3 이중 라벨링 프로토콜

요약

5-에티닐-2'-데옥시리딘(EdU) 및 인산히스톤 H3(pH3) 라벨링을 함유한 세포 주기 분석은 광범위한 최적화를 요구할 수 있는 다단계 절차이다. 여기서는 상이한 세포 주기 단계에서 세포를 구별하기 위해 이미지 분석 및 정량화를 포함한 이 절차에 대한 모든 단계를 설명하는 상세한 프로토콜을 제시합니다.

초록

생체 내 세포 주기 진행 분석은 미토시스 및 DNA 복제를 조절하는 유전자에 대한 연구에서 일상적으로 수행됩니다. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU)는 복제 /S 상 진행을 조사하기 위해 활용된 반면 인 - 히스톤 H3에 대한 항체는 미토틱 핵및 세포를 표시하는 데 활용되었습니다. 두 라벨의 조합은 G0/G1(갭 상), S(복제), M(미토틱) 단계의 분류를 가능하게 하고 세포 주기 진행에 미토성 유전자 녹다운 또는 null 돌연변이체의 효과를 평가하는 중요한 도구로 작용합니다. 그러나, EdU 라벨이 부착된 세포를 표시하는 데 사용되는 시약은 여러 이차 항체 형광 태그와 호환되지 않습니다. 이것은 pH3 양성 미토아 세포를 표시하기 위하여 1 차적이고 태그된 이차 항체가 이용되는 면역 염색을 복잡하게 합니다. 이 논문은 드로소필라 애벌레 신경 줄기 세포에서 EdU와 pH3의 이중 라벨링을 위한 단계별 프로토콜을 설명하며, 이는 미토Tic 요인을 연구하기 위해 광범위하게 활용된 시스템입니다. 또한, 이미지 분석 및 정량화를 위해 3개의 별개의 범주, G0/G1, S, S>G2/M(S에서 G2/M로진행) 및 M 상에 표지된 셀을 할당하기 위한 프로토콜이 제공됩니다.

서문

상기 세포 분열 주기는 G1 상(제1 갭상), 복제/S-phase, G2(제2 갭 상), 및 M(미토틱) 위상을 포함한다. 이러한 단계를 통과하면 세포는 세포 전사, 번역 및 세포 켈레탈^기계1,2의재구성에 극적인 변화를 겪습니다. 발달 및 환경 단서에 응하여, 세포는 일시적으로 분할을 중단하고 정지(G0)가 되거나 분화하고 영구적으로^3를분할하는 것을 중단할 수 있다. DNA 손상과 같은 다른 시나리오는 조기 분화 또는^세포멸을일으킬 수 있습니다^3,4. 이러한 단서에 대한 반응은 세포 주기 검사점에 의해 중재되며, 이는 세포가 분할 주기^5의다음 단계에 커밋하기 전에 필수 세포 프로세스의 무결성을 보장하기 위해 감시 시스템역할을 한다. 따라서 DNA 복제, 검사점 및 미토틱 기계를 조절하는 유전자에 대한 연구는 돌연변이 세포 또는 이러한 유전자의 siRNA 녹다운 시 발생할 수 있는 가능한 세포 주기 진행 결함을 분석해야 합니다. 추가적으로, 그 같은 분석은 약물 치료에 대한 세포 반응뿐만 아니라 전반적인 세포 건강을 테스트하기 위해 사용될 수있다.

5-브로모-2'-데옥시리딘(BrdU)은 복제⁶동안 DNA에 통합되는 티미딘 아날로그이다. 이 방법은 S-phase에서 세포를 식별하기 위해 광범위하게 사용되었습니다. 그러나, 세포는 그 때 반대로 BrdU 항체 6의 사용을 통해 BrdU의 검출을 허용하기 위하여 가혹한 DNA 변성 절차를 복종한다^6. 이 가혹한 처리는 세포 전형을 손상하고 면역 염색을 통해 견본의 추가 특성화를 방지할 수 있습니다. EdU 는 구리 촉매에 의한 후속 검출, 작은 세포 투과성, 형광 태그 아지드 염료로 '클릭 반응'은 가혹한 변성 절차^7의필요성을 제거합니다. 따라서 이 방법은 BrdU 통합에 대한 보다 실용적인 대안으로 부상했습니다.

또한, pH3는 미토틱/M^{상세포(8)에}대한 신뢰할 수 있는 마커로 기재되었다. 히스톤 H3는 후기 G2 상에서 초기 M 상으로 인광되는 DNA 관련 코어 히스톤 단백질로, 아나상^8의끝을 향해 탈인된다. 몇몇 상업적인 항체는 표준 면역 염색 프로토콜을 사용하여 pH3를 검출하기 위하여 이용될 수 있습니다. 따라서 EdU 및 pH3의 이중 염색은 M-phase뿐만 아니라 S 상에서 세포의 검출을 가능하게 합니다. 추가적으로, G1 및 초기 G2 상에 있는 세포는 마커의 둘 다에 대해 긍정적으로 얼룩지지 않을 것입니다.

Drosophila 신경 줄기 세포 또는 신경 폭발 (NBs)는 세포가 비대칭적으로 분할하여 1 개의 동일한 자기 갱신 NB및 신경절 모세포 (GMC)를 생성하는 잘 특징적인 줄기 세포 모델을 제공하며, 이는 분화^9에대해 지방이 된다. 추가적으로, 몇몇 유전 공구 및 NB 특정 항체는 유전 조작 및 살아있는 세포 화상 진찰에 적합한 이 시스템을 만듭니다. 따라서, 몇몇 연구 결과는 비대칭 분열 및 세포 운명 결정^{결정 9를}통제하는 유전자를 연구하기 위하여 NB를 이용했습니다. NB의 뚜렷한 인구는 중앙 뇌 (CB) 및 애벌레 뇌의 광학 엽 (OL)에^존재9; CB NB는 현재 연구에 사용되었습니다. 이 세 번째 인스타 애벌레 CB NB는 또한 미토틱 스핀들 조립을 조절하는 요인을 연구하는 데 적합한 큰 세포입니다. 세포 주기 진행 결함을 분석 하는 프로토콜 이러한 연구에서 중요 한 도구가 될 것 이다.

이전에 발표된 프로토콜은 EdU 통합 및^{검출(10)에}대한 다양한 알렉사 플루오르 염료로 태그된 여러 반응 성분및 아지드 염료를 제공하는 Click-iT EdU Alexa Fluor 세포 증식 키트와 같은 상용 키트를 이전에 사용했다. 그러나, 이러한 키트와 함께 공급되는 시약은 종종 이차 항체와 함께 사용되는 일부 형광 태그와 호환되지 않는다. 이 EdU 검출 키트(알렉사 플루어 647-컨쥬게이트 아지드 염료와 함께 제공된 Click-iT EdU Alexa Fluor 세포 증식 키트)는 드로소필라 제3 인스타 애벌레 NBs에서 테스트되었으며, NB의 마커인 pH3및 Miranda에 대한 항체로 공동 염색을 시도하였다. 또한, 알렉사 플루어(568) 또는 Cy3 태그이 부착된 이차 항체는^NBs(11)의혈장 막에 미란다 라벨링의 검출을 위해 사용되었다. 그러나, 예상 신호 강도 및 염색 패턴(미공개 결과)은 EdU 검출 후 면역염색이 수행되었을 때 이러한 이차 항체와 함께 관찰되지 않았다.

EdU 통합의 경우, Daul과 동료가 설명한 프로토콜은 EdU 및 브로모페놀 블루(BPB)^10과혼합된 칸켈-화이트 배지로 애벌레를 먹이야 하였다. 애벌레는 EdU와 BPB 가시 식품에 먹이를 주었는데, 이는 애벌레 창자에 섭취시 청색으로 보일 수 있습니다. 이 방법은 Mms19 기능 상실(Mms19^P)세 번째 인스타 애벌레에 EdU 편입에 사용되었지만, Mms19^P 유충은 분명히 유충 장에서 검출된 거의 모든 파란색으로 공급되지 않았다 (공개되지 않은 결과). Mms19^P 애벌레는 과감한 발달 기형을 보여주고 결국 세 번째 인스타 단계에서 체포됩니다. 이것은 어떻게 든 세 번째 인스타 애벌레의 먹이 행동에 영향을 미치고 EdU 공급 프로토콜이 그러한 경우에 적합하지 않게 만들 수 있습니다.

사용 가능한 문헌을 연구하고 필수 단계의 표준화에 광범위하게 작업 한 후, 드로소필라 NBs에서 EdU / pH3 이중 라벨링에 대한 대체 접근 법을 제안했으며, 이는 EdU를 유충에 공급할 필요가 없습니다. 이전 연구는 NBs에서 세포 주기를 분석하기 위해 듀얼 EdU/pH3 염색을 사용했지만 상세한 프로토콜^4를제시하지 않았다. 이렇게 하면 이 메서드를 구현하려는 랩에 불필요한 장애물이 있습니다. 또한 EdU 키트와의 다양한 시약과의 호환성을 평가하고 추가 최적화를 수행하는 것은 시간이 많이 소요되는 과정이 될 수 있습니다. 이 논문은 EdU가 항 pH3 항체를 사용하여 해부된 애벌레 뇌에 대한 EdU 편입 및 면역 염색을 포함하는 단계별 프로토콜을 제시하고, 공초점 현미경 검사법과 이미지 분석을 통해 NB를 G0/G1 단계, S단계, S>G2/M(S에서 G2/M로 진행) 및 M상에 할당합니다. 최적화가 필요한 단계는 설명되고 큰 데이터 집합의 이미지 분석을 위해 제공되는 팁이 설명되어 있습니다. 또한, 야생형 NB의 EdU/pH3 판독편은 Mms19^P NB와 비교하여 분석되고 비교되며, 이는 최근 세포 주기^{지연(11)을}나타내기 위해 보고된 것으로 보고되었다.

프로토콜

1. 클릭 - it EdU 분석시 시약 및 주식 준비

참고: 키트와 함께 제공된 키트 및 시약에 대한 자세한 내용은 재료 표 및 표 1을 참조하십시오.

1. 솔루션을 준비하기 전에 바이알을 실온으로 가져옵니다.
2. 디메틸설프리산화물(DMSO, 성분 C)의 2mL를 추가하여 10mM EdU(성분 A) 스톡 솔루션을 준비한다. 잘 섞어서 -20°C에 보관하십시오.
3. DMSO(성분 C)의 70μL을 추가하여 알렉사 플루오르 647-아지드(component B)의 작업 용액을 준비한다. 잘 섞어서 -20°C에 보관하십시오.
4. 이 솔루션의 4mL을 36mL의 탈온화 물과 혼합하여 Click-iT EdU 반응 버퍼(component D)의 1x 용액을 준비합니다. 나머지 용액을 2-6°C에 저장합니다.
5. 2mL의 탈온화된 물을 추가하여 Click-iT EdU 버퍼 첨가제(component F)의 10배 스톡(200 mg/mL)을 만듭니다. 잘 섞어서 -20°C에 보관하십시오.
6. 2-6°C에서 호흐트스트 33342(성분 G)를 저장합니다. DMSO(성분 C)를 -20°C의 건조기에 저장합니다.
   참고: 장갑은 DMSO 및 Hoechst를 처리하는 데 사용되어야 합니다.

2. 제3의 별애자 뇌와 EdU 의 해부

참고: 뇌 해부 프로토콜은 이전에^12로설명되었습니다. 해부를 시작하기 전에 2.6 및 3.1에 설명된 대로 충분한 양의 EdU 및 PFA 솔루션이 준비되고 해동되는지 확인합니다.

1. 25.6g Na₂HPO₄.7H₂0, 80g NaCl, 2g KCl, 2g KH₂PO4 ~ 1L의 탈이온화된 물 2g을 추가하여 10배 인산염 완충식(PBS)을 준비한다. pH를 7.4로 조정한 후 탈이온수에서 1배 용액을 준비한다.
2. 슈나이더스 해부 매체(SM)를 유리(3또는 9) 우울증 유리 반점 판의 2회 연속 우울증에 추가한다. 다음 연속 우울증에 1 배 PBS를 추가합니다.
3. 집게 한 켤레를 사용하여, 방황 세 번째 별 애벌레를 선택하고 플라이 음식 잔류물을 청소하기 위해 PBS로 젖은 조직에 배치합니다. PBS와 우울증에 유충을 배치 하 고 SM과 연속 우울증에.
4. 미세 한 쌍의 집게를 사용하여 애벌레의 하반신의 3/4^을 제거하십시오.
   1. 한 쌍의 포셉으로 애벌레 입 후크를 부드럽게 잡고 다른 쪽 끝에는 다른 쪽 끝에 표피를 잡아 버프를 잡습니다.
   2. 입 후크 안쪽을 밀고 동시에 다른 쪽 끝에 있는 조직을 벗겨내어 애벌레 머리를 안쪽으로 돌립니다.
5. 부착 된 상상력 디스크와 애벌레 뇌를 관찰. 뇌에 부착 된 다른 조직을 제거하고, SM과 다음 연속 우울증에 뇌를 전송.
6. 10m EdU 스톡 솔루션을 해동합니다. 이 10m m 스톡을 SM에 희석하여 100 μM 솔루션을 준비하십시오.
7. 이 100 μM EdU+SM 용액의 100 μL을 Pyrex 플레이트의 또 다른 우울증에 추가합니다. 25°C에서 2시간 동안 100 μM EdU+SM 용액의 100 μL에서 ~5-10개의 해부된 뇌를 배양한다.
   참고: NB가 ~2h에서 한 번 분할됨에 따라 이 프로토콜은 하나의 전체 세포 주기를 분석하는 것을 목표로 합니다. 추가 단계에만 손상되지 않은 뇌를 사용하십시오. 해부 중에 손상된 뇌를 폐기하십시오.

3. 고정 및 면역 염색

1. 연기 후드에 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액을 준비합니다.
   1. 자성 교반기위에 놓인 비커에 1x PBS의 80mL에 파라포름알데히드 파우더 4g을 넣고 60°C로 가열합니다. PFA를 용해하려면 1 N NaOH 몇 방울을 추가하십시오. pH를 확인하고 필요한 경우 1 M HCl몇 방울로 7.0으로 조정하십시오.
   2. 1배 PBS로 볼륨을 100mL로 조정합니다. PFA 용액을 알리쿼트하고 최대 1개월 동안 2-6°C에 보관하십시오. PFA 솔루션에 0.3% 비이온 세제(재료표참조)를 추가하여 애벌레 뇌와 같은 대형 조직을 효율적으로 고정합니다.
2. EdU 가 통합 된 후, 뇌를 0.6 mL 미세 원심 분리기 튜브로 전송하여 4 % PFA를 함유합니다. 15 분 동안 누두에 실온에서 배양. 뇌가 튜브 의 바닥에 정착할 수 있도록 실험실 벤치에 튜브를 누릅니다.
3. PFA를 제거하고 실온에서 PBS + 0.3 % 비 이온 세제 (PBST)로 3 번 세척하십시오. 각 세척이 견과류에 10분 이상 지속되도록 하십시오. 마지막 세척 후, PBST를 제거, 차단 용액을 추가 (PBST + 5 % 소 세럼 알부민), 실온에서 30 분 동안 인큐베이션.
4. PBST에서 항 미란다 항체(1:250) 및 항 pH3 항체(1:200)를 희석시(동일한 튜브내의 두 항체). 차단 버퍼를 제거하고 1차 항체 용액을 추가합니다. 영양사에 2-6 °C에서 하룻밤 을 배양.
   참고: 미란다는 CB NB에 존재하는 막 단백질입니다. CB^{영역(13)에서}이러한 큰 둥근 세포를 식별하는 역할을 한다.
5. 1 차적인 항체 용액을 제거하고 PBST로 3 번 세척하십시오. 각 세척이 실온에서 영양사에서 10 분 동안 지속되도록하십시오.
6. PBST에 1:500 희석 알렉사 플루어 488 안티 래빗과 알렉사 플루어 568 안티 래터를 추가하여 이차 항체 용액을 준비한다. PBST를 제거하고 해부된 뇌에 이차 항체 용액을 추가합니다. 어둠 속에서 2-6°C에서 하룻밤 동안 배양하고, 영양가에, PBST (단계 3.5)로 3 번 세척한다.

4. EdU 검출, DNA 염색 및 장착

1. EdU 검출 칵테일을 준비하려면 1.5mL 튜브에 부품(표 2참조)을 혼합합니다.
2. 마지막 세척 후 (단계 3.6), PBST를 제거하고 해부 된 뇌에 EdU 검출 칵테일을 추가합니다. 어둠 속에서 실온에서 30분 동안 누양자에서 배양하십시오. 어둠 속에서 PBST로 2회 10분 씩 씻으시다.
3. DNA 염색의 경우, 5 μg/mL 용액을 준비하기 위해 PBST에서 Hoechst 33342 (성분 G) 1:2,000을 희석하십시오.
4. 제2 세척 후 PBST를 제거하고 (단계 4.2), 해부 된 뇌에 5 μg / mL Hoechst 용액의 500 μL을 추가합니다. 어둠 속에서 10분 동안 배양하십시오.
5. 실험실 벤치에 튜브를 누르고 뇌가 정착하게하십시오. 튜브에서 PBST를 제거하지만 50-100 μL만 남깁니다.
6. 200 μL 마이크로파이프 팁의 끝을 잘라 내고 뇌를 깨끗한 유리 슬라이드로 조심스럽게 옮기십시오. 필터 용지 스트립으로 얼룩을 만들어 슬라이드에서 초과 PBST를 제거합니다. 필터 용지가 뇌에 닿지 않도록 주의하십시오.
7. 뇌에 수용성, 비형광 장착 매체를 한 방울 넣고, 복부 신경 코드가 슬라이드에 직면하고, 로브가 위쪽으로 향하도록 뇌를 방향을 지정합니다. 뇌를 연속적으로 이미지화하는 것이 더 쉬워지도록 두뇌를 단일 파일로 정렬합니다.
8. 뇌 위에 커버슬립을 부드럽게 놓습니다. 슬라이드를 하룻밤 사이에 2-6 °C로 놓습니다.
   참고: 마운팅 매체는 밤새 보관시 강화되어 매니큐어로 커버슬립을 밀봉할 필요가 없습니다.

5. 이미징

참고: 이 프로토콜에 사용되는 레이저 스캐닝 현미경 및 오일 침지 목표에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 획득 소프트웨어에서 63x 목표를 선택합니다.
2. 접피스를 통해 조직을 쉽게 찾을 수 있도록 장착 된 뇌 바로 위에 덮개 슬립에 침지 오일 한 방울을 넣습니다.
3. DAPI/Hoechst 33342 채널을 사용하여 접피스를 통해 뇌를 찾은 다음 소프트웨어의 획득 모드로 전환합니다.
4. Hoechst 33342 (DNA), 알렉사 플루어 488 (pH3), 알렉사 플루어 568 (미란다), 알렉사 플루어 647 (EdU)을 이미지4 채널을 설정합니다. 선택한 염료에 대한 흥분 레이저 및 방출 필터를 자동으로 설정하는 염료 보조 도구를 사용합니다.
5. 전체 뇌 엽을 포괄하도록 시야를 설정합니다. z-스택을 획득하여 뇌 엽의 전체 부피를 0.8 μm 간격으로 이미지합니다. 이미징 세션의 모든 이미지를 *.lif 라이브러리 형식으로 저장합니다.

6. 이미지 분석

참고: 다음 단계는 획득된 이미지의 분석과 G0/G1 상, S 상, S>G2/M(S에서 G2/M로 진행) 및 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 M 단계로 셀을 정렬하는 방법을 설명합니다.

1. 다음 URL에서 피지 (피지는 ImageJ) 다운로드 : https://fiji.sc/. 피지를 열고, 다음 드래그 피지에 .lif 파일을 드롭.
   참고 : 피지는 여러 플러그인과 함께 사전 설치 제공되는 ImageJ의^{버전입니다 14.} 피지로 .lif 파일을 전송하면 .lif 파일을 처리하는 데 필요한 바이오 포맷 플러그인이 열립니다. 바이오 포맷 플러그인은 또한 다른 현미경 브랜드에서 생성 된 이미지 파일을 열어야한다, 예를 들어, 니콘 현미경에서 생성 된 nd2 파일. 이 플러그인피지와 사전 설치 온다.
2. 스택 보기 탭에서 데이터 브라우저를 선택하고 바이오 포맷 플러그인의 메모리 관리 탭에서 가상 스택을 사용합니다.
   참고: 8-10 개의 뇌에서 z 스택이있는 Lif 파일은 종종 300-400 메가 바이트 크기입니다. RAM이 낮은 컴퓨터에서이러한 파일을 몇 개 열면 ImageJ에서 사용 가능한 RAM이 빠르게 고갈되고 추가 이미지 처리를 방지할 수 있습니다. 가상 스택은 '읽기 전용'이며 처리를 위해 높은 RAM이 필요하지 않으며 피지에 큰 데이터 집합을 로드하는 데 이상적인 옵션입니다.
3. ImageJ에 표시되는 멀티채널 이미지를 관찰합니다. 이미지 | 색상 | 채널 도구를 사용하여 메뉴 표시줄에서 채널의 색상을 변경합니다. 미란다 로 표시된 NB를 CB 영역에서 큰 둥근 셀로 관찰한다.
4. NB를 두 번 계산하지 않도록 각 NB 위에 타원 도구를 사용하여 관심 영역(ROI)을 그립니다.
   1. ImageJ 메뉴 바에서 | 도구 | 분석 ROI 매니저. 현재 z 단면에 모든 NB를 표시하고 각 셀을 표시한 후 t를 누릅니다.
5. 현재 z 단면의 모든 NB가 표시되면 채널을 pH3 및 EdU로 변경하고 EdU 양성 NB, pH3 양성 NB, EdU 및 pH3 모두에 대해 긍정적으로 염색하는 NB및 NB를 두 마커모두에 대해 염색하지 않는 수를 수동으로 계산합니다.
6. 후속 z 섹션에서 NB를 검색하고 이전 ROI를 삭제하고 새 ROI를 추가하여 다른 스택에서 NB를 계산합니다.
7. 다음 열로 스프레드시트를 준비: 1. EdU-pH3-: 이 섹션은 세포 주기의 G0/G1 단계에 있는 이중 음수 세포를 나타낸다; 2. EdU +: 이 범주의 세포는 EdU를 통합하고 DNA 복제 (S-phase)를 겪고 있습니다. 3. EdU+ pH3+: 이러한 이중 양성 세포는 S 단계를 완료하고 G2 또는 M 단계로 진행했습니다. 4. pH3+: 이 NB는 미토시스를 겪고 있습니다.
8. 각 로브에 대해 위의 4가지 범주에 존재하는 NB의 백분율을 계산합니다. 각 범주의 NB 백분율에 대해 풀로 된 데이터를 보여주는 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 막대 그래프를 준비합니다.

결과

이중 로브 드로소필라 제3성급 애벌레 뇌는 근본적인 세포 및 발달 과정을 연구하는 모델 시스템으로 활용되고 있다^9. 현재 연구의 초점은 CB 영역의 EdU-및 pH3 표지 된 NBs에서 세포 주기 진행의 분석을위한 프로토콜을 제시하는 것이었다(도 1). CB NB는 I 형 및 유형 II로 세분화되며 특성 비대칭 분할 패턴^9을표시합니다. 각 유형 I NB 사?...

토론

EdU 통합 및 세포 투과성 아지드와의 후속 '클릭' 반응은 이전^7에서사용된 BrdU 방법에 비해 이 기술의 실질적인 이점을 제시한다. 그러나, 이러한 반응은 Cu(I) 이온에 의해 촉매화되고, 여러 염료는 이 구리 촉매의 존재에서 불안정할 수 있으며, 이는 클릭-it EdU 키트 제조업체의 권고와 같이. EdU 검출 단계를 실행한 후 면역 염색 실험이 수행되었을 때, 예상 신호 강도는 적색 채널 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
fly stocks
P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)	Bloomington stock center	#15477	P-element insertion in the third exon of Mms19
+; Mms19::eGFP, Mms19p	Generated in house		eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background
w1118	Bloomington stock center	#3605	wild-type stock (w;+;+)
Primary antibodies			Dilution
Rat anti-Miranda	Abcam	Ab197788	1/250
Rabbit anti-pH3	Cell Signaling	9701	1/200
Secondary antibodies
Goat anti-Rat Cy3	Jackson Immuno	112-165-167	1/150
Goat anti-Rat Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11077	1/500
Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A27034	1/500
Reagent/Kit
Aqua Poly/Mount mounting medium	Polysciences Inc	18606-20
Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647	Thermo Fischer Scientific	C10340
Schneider’s Drosophila medium	Thermo Fischer Scientific	21720-024
Bovine serum albumin (BSA) fraction V	Merck	10735078001
Triton X-100	Fischer Scientific	9002-93-1	non-ionic detergent
Software
Fiji (Imagej)	https://imagej.net/Fiji
Leica Application Suite (LAS X)	Leica microsystems
PRISM	Graph pad software	Version 5
Microsoft Excel	Microsoft office	2016
Equipment
Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective
Materials
Aqua Poly/Mount mounting medium			water-soluble, non-fluorescing mounting medium
Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate
Whatman filter paper