Protocolo de doble marcado de 5-etinil-2'-desoxiuridina/fosfo-histona H3 para el análisis de progresión del ciclo celular en células madre neurales de Drosophila

Resumen

El análisis del ciclo celular con etiquetado de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) y fosfo-histona H3 (pH3) es un procedimiento de varios pasos que puede requerir una optimización extensa. Aquí, presentamos un protocolo detallado que describe todos los pasos para este procedimiento, incluido el análisis de imágenes y la cuantificación para distinguir las células en diferentes fases del ciclo celular.

Resumen

El análisis de progresión del ciclo celular in vivo se realiza rutinariamente en estudios sobre genes que regulan la mitosis y la replicación del ADN. La 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) se ha utilizado para investigar la progresión replicativa/fase S, mientras que los anticuerpos contra la fosfo-histona H3 se han utilizado para marcar núcleos y células mitóticas. Una combinación de ambas etiquetas permitiría la clasificación de las fases G0/G1 (fase Gap), S (replicativa) y M (mitótica) y serviría como una herramienta importante para evaluar los efectos de los derribos de genes mitóticos o mutantes nulos en la progresión del ciclo celular. Sin embargo, los reactivos utilizados para marcar las células marcadas con EdU son incompatibles con varias etiquetas fluorescentes de anticuerpos secundarios. Esto complica la inmunotinción, donde se utilizan anticuerpos primarios y secundarios marcados para marcar las células mitóticas con pH3 positivo. Este artículo describe un protocolo paso a paso para el etiquetado dual de EdU y pH3 en células madre neurales larvales de Drosophila, un sistema utilizado ampliamente para estudiar los factores mitóticos. Además, se proporciona un protocolo para el análisis y cuantificación de imágenes para asignar células etiquetadas en 3 categorías distintas, G0 / G1, S, S>G2 / M (progresión de S a G2 / M) y M fases.

Introducción

El ciclo de división celular comprende una fase G1 (primera fase de brecha), una fase replicativa/S, una G2 (segunda fase de brecha) y una fase M (mitótica). Al pasar por estas fases, la célula sufre cambios dramáticos en la transcripción celular, la traducción y la reorganización de la maquinaria citoesquelética^1,2. En respuesta a las señales ambientales y de desarrollo, las células pueden dejar de dividirse temporalmente y volverse inactivas (G0) o diferenciarse y dejar de dividirse permanentemente³. Otros escenarios, como el daño al ADN, pueden causar diferenciación prematura o apoptosis^3,4. La respuesta a tales señales está mediada por puntos de control del ciclo celular, que actúan como un sistema de vigilancia para garantizar la integridad de los procesos celulares esenciales antes de que la célula se comprometa con la siguiente fase del ciclo de división^5. Por lo tanto, los estudios sobre genes que regulan la replicación del ADN, los puntos de control y la maquinaria mitótica deben analizar los posibles defectos de progresión del ciclo celular que pueden ocurrir en las células mutantes o en el derribo de siRNA de estos genes. Además, tales análisis pueden emplearse para probar la salud celular general, así como las respuestas celulares al tratamiento farmacológico.

La 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) es un análogo de la timidina que se incorpora al ADN durante la replicación⁶. Este método se utilizó ampliamente para identificar células en fase S. Sin embargo, las células se someten a duros procedimientos de desnaturalización del ADN para permitir la detección de BrdU mediante el uso de anticuerpos anti-BrdU⁶. Este tratamiento severo puede dañar los epítopos celulares e impedir una mayor caracterización de la muestra a través de la inmunotinción. La incorporación de EdU y la posterior detección mediante una "reacción de clic" catalizada por cobre con colorantes de azida pequeños, permeables a las células y marcados fluorescentemente elimina la necesidad de procedimientos de desnaturalización severos⁷. Este método, por lo tanto, surgió como una alternativa más práctica a la incorporación de BrdU.

Además, pH3 se ha descrito como un marcador fiable para las células de fase mitóticas/M⁸. La histona H3 es una proteína histona central asociada al ADN que se fosforila alrededor de la fase G2 tardía a la fase M temprana y se desfosforila hacia el final de la anafase⁸. Se pueden utilizar varios anticuerpos comerciales para detectar pH3 utilizando protocolos estándar de inmunotinción. Por lo tanto, la tinción dual de EdU y pH3 permitiría la detección de células en fase S y fase M. Además, las células en la fase G1 y G2 temprana no se tiñen positivamente para ninguno de los marcadores.

Las células madre neurales o neuroblastos (NB) de Drosophila ofrecen un modelo de células madre bien caracterizado en el que las células se dividen asimétricamente para producir una NB autorrenovadora idéntica y una célula madre ganglionar (GMC), que está destinada a la diferenciación⁹. Además, varias herramientas genéticas y anticuerpos específicos de NB hacen que este sistema sea adecuado para la manipulación genética y las imágenes de células vivas. En consecuencia, varios estudios han utilizado NB para estudiar genes que regulan las divisiones asimétricas y la determinación del destino celular⁹. Existen distintas poblaciones de NB en el cerebro central (CB) y el lóbulo óptico (OL) del cerebro larvario⁹; Se utilizaron NB CB para el estudio actual. Estas terceras larvas de CB NB son células grandes que también son adecuadas para estudiar los factores que regulan el ensamblaje del huso mitótico. Un protocolo para analizar los defectos de progresión del ciclo celular sería una herramienta vital en tales estudios.

Los protocolos publicados anteriormente empleaban kits comerciales, como Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit, que proporcionan varios componentes de reacción y colorantes de azida etiquetados con una variedad de tintes Alexa Fluor para la incorporación y detección de EdU¹⁰. Sin embargo, los reactivos suministrados con tales kits no son compatibles con algunas etiquetas fluorescentes que a menudo se usan con anticuerpos secundarios. Este kit de detección EdU (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit suministrado con el colorante de azida conjugada Alexa Fluor 647) se probó en NB larvales de Drosophila tercer instar, y se intentó la tinción conjunta con anticuerpos contra pH3 y Miranda, un marcador para NB. Además, se utilizaron anticuerpos secundarios marcados con Alexa Fluor 568 o Cy3 para la detección del etiquetado de Miranda en la membrana plasmática de^{nbs 11}. Sin embargo, la intensidad esperada de la señal y el patrón de tinción (resultados no publicados) no se observaron con estos anticuerpos secundarios cuando se realizó la inmunotinción después de la detección de EdU.

Para la incorporación de EdU, el protocolo descrito por Daul y sus colegas requirió la alimentación de las larvas con medio Kankel-White mezclado con EdU y azul de bromofenol (BPB)¹⁰. Las larvas se alimentaron de los alimentos con picos de EdU y BPB, que se podían ver por su color azul al ingerirlos en el intestino larvario. Aunque este método se utilizó para la incorporación de EdU en mms19 pérdida de función(Mms19^P)tercera larva instar, las larvas mms19^P aparentemente no se alimentaron ya que apenas se detectó color azul en el intestino larvario (resultados no publicados). Las larvas de Mms19^P muestran deformidades drásticas del desarrollo y eventualmente se detienen en la tercera etapa de instar. Esto puede afectar de alguna manera el comportamiento de alimentación de las larvas de la tercera instar y hacer que el protocolo de alimentación EdU no sea adecuado para tales casos.

Después de estudiar la literatura disponible y trabajar extensamente en la estandarización de pasos esenciales, se propuso un enfoque alternativo para el doble etiquetado EdU / pH3 en Drosophila NBs, que no requiere alimentar EdU a las larvas. Un estudio previo empleó tinción dual EdU/pH3 para analizar el ciclo celular en NB, pero no presentó un protocolo detallado⁴. Esto presenta un obstáculo innecesario para los laboratorios que intentan implementar este método. Además, evaluar la compatibilidad de varios reactivos con el kit EdU y realizar una mayor optimización puede ser un proceso que consume mucho tiempo. Este artículo presenta un protocolo paso a paso que cubre la incorporación de EdU en cerebros larvales disecados e inmunotinción con anticuerpos anti-pH3, seguido de microscopía confocal y análisis de imágenes para asignar NB a cuatro categorías distintas: fase G0 / G1, fase S, S>G2 / M (progresión de S a G2 / M) y fase M. Se describen los pasos que necesitan optimización y se proporcionan consejos para el análisis de imágenes de grandes conjuntos de datos. Además, se analiza la lectura de EdU/pH3 en NB de tipo salvaje y se compara con los NB mms19^P, que recientemente se informó que mostraban un retraso en el ciclo celular¹¹.

Protocolo

1. Preparación de reactivos y existencias para el ensayo Click-it EdU

NOTA: Consulte la Tabla de materiales y la Tabla 1 para obtener detalles sobre el kit y los reactivos suministrados con el kit.

1. Lleve los viales a temperatura ambiente antes de preparar las soluciones.
2. Preparar una solución madre de EdU (componente A) de 10 mM añadiendo 2 ml de dimetilsulfóxido (DMSO, componente C). Mezclar bien y conservar a -20 °C.
3. Prepare una solución de trabajo de Alexa Fluor 647-azide (componente B) agregando 70μL de DMSO (componente C). Mezclar bien y conservar a -20 °C.
4. Prepare una solución 1x de tampón de reacción Click-iT EdU (componente D) mezclando 4 ml de esta solución con 36 ml de agua desionizada. Conservar la solución restante a 2-6 °C.
5. Haga un stock 10x (200 mg/mL) del aditivo tampón Click-iT EdU (componente F) agregando 2 mL de agua desionizada. Mezclar bien y conservar a -20 °C.
6. Guarde Hoechst 33342 (componente G) a 2-6 °C. Guarde DMSO (componente C) en un desecador a -20 °C.
   NOTA: Se deben usar guantes para manejar DMSO y Hoechst.

2. Disección de cerebros larvales de tercer instar e incorporación de EdU

NOTA: El protocolo para las disecciones cerebrales ha sido descrito previamente¹². Antes de comenzar las disecciones, asegúrese de que se preparan y descongelan cantidades suficientes de las soluciones de EdU y PFA como se describe en los puntos 2.6 y 3.1.

1. Prepare 10x solución salina tamponada con fosfato (PBS) agregando 25.6 g Na₂HPO₄.7H₂0, 80 g NaCl, 2 g KCl y 2 g KH₂PO4 a 1 L de agua desionizada. Ajuste el pH a 7.4 y, posteriormente, prepare una solución 1x en agua desionizada.
2. Agregue el medio de disección (SM) de Schneiders a dos depresiones consecutivas de una placa de vidrio de vidrio (3 o 9). Agregue 1x PBS a la siguiente depresión consecutiva.
3. Usando un par de fórceps, recoja las larvas errantes del tercer instar y colóquelas en un tejido humedecido con PBS para limpiar los residuos de alimentos para moscas. Coloque la larva en la depresión con PBS y luego en la depresión consecutiva con SM.
4. Usando un par de fórceps finos, retire^3/4 de la parte inferior del cuerpo de la larva.
   1. Agarre suavemente los ganchos bucales larvales con un par de fórceps y sostenga la cutícula en el otro extremo con el otro par de fórceps.
   2. Gire la cabeza de la larva al revés empujando hacia adentro los ganchos de la boca y simultáneamente despegando el tejido en el otro extremo.
5. Observe el cerebro larvario con discos imaginales adjuntos. Elimine otros tejidos adheridos al cerebro y transfiera el cerebro a la siguiente depresión consecutiva con SM.
6. Descongele la solución de stock EdU de 10 mM. Prepare una solución de 100 μM diluyendo este caldo de 10 mM en SM.
7. Añadir 100 μL de esta solución EdU+SM de 100 μM en otra depresión en la placa Pyrex. Incubar ~5-10 cerebros disecados en 100 μL de solución EdU+SM de 100 μM durante 2 h a 25 °C.
   NOTA: Como los NB se dividen una vez en ~ 2 h, este protocolo tiene como objetivo analizar un ciclo celular completo. Solo use cerebros intactos para pasos posteriores. Deseche los cerebros que se dañan durante la disección.

3. Fijación e inmunotinción

1. Prepare una solución de paraformaldehído al 4% (PFA) en una campana extractora de humos.
   1. Añadir 4 g de polvo de paraformaldehído a 80 ml de 1x PBS en un vaso de precipitados colocado en un agitador magnético y calentar a 60 °C. Para disolver el PFA, agregue unas gotas de 1 N NaOH. Compruebe el pH y ajuste a 7.0 con unas gotas de 1 M HCl si es necesario.
   2. Ajuste el volumen a 100 ml con 1x PBS. Alícuota la solución de PFA y guárdela a 2-6 °C durante un máximo de 1 mes. Agregue detergente no iónico al 0,3% (consulte la Tabla de materiales)a la solución de PFA para una fijación eficiente de tejidos grandes como el cerebro larvario.
2. Después de la incorporación de EdU, transfiera los cerebros a tubos de microcentrífuga de 0,6 ml que contengan 4% de PFA. Incubar a temperatura ambiente en un nutator durante 15 min. Golpee el tubo en el banco de laboratorio para que los cerebros se asienten en la parte inferior del tubo.
3. Retire el PFA y lave 3 veces con PBS + 0.3% detergente no iónico (PBST) a temperatura ambiente. Asegúrese de que cada lavado dure al menos 10 minutos en un nutator. Después del último lavado, retire el PBST, agregue la solución de bloqueo (PBST + 5% de albúmina sérica bovina) e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.
4. Diluir el anticuerpo anti-Miranda (1:250) y el anticuerpo anti pH3 (1:200) en PBST (ambos anticuerpos en el mismo tubo). Retire el tampón de bloqueo y agregue la solución de anticuerpos primarios. Incubar durante la noche a 2-6 °C en un nutator.
   NOTA: Miranda es una proteína de membrana presente en los CB NB. Sirve para identificar estas grandes células redondas en la región CB^13.
5. Retire la solución primaria de anticuerpos y lávese 3 veces con PBST. Asegúrese de que cada lavado dure 10 minutos en un nutator a temperatura ambiente.
6. Prepare la solución de anticuerpos secundarios agregando 1:500 Alexa Fluor 488 anti-Conejo diluido y Alexa Fluor 568 anti-Rata en PBST. Retire el PBST y agregue la solución secundaria de anticuerpos a los cerebros disecados. Incubar durante la noche a 2-6 °C en la oscuridad, en un nutator, y lavar 3 veces con PBST (paso 3.5).

4. Detección de EdU, tinción de ADN y montaje

1. Para preparar el cóctel de detección EdU, mezcle los componentes (véase la Tabla 2)en un tubo de 1,5 ml.
2. Después del último lavado (paso 3.6), retire pbST y agregue el cóctel de detección de EdU a los cerebros disecados. Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 min en un nutator. Lavar 2 veces con PBST durante 10 min cada una, en la oscuridad.
3. Para la tinción de ADN, diluya Hoechst 33342 (componente G) 1:2.000 en PBST para preparar una solución de 5 μg/ml.
4. Retire el PBST después del segundo lavado (paso 4.2) y agregue 500 μL de solución de Hoechst de 5 μg/ml a los cerebros disecados. Incubar en la oscuridad durante 10 min. Retire Hoechst, y lave una vez con PBST durante 10 min.
5. Golpee el tubo en el banco del laboratorio y deje que los cerebros se asienten. Retire el PBST del tubo, pero deje atrás solo 50-100 μL.
6. Corte el extremo de una punta de micropipeta de 200 μL y transfiera cuidadosamente los cerebros a un portaobjetos de vidrio limpio. Elimine el exceso de PBST de la diapositiva secando con tiras de papel de filtro. Tenga cuidado de no dejar que el papel de filtro toque los cerebros.
7. Coloque una gota de medio de montaje soluble en agua y no fluorescente en los cerebros y oriente los cerebros de tal manera que el cordón nervioso ventral se enfrente al tobogán y los lóbulos hacia arriba. Organice los cerebros en un solo archivo para que sea más fácil obtener imágenes de los cerebros en serie.
8. Coloque suavemente un cobertor en la parte superior de los cerebros. Coloque el tobogán a 2-6 °C durante la noche.
   NOTA: El medio de montaje se endurece durante el almacenamiento durante la noche para que no sea necesario sellar la cubierta con esmalte de uñas.

5. Imágenes

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre el microscopio de barrido láser y el objetivo de inmersión en aceite utilizado en este protocolo.

1. En el software Adquisición, seleccione el objetivo 63x.
2. Coloque una gota de aceite de inmersión en la cubierta justo encima de los cerebros montados para que sea más fácil localizar el tejido a través del ocular.
3. Usando el canal DAPI/Hoechst 33342, encuentre el cerebro a través del ocular y luego cambie al modo de adquisición en el software.
4. Configure 4 canales para obtener imágenes de Hoechst 33342 (DNA), Alexa Fluor 488 (pH3), Alexa Fluor 568 (Miranda) y Alexa Fluor 647 (EdU). Utilice la herramienta de asistente de tinte, que configura automáticamente los láseres de excitación y los filtros de emisión para los tintes seleccionados.
5. Establezca el campo de visión de tal manera que abarque todo el lóbulo del cerebro. Imagine todo el volumen del lóbulo cerebral adquiriendo pilas z espaciadas a 0,8 μm de distancia. Almacene todas las imágenes de una sesión de imágenes en un formato de biblioteca *.lif.

6. Análisis de imágenes

NOTA: Los siguientes pasos describen el análisis de las imágenes adquiridas y cómo clasificar las células en fase G0/G1, fase S, S>G2/M (progresión de S a G2/M) y fase M utilizando el software ImageJ.

1. Descargue Fiji (Fiji es ImageJ) desde la siguiente URL: https://fiji.sc/. Abra Fiji, luego arrastre y suelte los archivos .lif en Fiji.
   NOTA: Fiji es una versión de ImageJ que viene preinstalada con varios plugins¹⁴. La transferencia de archivos .lif a Fiji abrirá el complemento Bio-formats, que es necesario para procesar los archivos .lif. El complemento Bio-formats también es necesario para abrir archivos de imagen generados a partir de otras marcas de microscopios, por ejemplo, archivos nd2 generados a partir de un microscopio Nikon. Este plugin viene preinstalado con Fiji.
2. Seleccione Explorador de datos en la pestaña de visualización de la pila y use la pila virtual en la pestaña de administración de memoria en el complemento de bioformatos.
   NOTA: Los archivos Lif con pilas z de 8-10 cerebros a menudo tienen un tamaño de 300-400 megabytes. En computadoras con poca RAM, abrir algunos de estos archivos puede agotar rápidamente la RAM disponible en ImageJ y evitar cualquier procesamiento de imágenes adicional. La pila virtual es de "solo lectura", no necesita una gran cantidad de RAM para el procesamiento y es una opción ideal para cargar grandes conjuntos de datos en Fiji.
3. Observe la imagen multicanal que se muestra en ImageJ. Cambie el color de los canales desde la barra de menús mediante la herramienta Imagen | color | canales. Observe los NB marcados con Miranda como células redondas grandes en la región CB.
4. Dibuje una región de interés (ROI) utilizando la herramienta de elipse sobre cada NB para evitar contar el NB dos veces.
   1. En la barra de menús de ImageJ,seleccione analizar | herramientas | Gestor de ROI. Marque todos los NB en la sección z actual y presione t después de marcar cada celda.
5. Una vez que todos los NB en la sección z actual estén marcados, cambie los canales a pH3 y EdU, y cuente manualmente el número de NB positivos para EdU, NB positivos para pH3, NB que se tiñen positivamente tanto para EdU como para pH3, y NB que no se tiñen para ambos marcadores.
6. Busque NB en secciones z posteriores, elimine ROI antiguos y agregue rois nuevos para contar NB en diferentes pilas.
7. Preparar una hoja de cálculo con las siguientes columnas: 1. EdU- pH3-: esta sección representa las celdas doblemente negativas que se encuentran en la fase G0/G1 del ciclo celular; 2. EdU+: las células de esta categoría han incorporado EdU y están en proceso de replicación del ADN (fase S); 3. EdU+ pH3+: estas células duales positivas han completado la fase S y han progresado a la fase G2 o M; 4. pH3+: estos NB están sufriendo mitosis.
8. Calcule los porcentajes de NB presentes en todas las 4 categorías anteriores para cada lóbulo. Prepare un gráfico de barras utilizando el software de hoja de cálculo que muestre los datos agrupados para los porcentajes de NB en cada categoría.

Resultados

El cerebro larvario bilobulado de Drosophila tercer instar se ha utilizado como sistema modelo para estudiar los procesos celulares y de desarrollo fundamentales⁹. El objetivo del presente estudio fue presentar un protocolo para el análisis de la progresión del ciclo celular en NB marcados con EdU y pH3 de la región CB(Figura 1). Los CB NB se subdividen en tipo I y tipo II, y muestran el patrón de división asimétrica característico⁹

Discusión

La incorporación de EdU y su posterior reacción de 'clic' con azida permeable a células presenta ventajas prácticas de esta técnica sobre el método BrdU utilizado anteriormente⁷. Sin embargo, esta reacción es catalizada por iones Cu(I), y varios colorantes pueden ser inestables en presencia de este catalizador de cobre, como lo aconseja claramente el fabricante del kit Click-it EdU. Cuando se realizaron experimentos de inmunotinción después de ejecutar el paso de detección de EdU, no se ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
fly stocks
P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)	Bloomington stock center	#15477	P-element insertion in the third exon of Mms19
+; Mms19::eGFP, Mms19p	Generated in house		eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background
w1118	Bloomington stock center	#3605	wild-type stock (w;+;+)
Primary antibodies			Dilution
Rat anti-Miranda	Abcam	Ab197788	1/250
Rabbit anti-pH3	Cell Signaling	9701	1/200
Secondary antibodies
Goat anti-Rat Cy3	Jackson Immuno	112-165-167	1/150
Goat anti-Rat Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11077	1/500
Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A27034	1/500
Reagent/Kit
Aqua Poly/Mount mounting medium	Polysciences Inc	18606-20
Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647	Thermo Fischer Scientific	C10340
Schneider’s Drosophila medium	Thermo Fischer Scientific	21720-024
Bovine serum albumin (BSA) fraction V	Merck	10735078001
Triton X-100	Fischer Scientific	9002-93-1	non-ionic detergent
Software
Fiji (Imagej)	https://imagej.net/Fiji
Leica Application Suite (LAS X)	Leica microsystems
PRISM	Graph pad software	Version 5
Microsoft Excel	Microsoft office	2016
Equipment
Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective
Materials
Aqua Poly/Mount mounting medium			water-soluble, non-fluorescing mounting medium
Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate
Whatman filter paper