5-этинил-2'-дезоксиуридин / фосфо-гистон H3 Двойной протокол маркировки для анализа прогрессирования клеточного цикла в нервных стволовых клетках дрозофилы

Резюме

Анализ клеточного цикла с маркировкой 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU) и фосфогистона H3 (pH3) является многоэтапной процедурой, которая может потребовать обширной оптимизации. Здесь мы представляем подробный протокол, который описывает все этапы этой процедуры, включая анализ изображений и количественную оценку для различения клеток в разных фазах клеточного цикла.

Аннотация

Анализ прогрессирования клеточного цикла in vivo обычно проводится в исследованиях генов, регулирующих митоз и репликацию ДНК. 5-этинил-2'-дезоксиуридин (EdU) был использован для исследования репликативного / S-фазного прогрессирования, тогда как антитела против фосфогистона H3 были использованы для маркировки митотических ядер и клеток. Комбинация обеих меток позволит классифицировать фазы G0 /G1 (фаза разрыва), S (репликативная) и M (митотическая) фазы и послужит важным инструментом для оценки влияния митотических нокдаунов генов или нулевых мутантов на прогрессирование клеточного цикла. Однако реагенты, используемые для маркировки клеток, меченных EdU, несовместимы с несколькими вторичными антителами-флуоресцентными метками. Это усложняет иммуноокрашивание, когда первичные и меченые вторичные антитела используются для маркировки pH3-положительных митотических клеток. В этой статье описывается пошаговый протокол двойной маркировки EdU и pH3 в нервных стволовых клетках личинок Drosophila, система, широко используемая для изучения митотических факторов. Кроме того, предоставляется протокол для анализа и количественной оценки изображений для выделения меченых клеток в 3 различных категориях: G0/ G1, S, S>G2 / M (прогрессия от S до G2 / M) и M фаз.

Введение

Цикл деления клеток включает фазу G1 (первая фаза зазора), репликативную/S-фазу, G2 (вторая фаза разрыва) и M(митотическую) фазу. Проходя через эти фазы, клетка претерпевает драматические изменения в клеточной транскрипции, трансляции и реорганизации цитоскелетного аппарата^1,2. В ответ на сигналы развития и окружающей среды клетки могут временно перестать делиться и становиться покоящимися (G0) или дифференцироваться и постоянно переставать делиться^3. Другие сценарии, такие как повреждение ДНК, могут вызвать преждевременную дифференцировку или апоптоз^3,4. Реакция на такие сигналы опосредована контрольными точками клеточного цикла, которые действуют как система наблюдения для обеспечения целостности основных клеточных процессов до того, как клетка перейдет к следующей фазе цикла деления^5. Поэтому исследования генов, регулирующих репликацию ДНК, контрольные точки и митотический механизм, должны анализировать возможные дефекты прогрессирования клеточного цикла, которые могут возникать в мутантных клетках или при нокдауне siRNA этих генов. Кроме того, такие анализы могут быть использованы для проверки общего здоровья клеток, а также клеточных реакций на медикаментозное лечение.

5-бром-2'-дезоксиуридин (BrdU) является аналогом тимидина, который включается в ДНК во время репликации^6. Этот метод широко использовался для идентификации клеток в S-фазе. Однако затем клетки подвергаются жестким процедурам денатурации ДНК, чтобы позволить обнаружить BrdU с помощью антител против BrdU^6. Это жесткое лечение может повредить клеточные эпитопы и предотвратить дальнейшую характеристику образца путем иммуноокрашивания. Включение EdU и последующее обнаружение катализируемой медью «щелкающей реакции» с небольшими, проницаемыми клетками, флуоресцентно мечеными азидными красителями устраняет необходимость в жестких процедурах денатурации^7. Таким образом, этот метод стал более практичной альтернативой инкорпорации BrdU.

Кроме того, pH3 был описан как надежный маркер для митотических /М фазовых клеток^8. Гистон H3 представляет собой ДНК-ассоциированный основной гистоновый белок, который фосфорилируется примерно в конце фазы G2 до ранней фазы M и дефосфорилируется к концу анафазы^8. Несколько коммерческих антител могут быть использованы для обнаружения pH3 с использованием стандартных протоколов иммуноокрашения. Таким образом, двойное окрашивание EdU и pH3 позволит обнаруживать клетки как в S-фазе, так и в М-фазе. Кроме того, клетки в фазе G1 и ранней фазе G2 не окрашиваются положительно ни для одного из маркеров.

Нервные стволовые клетки Drosophila или нейробласты (NB) предлагают хорошо охарактеризованную модель стволовых клеток, в которой клетки делятся асимметрично, чтобы произвести один идентичный самообновляющийся NB и ганглиозную материнскую клетку (GMC), которая предназначена для дифференцировки^9. Кроме того, несколько генетических инструментов и NB-специфических антител делают эту систему подходящей для генетических манипуляций и визуализации живых клеток. Следовательно, в нескольких исследованиях использовались NB для изучения генов, регулирующих асимметричные деления и определение судьбы клеток^9. Различные популяции NB существуют в центральном мозге (CB) и зрительной доле (OL) личиночного мозга^9; Для текущего исследования использовались CB NB. Эти третьи личинки CB NB представляют собой крупные клетки, которые также подходят для изучения факторов, регулирующих сборку митотического веретена. Протокол для анализа дефектов прогрессирования клеточного цикла будет жизненно важным инструментом в таких исследованиях.

Протоколы, опубликованные ранее, использовали коммерческие наборы, такие как Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit, которые предоставляют несколько реакционных компонентов и азидных красителей, помеченных различными красителями Alexa Fluor для включения и обнаружения^{EdU 10.} Однако реагенты, поставляемые с такими наборами, не совместимы с некоторыми флуоресцентными метками, часто используемыми со вторичными антителами. Этот набор для обнаружения EdU (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit, поставляемый с Alexa Fluor 647-конъюгированным азидным красителем) был протестирован на Drosophila third instar NB, и было предпринято совместное окрашивание антителами против pH3 и Miranda, маркером для NB. Кроме того, вторичные антитела, помеченные Alexa Fluor 568 или Cy3, были использованы для обнаружения маркировки Miranda на плазматической мембране NBs^11. Однако ожидаемая интенсивность сигнала и картина окрашивания (неопубликованные результаты) не наблюдались с этими вторичными антителами при иммуноокрашивании после обнаружения EdU.

Для включения EdU протокол, описанный Даулом и его коллегами, требовал кормления личинок средой Канкеля-Уайта, смешанной с EdU и бромфеноловым синим (BPB)^10. Личинки питались пищей с шипами EdU и BPB, что можно было увидеть по их синему цвету при проглатывании в личиночном кишечнике. Хотя этот метод был использован для включения EdU в mms19 потеря функции(Mms19^P)третьими личинками звезды, личинки Mms19^P, по-видимому, не питались, поскольку в личиночной кишке почти не было обнаружено синего цвета (неопубликованные результаты). Личинки Mms19^P демонстрируют резкие деформации развития и в конечном итоге останавливаются на третьей стадии. Это может каким-то образом повлиять на пищевое поведение личинок третьей звезды и сделать протокол кормления EdU непригодным для таких случаев.

После изучения имеющейся литературы и обширной работы над стандартизацией основных этапов был предложен альтернативный подход для двойной маркировки EdU/pH3 у Drosophila NBs, которая не требует кормления EdU личинкам. Предыдущее исследование использовало двойное окрашивание EdU/pH3 для анализа клеточного цикла в NB, но не представило подробного протокола^4. Это представляет собой ненужное препятствие для лабораторий, пытающихся реализовать этот метод. Кроме того, оценка совместимости различных реагентов с комплектом EdU и выполнение дальнейшей оптимизации могут быть трудоемким процессом. В этой статье представлен пошаговый протокол, который охватывает включение EdU в рассеченный личиночный мозг и иммуноокрашивание антителами против pH3, за которым следует конфокальная микроскопия и анализ изображений для выделения NB по четырем различным категориям: фаза G0 / G1, фаза S, S>G2 / M (прогрессия от S до G2 / M) и фаза M. Описаны шаги, требующие оптимизации, и приведены советы по анализу изображений больших наборов данных. Кроме того, анализируются показания EdU/pH3 в НБ дикого типа и сравниваются с Mms19^P NB, которые, как недавно сообщалось, показывают задержку клеточного цикла^11.

протокол

1. Подготовка реагентов и запасов для анализа Click-it EdU

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробную информацию о комплекте и реагентах, поставляемых с комплектом, см. в Таблице материалов и Таблице 1.

1. Доведите флаконы до комнатной температуры перед приготовлением растворов.
2. Готовят 10 мМ EdU (компонент А) стокового раствора, добавляя 2 мл диметилсульфоксида (ДМСО, компонент С). Хорошо перемешать и хранить при -20 °C.
3. Готовят рабочий раствор Alexa Fluor 647-азида (компонент B) путем добавления 70 мкл DMSO (компонент C). Хорошо перемешать и хранить при -20 °C.
4. Готовят 1-кратный раствор реакционного буфера Click-iT EdU (компонент D), смешивая 4 мл этого раствора с 36 мл деионизированной воды. Хранить оставшийся раствор при 2-6 °C.
5. Сделайте 10-кратный запас (200 мг/мл) буферной добавки Click-iT EdU (компонент F), добавив 2 мл деионизированной воды. Хорошо перемешать и хранить при -20 °C.
6. Хранить Hoechst 33342 (компонент G) при температуре 2-6 °C. Хранить ДМСО (компонент С) в осушителе при -20 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перчатки следует использовать для обработки DMSO и Hoechst.

2. Рассечение мозга личинок третьей звезды и инкорпорация EdU

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол для рассечения мозга был описан^{ранее 12}. Перед началом вскрытия убедитесь, что подготовлено и разморожено достаточное количество растворов EdU и PFA, как описано в 2.6 и 3.1.

1. Приготовьте 10x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), добавив 25,6 г Na₂HPO_{4.7H 2}0, 80 г NaCl, 2 г KCl и 2 г KH₂PO4 к 1 л деионизированной воды. Отрегулируйте рН до 7,4, а затем приготовьте 1-кратный раствор в деионизированной воде.
2. Добавьте среду рассечения Schneiders (SM) к двум последовательным углублениям стеклянной (3 или 9) пластины с депрессионным стеклом. Добавьте 1x PBS к следующему последовательному депрессии.
3. Используя пару щипцов, соберите блуждающих личинок третьей звезды и поместите на ткань, смочещенную PBS, чтобы очистить остатки пищи мухи. Поместите личинку в депрессию с PBS, а затем в последовательную депрессию с SM.
4. Используя пару мелких щипцов, удалите^3/4 нижней части тела личинки.
   1. Осторожно схватите личиночные крючки рта одной парой щипцов, а другой парой щипцов удерживайте кутикулу.
   2. Выверните личиночную головку наизнанку, протолкнув внутрь ротовые крючки и одновременно отклеив ткань на другом конце.
5. Понаблюдайте за личиночным мозгом с прикрепленными воображаемыми дисками. Удалите другие ткани, прикрепленные к мозгу, и переведите мозг к следующей последовательной депрессии с SM.
6. Разморозьте 10 мМ EdU. Приготовьте раствор 100 мкМ, разбавляя этот запас 10 мМ в СМ.
7. Добавьте 100 мкл этого 100 мкМ раствора EdU+SM в другое углубление на пластине Pyrex. Инкубируют ~5-10 рассеченных мозгов в 100 мкл 100 мкМ раствора ЭдУ+СМ в течение 2 ч при 25 °С.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку NB делятся один раз в ~ 2 ч, этот протокол направлен на анализ одного полного клеточного цикла. Используйте только неповрежденный мозг для дальнейших шагов. Отбросьте мозги, которые повреждены во время рассечения.

3. Фиксация и иммуноразрашивание

1. Приготовьте 4% раствор параформальдегида (ПФА) в вытяжном шкафу.
   1. Добавьте 4 г порошка параформальдегида в 80 мл 1x PBS в стакан, помещенный на магнитную мешалку, и нагрейте до 60 °C. Чтобы растворить PFA, добавьте несколько капель 1 N NaOH. Проверьте pH и отрегулируйте до 7,0 с помощью нескольких капель 1 M HCl, если это необходимо.
   2. Отрегулируйте громкость до 100 мл с 1x PBS. Аликвот раствор ПФА и хранить при 2-6 °C до 1 месяца. Добавьте 0,3% неионное моющее средство (см. Таблицу материалов)в раствор PFA для эффективной фиксации крупных тканей, таких как личиночный мозг.
2. После включения EdU переведите мозг в микроцентрифужные трубки объемом 0,6 мл, содержащие 4% PFA. Инкубировать при комнатной температуре на питателе в течение 15 мин. Постучите по трубке на лабораторном стенде так, чтобы мозги расположились на дне трубки.
3. Снимите PFA и смойте 3 раза PBS + 0,3% неионным моющим средством (PBST) при комнатной температуре. Убедитесь, что каждая стирка длится не менее 10 минут на нутаторе. После последней промывки удалить ПБСТ, добавить блокирующий раствор (ПБСТ + 5% бычий сывороточный альбумин) и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
4. Разбавляют анти-Мирандовое антитело (1:250) и антитело против рН3 (1:200) в ПБСТ (оба антитела в одной пробирке). Удалите блокирующий буфер и добавьте раствор первичного антитела. Инкубировать на ночь при 2-6 °C на нутаторе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Миранда является мембранным белком, присутствующим на CB NB. Он служит для идентификации этих больших круглых клеток в области CB^13.
5. Удалить раствор первичных антител и промыть 3 раза ПБСТ. Убедитесь, что каждая стирка длится в течение 10 минут на нутаторе при комнатной температуре.
6. Готовят раствор вторичных антител, добавляя 1:500 разбавленных Alexa Fluor 488 против кролика и Alexa Fluor 568 против крыс в PBST. Удалите PBST и добавьте раствор вторичных антител к рассеченному мозгу. Инкубировать на ночь при 2-6 °C в темноте, на нутаторе, и промыть 3 раза PBST (шаг 3,5).

4. Обнаружение EdU, окрашивание ДНК и монтаж

1. Для приготовления коктейля обнаружения EdU смешайте компоненты (см. таблицу 2)в пробирке объемом 1,5 мл.
2. После последней промывки (шаг 3.6) удалите PBST и добавьте коктейль обнаружения EdU в рассеченный мозг. Инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 30 мин на нутризаторе. Промыть 2 раза ПБСТ по 10 мин, в темное время суток.
3. Для окрашивания ДНК разбавьте Hoechst 33342 (компонент G) 1:2000 в PBST для получения раствора 5 мкг/мл.
4. Удаляют PBST после второй промывки (этап 4.2) и добавляют 500 мкл 5 мкг/мл раствора Hoechst в рассеченный мозг. Инкубировать в темноте в течение 10 мин. Удалить Hoechst, и промыть один раз с PBST в течение 10 мин.
5. Нажмите трубку на лабораторный стенд, и пусть мозги успокоятся. Извлеките ПБСТ из пробирки, но оставьте после себя только 50-100 мкл.
6. Вырежьте конец наконечника микропипетки объемом 200 мкл и аккуратно перенесите мозги на чистый стеклянный слайд. Удалите лишний PBST со слайда, промокнув полосками фильтровальной бумаги. Будьте осторожны, чтобы не позволить фильтровальной бумаге коснуться мозга.
7. Поместите каплю водорастворимой, нефлуоресцентной монтажной среды на мозг и сориентируйте мозг так, чтобы вентральный нервный шнур был обращен к скольжению, а лопасти — вверх. Расположите мозг в одном файле, чтобы было легче изображать мозг последовательно.
8. Аккуратно поместите обшивку поверх мозга. Поместите горку при температуре 2-6 °C на ночь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Монтажная среда затвердевает при ночном хранении, так что нет необходимости герметизировать крышку лаком для ногтей.

5. Визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации о лазерном сканирующем микроскопе и масляно-погружном объективе, используемом в этом протоколе.

1. В программном обеспечении для сбора выберите цель 63x.
2. Нанесите каплю погружного масла на крышку чуть выше установленных мозгов, чтобы было легче найти ткань через окуляр.
3. Используя канал DAPI/Hoechst 33342, найдите мозг через окуляр, а затем переключитесь в режим сбора в программном обеспечении.
4. Настройте 4 канала для изображения Hoechst 33342 (ДНК), Alexa Fluor 488 (pH3), Alexa Fluor 568 (Miranda) и Alexa Fluor 647 (EdU). Используйте инструмент dye-assistant, который автоматически настраивает лазеры возбуждения и эмиссионные фильтры для выбранных красителей.
5. Установите поле зрения таким образом, чтобы оно охватывало всю долю мозга. Представьте себе весь объем доли мозга, получив z-стеки, расположенные на расстоянии 0,8 мкм друг от друга. Храните все изображения из сеанса обработки изображений в формате библиотеки *.lif.

6. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги описывают анализ полученных изображений и способы сортировки клеток на фазу G0 / G1, фазу S, S>G2 / M (прогрессия от S до G2 / M) и фазу M с помощью программного обеспечения ImageJ.

1. Загрузите Fiji (Fiji is ImageJ) по следующему URL-адресу: https://fiji.sc/. Откройте Fiji, а затем перетащите файлы .lif на Фиджи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Fiji - это версия ImageJ, которая поставляется с предустановленными с несколькими плагинами¹⁴. Передача файлов .lif на Фиджи откроет плагин Bio-formats, который необходим для обработки файлов .lif. Плагин bio-formats также необходим для открытия файлов изображений, сгенерированных из некоторых других марок микроскопов, например, файлов nd2, сгенерированных из микроскопа Nikon. Этот плагин поставляется с предустановленным с Фиджи.
2. Выберите Браузер данных на вкладке просмотра стека и используйте виртуальный стек на вкладке управления памятью в плагине биоформатов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Lif файлы с z-стеками от 8-10 мозгов часто имеют размер 300-400 мегабайт. На компьютерах с низким объемом оперативной памяти открытие нескольких таких файлов может быстро истощить доступную оперативную память на ImageJ и предотвратить дальнейшую обработку изображений. Виртуальный стек является «доступным только для чтения», не требует большого объема оперативной памяти для обработки и является идеальным вариантом для загрузки больших наборов данных на Фиджи.
3. Наблюдайте за многоканальным изображением, отображаемым в ImageJ. Измените цвет каналов из строки меню с помощью инструмента «Изображение | цвет | каналы». Наблюдайте за помеченными Мирандой NB как большими круглыми клетками в области CB.
4. Нарисуйте интересующую область (ROI) с помощью инструмента эллипс над каждым NB, чтобы избежать подсчета NB дважды.
   1. В строке меню ImageJвыберите анализ инструментов | | Менеджер roi. Отметьте все NB в текущем z-сечении и нажмите клавишу t после пометки каждой ячейки.
5. После того, как все NB в текущем z-сечении помечены, измените каналы на pH3 и EdU и вручную подсчитайте количество EdU-положительных NB, pH3-положительных NB, NB, окрашивающихся положительно как для EdU, так и для pH3, и NB, не окрашивающихся для обоих маркеров.
6. Поиск NB в последующих z-разделах, удаление старых ROI и добавление новых ROI для подсчета NB в разных стеках.
7. Подготовьте электронную таблицу со следующими столбцами: 1. EdU-pH3-: в этом разделе представлены двойные отрицательные клетки, которые находятся в фазе G0/G1 клеточного цикла; 2. EdU+: клетки этой категории включили EdU и проходят репликацию ДНК (S-фаза); 3. EdU+ pH3+: эти двойные положительные клетки завершили S-фазу и перешли в фазу G2 или M; 4. pH3+: эти NB подвергаются митозу.
8. Рассчитайте процентное содержание NB, присутствующих во всех вышеуказанных 4 категориях для каждой доли. Подготовьте гистограмму с помощью программного обеспечения для работы с электронными таблицами, показывающую объединенные данные для процентов NB в каждой категории.

Результаты

Двулопастный мозг drosophila third instar larval был использован в качестве модельной системы для изучения фундаментальных клеточных процессов и процессов развития^9. Основное внимание в текущем исследовании было уделено представлению протокола для анализа прогрессирования клет...

Обсуждение

Инкорпорация EdU и ее последующая «щелкающая» реакция с проницаемым в клетки азидом представляют практические преимущества этой методики по сравнению с методом BrdU, используемым^{ранее 7.} Однако эта реакция катализируется ионами Cu(I), и некоторые красители могут быть нестабил?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
fly stocks
P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)	Bloomington stock center	#15477	P-element insertion in the third exon of Mms19
+; Mms19::eGFP, Mms19p	Generated in house		eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background
w1118	Bloomington stock center	#3605	wild-type stock (w;+;+)
Primary antibodies			Dilution
Rat anti-Miranda	Abcam	Ab197788	1/250
Rabbit anti-pH3	Cell Signaling	9701	1/200
Secondary antibodies
Goat anti-Rat Cy3	Jackson Immuno	112-165-167	1/150
Goat anti-Rat Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11077	1/500
Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A27034	1/500
Reagent/Kit
Aqua Poly/Mount mounting medium	Polysciences Inc	18606-20
Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647	Thermo Fischer Scientific	C10340
Schneider’s Drosophila medium	Thermo Fischer Scientific	21720-024
Bovine serum albumin (BSA) fraction V	Merck	10735078001
Triton X-100	Fischer Scientific	9002-93-1	non-ionic detergent
Software
Fiji (Imagej)	https://imagej.net/Fiji
Leica Application Suite (LAS X)	Leica microsystems
PRISM	Graph pad software	Version 5
Microsoft Excel	Microsoft office	2016
Equipment
Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective
Materials
Aqua Poly/Mount mounting medium			water-soluble, non-fluorescing mounting medium
Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate
Whatman filter paper