5-Etil-2'-Deoksiroridin/Fosfo-Histon H3 Drosophila Nöral Kök Hücrelerde Hücre Döngüsü İlerleme Analizi için Çift Etiketleme Protokolü

Özet

5-etil-2'-deoksiyridin (EdU) ve fosfo-histon H3 (pH3) etiketlemeli hücre döngüsü analizi, kapsamlı optimizasyon gerektirebilecek çok adımlı bir prosedürdür. Burada, farklı hücre döngüsü aşamalarındaki hücreleri ayırt etmek için görüntü analizi ve niceleme dahil olmak üzere bu prosedür için tüm adımları açıklayan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Özet

In vivo hücre döngüsü ilerleme analizi, mitoz ve DNA replikasyonunu düzenleyen genler üzerinde yapılan çalışmalarda rutin olarak yapılmaktadır. 5-Etil-2'-deoksiyridin (EdU) replikatif/S faz ilerlemesini araştırmak için kullanılırken, fosfo-histon H3'e karşı antikorlar mitotik çekirdekleri ve hücreleri işaretlemek için kullanılmıştır. Her iki etiketin birleşimi, G0/G1 (Boşluk fazı), S (çoğaltıcı) ve M (mitotik) fazlarının sınıflandırılmasını sağlar ve mitotik gen devirmelerinin veya boş mutantların hücre döngüsü ilerlemesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için önemli bir araç olarak hizmet eder. Bununla birlikte, EdU etiketli hücreleri işaretlemek için kullanılan reaktifler birkaç ikincil antikor floresan etiketiyle uyumsuzdur. Bu, birincil ve etiketli ikincil antikorların pH3-pozitif mitotik hücreleri işaretlemek için kullanıldığı immünostainingi zorlaştırır. Bu makalede, mitotik faktörleri incelemek için yoğun olarak kullanılan bir sistem olan Drosophila larva nöral kök hücrelerinde EdU ve pH3'ün çift etiketli olarak etiketlenerek kullanılması için adım adım bir protokol açıklanmaktadır. Ayrıca, etiketli hücreleri G0/G1, S, S>G2/M (S'den G2/M'ye ilerleme) ve M aşamaları olmak üzere 3 ayrı kategoride ayırmak için görüntü analizi ve niceleme için bir protokol sağlanır.

Giriş

Hücre bölünme döngüsü bir G1 fazı (ilk boşluk fazı), bir çoğaltıcı/S fazı, bir G2 (ikinci boşluk aşaması) ve bir M (mitotik) fazını içerir. Bu aşamalardan geçen hücre, sitoskeletal makinelerin hücresel transkripsiyonunda, çevirisinde ve yeniden düzenlenmesinde dramatik değişikliklere uğrar^1,2. Gelişimsel ve çevresel ipuçlarına yanıt olarak, hücreler geçici olarak bölünmeyi ve sessiz hale gelebilir (G0) veya farklılaşabilir ve kalıcı olarak³bölmeyi durdurabilir. DNA hasarı gibi diğer senaryolar erken farklılaşmaya veya apoptoz³,^4'eneden olabilir. Bu tür ipuçlarına yanıt, hücre bölünme döngüsünün bir sonraki aşamasına geçmeden önce temel hücresel süreçlerin bütünlüğünü sağlamak için bir gözetim sistemi görevi gören hücre döngüsü kontrol noktaları tarafından aracılık edilir⁵. Bu nedenle, DNA replikasyonunu düzenleyen genler, kontrol noktaları ve mitotik makineler üzerinde yapılan çalışmaların, mutant hücrelerde veya bu genlerin siRNA nakavtında oluşabilecek olası hücre döngüsü ilerleme kusurlarını analiz etmesi gerekir. Ayrıca, bu tür analizler genel hücre sağlığını ve ilaç tedavisine verilen hücresel yanıtları test etmek için kullanılabilir.

5-bromo-2'-deoksiyridin (BrdU), replikasyon sırasında DNA'ya dahil edilen bir timidin analogudur^6. Bu yöntem, S fazındaki hücreleri tanımlamak için yoğun olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, hücreler daha sonra anti-BrdU antikorları kullanılarak BrdU'nun tespit edilmesine izin vermek için sert DNA denatürasyon prosedürlerine tabi tutulur⁶. Bu sert tedavi hücresel epitoplara zarar verebilir ve immünostainleme yoluyla numunenin daha fazla karakterizesini önleyebilir. EdU dahil ve daha sonra bakır katalize, 'tıklama reaksiyonu' ile küçük, hücre geçirgen, floresan etiketli azide boyaları ile tespit sert denatürasyon prosedürleri ihtiyacını ortadan kaldırır⁷. Bu nedenle, bu yöntem BrdU şirketleşme için daha pratik bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır.

Ayrıca, pH3 mitotik / M faz hücreleri⁸için güvenilir bir işaretleyici olarak tanımlanmıştır. Histone H3, geç G2 fazında erken M fazına kadar fosforilize olan ve anafaz^8'insonuna doğru fosforilasyondan arındırılan DNA ilişkili bir çekirdek histone proteinidir. Standart immünostaining protokolleri kullanılarak pH3'ün tespit edilmesi için çeşitli ticari antikorlar kullanılabilir. Bu nedenle EdU ve pH3'ün çift boyanması, S fazındaki ve M fazlı hücrelerin tespitini sağlayacaktır. Ek olarak, G1 ve erken G2 fazındaki hücreler her iki belirteç için de olumlu leke olmaz.

Drosophila nural kök hücreler veya nöroblastlar (NB'ler), hücrelerin asimetrik olarak bölünerek aynı kendini yenileyen NB ve farklılaşma için yazılmış bir ganglion ana hücre (GMC) ürettiği iyi karakterize bir kök hücre modeli sunar⁹. Ek olarak, çeşitli genetik araçlar ve NB'ye özgü antikorlar bu sistemi genetik manipülasyon ve canlı hücre görüntüleme için uygun hale getirir. Sonuç olarak, çeşitli çalışmalar asimetrik bölünmeleri ve hücre kaderini belirlemeyi düzenleyen genleri incelemek için^NB'lerdenyararlanmıştır 9 . Larva beyninin merkezi beyninde (CB) ve optik lobunda (OL) farklı NB popülasyonları^{vardır 9;} Mevcut çalışmada CB NB'ler kullanılmıştır. Bu üçüncü instar larva CB NB'ler, mitotik mil montajlarını düzenleyen faktörleri incelemek için de uygun olan büyük hücrelerdir. Hücre döngüsü ilerleme kusurlarını analiz etmek için bir protokol bu tür çalışmalarda hayati bir araç olacaktır.

Daha önce yayınlanan protokoller, EdU dahil ve algılama¹⁰için çeşitli Alexa Fluor boyaları ile etiketlenmiş çeşitli reaksiyon bileşenleri ve azide boyaları sağlayan Click-iT EdU Alexa Fluor Hücre Çoğalma Kiti gibi ticari kitler kullandı. Bununla birlikte, bu tür kitlerle birlikte verilen reaktifler, genellikle ikincil antikorlarla kullanılan bazı floresan etiketlerle uyumlu değildir. Bu EdU tespit kiti (Alexa Fluor 647-konjuge azide boyası ile birlikte verilen Click-iT EdU Alexa Fluor Hücre Çoğalma Kiti) Drosophila üçüncü instar larva NB'lerinde test edildi ve NB'ler için bir belirteç olan pH3 ve Miranda'ya karşı antikorlarla birlikte boyama denendi. Ayrıca, NBs^11'inplazma zarında Miranda etiketlemesinin tespiti için Alexa Fluor 568 veya Cy3 etiketli ikincil antikorlar kullanılmıştır. Ancak EdU saptanması sonrasında immün yetinme yapılırken bu sekonder antikorlarla beklenen sinyal yoğunluğu ve lekelenme paterni (yayınlanmamış sonuçlar) gözlenmedi.

EdU kuruluşu için, Daul ve meslektaşları tarafından açıklanan protokol, larvaların EdU ve bromofenol mavisi (BPB)¹⁰ile karıştırılmış Kankel-Beyaz ortamı ile beslenmesini gerektiriyor. Larvalar, larva bağırsağı yutulması üzerine mavi rengiyle görülebilen EdU ve BPB çivili yiyeceklerle beslenir. Bu yöntem Mms19 fonksiyon kaybı (Mms19 ^P)üçüncü instar larvalarında EdU dahil için kullanılmış olsa da, Mms19^P larvaları görünüşe göre larva bağırsağinde neredeyse hiç mavi renk tespit edildiği için beslenmedi (yayınlanmamış sonuçlar). Mms19^P larvaları sert gelişimsel deformiteler gösterir ve sonunda üçüncü başlangıç aşamasında tutuklanır. Bu bir şekilde üçüncü instar larvaların beslenme davranışını etkileyebilir ve EdU besleme protokolünü bu gibi durumlar için uygun hale getirebilir.

Mevcut literatürü inceledikten ve temel adımların standartlaştırılması üzerinde kapsamlı bir şekilde çalıştıktan sonra, Drosophila NBs'de EdU/ pH3 çift etiketleme için alternatif bir yaklaşım önerildi, bu da EdU'yu larvalara beslemeyi gerektirmez. Önceki bir çalışmada, NB'lerdeki hücre döngüsünü analiz etmek için çift EdU / pH3 boyama kullanıldı, ancak ayrıntılı bir protokol sunmadı⁴. Bu, bu yöntemi uygulamaya çalışan laboratuvarlar için gereksiz bir engel sunar. Ayrıca, çeşitli reaktiflerin EdU kiti ile uyumluluğunu değerlendirmek ve daha fazla optimizasyon yapmak zaman alıcı bir süreç olabilir. Bu makale, parçalanmış larva beyinlerinde EdU birleşmesini ve anti-pH3 antikorları ile immünostainingi kapsayan adım adım bir protokol sunar, ardından NB'leri dört ayrı kategoriye ayırmak için konfokal mikroskopi ve görüntü analizi: G0/G1 fazı, S fazı, S>G2/M (S'den G2/M'ye ilerleme) ve M fazı. En iyi duruma getirilmesi gereken adımlar özetlenir ve büyük veri kümelerinin görüntü analizi için ipuçları sağlanır. Ek olarak, vahşi tip NB'lerdeki EdU/pH3 okuması analiz edilir ve yakın zamanda hücre döngüsü gecikmesi gösterdiği bildirilen Mms19^P NB'lerle karşılaştırılır¹¹.

Protokol

1. Click-it EdU tahlilleri için reaktiflerin ve stokların hazırlanması

NOT: Kit ve kit ile birlikte verilen reaktifler hakkında ayrıntılı bilgi için Malzeme Masası ve Tablo 1'e bakın.

1. Çözümleri hazırlamadan önce şişeleri oda sıcaklığına getirin.
2. 2 mL dimetilsüllfoksit (DMSO, bileşen C) ekleyerek 10 mM EdU (bileşen A) stok çözeltisi hazırlayın. İyice karıştırın ve -20 °C'de saklayın.
3. 70μL DMSO (bileşen C) ekleyerek Alexa Fluor 647-azide (bileşen B) çalışma çözeltisi hazırlayın. İyice karıştırın ve -20 °C'de saklayın.
4. Bu çözeltinin 4 mL'lik kısmını 36 mL deiyonize su ile karıştırarak 1x Click-iT EdU reaksiyon tamponu (bileşen D) hazırlayın. Kalan çözeltiyi 2-6 °C'de saklayın.
5. 2 mL deiyonize su ekleyerek Click-iT EdU tampon katkı maddesinin (bileşen F) 10x stokunu (200 mg/mL) yapın. İyice karıştırın ve -20 °C'de saklayın.
6. Hoechst 33342'i (G bileşeni) 2-6 °C'de saklayın. DMSO'yu (bileşen C) -20 °C'de bir kurutucuda saklayın.
   NOT: Eldivenler DMSO ve Hoechst'i idare etmek için kullanılmalıdır.

2. Üçüncü instar larva beyinlerinin diseksiyonu ve EdU şirketleşmesi

NOT: Beyin diseksiyonları protokolü daha önce tanımlanmıştır¹². Diseksiyonlara başlamadan önce, 2.6 ve 3.1'de açıklandığı gibi yeterli miktarda EdU ve PFA çözeltisinin hazırlandığından ve çözüldüğünden emin olun.

1. 25,6 g Na 2 HPO 4,7H 2 0, 80 g NaCl,₂g KCl ve₂g_KH2 PO4 ila 1 L deiyonize su ekleyerek 10x Fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın. pH'ı 7.4'e ayarlayın ve daha sonra deiyonize suda 1x'lik bir çözelti hazırlayın.
2. Schneiders diseksiyon ortamını (SM) bir camın ardışık iki çökemine (3 veya 9) çöken cam spot plaka ekleyin. Bir sonraki ardışık depresyona 1x PBS ekleyin.
3. Bir çift toparlama kullanarak, dolaşan üçüncü instar larvalarını seçin ve sinek yiyecek kalıntılarını temizlemek için PBS ile ıslanmış bir dokuya yerleştirin. Larvaları PBS ile depresyona ve daha sonra SM ile ardışık depresyona yerleştirin.
4. Bir çift ince kümes gücü kullanarak, larvaların alt gövdesinin^3/4'lerini çıkarın.
   1. Larva ağız kancalarını bir çift ön uçla hafifçe tutun ve diğer ucundaki manikürleri diğer çift asalarla tutun.
   2. Ağız kancalarını içe doğru iterek ve aynı anda diğer ucundaki dokuyu soyarak larva başını ters çevirin.
5. Ekli hayal diskleri ile larva beynini gözlemleyin. Beyne bağlı diğer dokuları çıkarın ve beyni SM ile bir sonraki ardışık depresyona aktarın.
6. 10 mM EdU stok çözümünü çözün. Bu 10 mM stoğu SM'de seyrelterek 100 μM'lik bir çözelti hazırlayın.
7. Pyrex plakasındaki başka bir çökemde bu 100 μM EdU+SM çözeltisinin 100 μL'sini ekleyin. 25 °C'de 2 saat boyunca 100 μL 100 μM EdU+SM çözeltisinde ~5-10 parçalanmış beyni kuluçkaya yatırın.
   NOT: NB'ler ~2 saat içinde bir kez bölündükçe, bu protokol bir tam hücre döngüsünü analiz etmeyi amaçlamaktadır. Sadece daha ileri adımlar için sağlam beyinler kullanın. Diseksiyon sırasında hasar gören beyinleri atın.

3. Fiksasyon ve immünostaining

1. Duman kaputunda %4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi hazırlayın.
   1. Manyetik bir karıştırıcıya yerleştirilen bir behere 80 mL 1x PBS'ye 4 g paraformaldehit tozu ekleyin ve 60 °C'ye ısıtın. PFA'yı çözmek için birkaç damla 1 N NaOH ekleyin. pH'ı kontrol edin ve gerekirse birkaç damla 1 M HCl ile 7.0'a ayarlayın.
   2. 1x PBS ile ses seviyesini 100 mL'ye ayarlayın. PFA çözeltisini aliquot ve 2-6 ° C'de 1 aya kadar saklayın. Larva beyni gibi büyük dokuların verimli bir şekilde sabitlenmesi için PFA çözümüne% 0.3 iyonik olmayan deterjan ekleyin (Malzeme Tablosunabakın).
2. EdU dahil edildikten sonra, beyinleri% 4 PFA içeren 0.6 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın. 15 dakika boyunca bir besleyici üzerinde oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Laboratuvar tezgahındaki tüpe dokunun, böylece beyinler tüpün altına yerleşir.
3. PFA'yı çıkarın ve oda sıcaklığında PBS + %0,3 iyonik olmayan deterjan (PBST) ile 3 kez yıkayın. Her yıkamanın bir besleyicide en az 10 dakika sürdüğüne emin olun. Son yıkamadan sonra PBST'yi çıkarın, blokaj çözeltisi ekleyin (PBST + % 5 sığır serum albümini) ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.
4. PBST'de Anti-Miranda antikor (1:250) ve anti-pH3 antikorlarını (1:200) seyreltin (her ikisi de aynı tüpteki antikorlar). Engelleme tamponu çıkarın ve birincil antikor çözeltisini ekleyin. Bir besleyici üzerinde 2-6 ° C'de gece boyunca kuluçkaya yatırın.
   NOT: Miranda, CB NB'lerinde bulunan bir membran proteinidir. CB bölgesindeki bu büyük yuvarlak hücreleri tanımlamaya yarar¹³.
5. Birincil antikor çözeltisini çıkarın ve PBST ile 3 kez yıkayın. Her yıkamanın oda sıcaklığında bir somun makinesinde 10 dakika sürdüğüne emin olun.
6. PBST'ye 1:500 seyreltilmiş Alexa Fluor 488 anti-Rabbit ve Alexa Fluor 568 anti-Rat ekleyerek ikincil antikor çözeltisi hazırlayın. PBST'yi çıkarın ve incelenmiş beyinlere ikincil antikor çözeltisini ekleyin. Karanlıkta 2-6 °C'de, bir besleyicide gece boyunca kuluçkaya yatırın ve PBST ile 3 kez yıkayın (adım 3.5).

4. EdU tespiti, DNA boyama ve montaj

1. EdU algılama kokteylini hazırlamak için, bileşenleri 1,5 mL'lik bir tüpte karıştırın (bkz. Tablo 2).
2. Son yıkamadan sonra (adım 3.6), PBST'yi çıkarın ve EdU algılama kokteylini parçalanmış beyinlere ekleyin. Bir fındık makinesinde 30 dakika karanlıkta oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. PBST ile her biri 10 dakika boyunca karanlıkta 2 kez yıkayın.
3. DNA boyama için, 5 μg/mL çözeltisi hazırlamak için PBST'de Hoechst 33342 (G bileşeni) 1:2.000'i seyreltin.
4. İkinci yıkamadan sonra PBST'yi çıkarın (adım 4.2) ve parçalanmış beyinlere 500 μL 5 μg/ mL Hoechst çözeltisi ekleyin. Karanlıkta 10 dakika kuluçkaya yaslanın. Hoechst'i çıkarın ve PBST ile bir kez 10 dakika yıkayın.
5. Tüpü laboratuvar tezgahına dokunun ve beyinlerin sakinleşmesine izin verin. PBST'yi tüpten çıkarın, ancak geride sadece 50-100 μL bırakın.
6. 200 μL'lik bir mikropipette ucun ucunu kesin ve beyinleri dikkatlice temiz bir cam kaydırağa aktarın. Filtre kağıdı şeritleriyle şişirerek slayttan fazla PBST'yi çıkarın. Filtre kağıdının beyinlere dokunmasına izin vermemeye dikkat edin.
7. Bir damla suda çözünür, floresan olmayan montaj ortamını beyinlere koyun ve beyinleri, ventral sinir kordonu kaydırağa, loblar yukarı bakacak şekilde yönlendirin. Beyinleri tek bir dosyada düzenleyin, böylece beyinleri seri olarak görüntüleyebilme daha kolaydır.
8. Beyinlerin üzerine hafifçe bir kapak kılıfı yerleştirin. Slaydı gece boyunca 2-6 °C'ye yerleştirin.
   NOT: Montaj ortamı gece depolamada sertleşir, böylece kapak kapağını oje ile kapatmaya gerek yoktur.

5. Görüntüleme

NOT: Bu protokolde kullanılan lazer tarama mikroskobu ve yağ daldırma hedefi hakkında ayrıntılı bilgi için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Edinme yazılımından 63x hedefiniseçin.
2. Dokuyu göz merceğinden bulmayı kolaylaştırmak için monte edilmiş beyinlerin hemen üstündeki kapak kapağına bir damla daldırma yağı koyun.
3. DAPI/Hoechst 33342 kanalını kullanarak beyni göz merceğinden bulun ve ardından yazılımdaki alım moduna geçin.
4. Hoechst 33342 (DNA), Alexa Fluor 488 (pH3), Alexa Fluor 568 (Miranda) ve Alexa Fluor 647 (EdU) görüntü için 4 kanal ayarlayın. Seçilen boyalar için heyecan lazerlerini ve emisyon filtrelerini otomatik olarak ayarlayan boya asistanı aracını kullanın.
5. Görüş alanını tüm beyin lobını kapsayacak şekilde ayarlayın. 0,8 μm aralıklı z yığınları elde ederek beyin lobunun tüm hacmini görüntüleyin. Görüntüleme oturumundaki tüm görüntüleri *.lif kitaplığı biçiminde depolayın.

6. Görüntü analizi

NOT: Aşağıdaki adımda, elde edilen görüntülerin analizi ve hücrelerin G0/G1 fazı, S fazı, S>G2/M (S'den G2/M'ye ilerleme) ve ImageJ yazılımını kullanarak M fazına nasıl sıralanılacağı açıklanmaktadır.

1. Fiji'yi (Fiji, ImageJ) aşağıdaki URL'den indirin: https://fiji.sc/. Fiji'yi açın, sonra .lif dosyalarını sürükleyip Fiji'ye bırakın.
   NOT: Fiji, imagej'ın önceden yüklenmiş olarak gelen bir sürümüdür¹⁴. .lif dosyalarını Fiji'ye aktarmak, .lif dosyalarını işlemek için gereken Bio-formatları eklentisini açacaktır. Nikon mikroskobundan oluşturulan nd2 dosyaları gibi diğer bazı mikroskop markalarından oluşturulan görüntü dosyalarını açmak için biyo-formatlar eklentisi de gereklidir. Bu eklenti Fiji ile önceden yüklenmiş olarak gelir.
2. Yığın görüntüleme sekmesinden Veri tarayıcısı'nı seçin ve biyo-formatlar eklentislerindeki bellek yönetimi sekmesinden sanal yığını kullanın.
   NOT: 8-10 beyinden z-yığınları olan Lif dosyaları genellikle 300-400 megabayt boyutundadır. Düşük RAM'li bilgisayarlarda, bu tür birkaç dosyayı açmak ImageJ'deki mevcut RAM'i hızla düşürebilir ve daha fazla görüntü işlenmesini önleyebilir. Sanal yığın 'salt okunur', işleme için yüksek RAM'e ihtiyaç duymaz ve fiji'ye büyük veri kümeleri yüklemek için ideal bir seçenektir.
3. ImageJ'de görüntülenen çok kanallı görüntüyü gözlemleyin. Görüntü | renk | kanalları aracını kullanarak menü çubuğundan kanalların renginideğiştirin. Miranda etiketli NB'leri CB bölgesindeki büyük yuvarlak hücreler olarak gözlemleyin.
4. NB'yi iki kez saymaktan kaçınmak için her NB'nin üzerine elips aracını kullanarak bir ilgi alanı (ROI) çizin.
   1. ImageJ menü çubuğundan | araçları çözümle | Yatırım getirisi yöneticisi. Geçerli z bölümündeki tüm NB'leri işaretleyin ve her hücreyi işaretledikten sonra t tuşuna basın.
5. Geçerli z bölümündeki tüm NB'ler işaretlendikten sonra, kanalları pH3 ve EdU olarak değiştirin ve EdU pozitif NB'lerin, pH3 pozitif NB'lerin, hem EdU hem de pH3 için pozitif boyama NB'lerin sayısını ve her iki işaretleyici için de NB'lerin lekelenmediğini manuel olarak sayın.
6. Sonraki z bölümlerinde NB'leri arayın, eski ROI'leri silin ve NB'leri farklı yığınlarda saymak için yeni ROI'ler ekleyin.
7. Aşağıdaki sütunlarla bir elektronik tablo hazırlayın: 1. EdU- pH3-: Bu bölüm, hücre döngüsünün G0/G1 aşamasında bulunan çift negatif hücreleri temsil eder; 2. EdU+: bu kategorideki hücreler EdU'yu bünyesine katmıştır ve DNA replikasyonu (S fazı) geçirmektedir; 3. EdU+ pH3+: bu çift pozitif hücreler S fazını tamamlamış ve G2 veya M fazı aşamasına ilerlemiş; 4. pH3+: Bu NB'ler mitoz geçiriyor.
8. Her lob için yukarıdaki 4 kategorinin tümlerinde bulunan NB'lerin yüzdelerini hesaplayın. Her kategorideki NB yüzdeleri için havuza alınan verileri gösteren elektronik tablo yazılımını kullanarak bir çubuk grafik hazırlayın.

Sonuçlar

İki loblu Drosophila üçüncü instar larva beyni, temel hücresel ve gelişimsel süreçleri incelemek için bir model sistemi olarak kullanılmıştır⁹. Mevcut çalışmanın odak noktası, CB bölgesinin EdU ve pH3 etiketli NB'lerinde hücre döngüsü ilerlemesinin analizi için bir protokol sunmaktı (Şekil 1). CB NB'leri tip I ve tip II'ye alt olarak ayrılmıştır ve karakteristik asimetrik bölme deseni⁹'u görüntülerler...

Tartışmalar

EdU şirketleşme ve hücre geçirgen azide ile sonraki 'tıklama' reaksiyonu, bu tekniğin daha önce kullanılan BrdU yöntemine göre pratik avantajlarını sunar⁷. Bununla birlikte, bu reaksiyon Cu(I) iyonları tarafından katalizöre edilir ve Click-it EdU kit üreticisi tarafından açıkça tavsiye edildiği gibi, bu bakır katalizörün varlığında birkaç boya kararsız olabilir. EdU algılama adımının gerçekleştirilmesinden sonra immünostaining deneyleri yapıldığı zaman, kır...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
fly stocks
P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)	Bloomington stock center	#15477	P-element insertion in the third exon of Mms19
+; Mms19::eGFP, Mms19p	Generated in house		eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background
w1118	Bloomington stock center	#3605	wild-type stock (w;+;+)
Primary antibodies			Dilution
Rat anti-Miranda	Abcam	Ab197788	1/250
Rabbit anti-pH3	Cell Signaling	9701	1/200
Secondary antibodies
Goat anti-Rat Cy3	Jackson Immuno	112-165-167	1/150
Goat anti-Rat Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11077	1/500
Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A27034	1/500
Reagent/Kit
Aqua Poly/Mount mounting medium	Polysciences Inc	18606-20
Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647	Thermo Fischer Scientific	C10340
Schneider’s Drosophila medium	Thermo Fischer Scientific	21720-024
Bovine serum albumin (BSA) fraction V	Merck	10735078001
Triton X-100	Fischer Scientific	9002-93-1	non-ionic detergent
Software
Fiji (Imagej)	https://imagej.net/Fiji
Leica Application Suite (LAS X)	Leica microsystems
PRISM	Graph pad software	Version 5
Microsoft Excel	Microsoft office	2016
Equipment
Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective
Materials
Aqua Poly/Mount mounting medium			water-soluble, non-fluorescing mounting medium
Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate
Whatman filter paper