三维胶原基质支架植入作为肝脏再生策略

摘要

肝脏疾病是由许多促进纤维化或肝硬化的原因引起的。移植是恢复健康的唯一选择。然而，鉴于可移植器官的稀缺性，必须探索替代方案。我们的研究提出了从动物模型中将胶原支架植入肝脏组织。

摘要

肝病是全球死亡的主要原因。过量饮酒、高脂肪饮食和丙型肝炎病毒感染会促进纤维化、肝硬化和/或肝细胞癌。肝移植是临床推荐的手术，以改善和延长晚期疾病患者的寿命。然而，只有10%的移植是成功的，器官可用性，术前和术后手术以及与该结果直接相关的成本升高。细胞外基质（ECM）支架已成为组织修复的替代方案。生物相容性和接枝接受度是这些生物材料的主要有益特征。尽管在肝脏切除术模型中已经评估了恢复肝脏大小和正确功能的能力，但尚未评估使用支架或某种支持来替换已消失的肝脏肿块的体积。

在大鼠肝脏中进行部分肝切除术，从牛髁异种植入胶原基质支架（CMS）。切除左肝叶组织（约40%），手术植入相同比例的CMS。在手术前后评估肝功能检查。第3天，第14天和第21天后，对动物实施安乐死，并进行宏观和组织学评估。在第3天和第14天，在CMS周围观察到脂肪组织，没有排斥或感染的临床证据，第21天的血管新形成和CMS重吸收也是如此。有组织学证据表明，炎症过程和邻近细胞向CMS的迁移是微不足道的，用苏木精和曙红（H&E）以及Masson的三色染色观察到。CMS被证明在肝组织中表现良好，可能是研究慢性肝病组织再生和修复的有用替代方案。

引言

肝脏是参与维持体内平衡和蛋白质产生的最重要器官之一¹。不幸的是，肝病是全球死亡的主要原因。在肝损伤的晚期阶段，包括肝硬化和肝细胞癌，肝移植是临床推荐的程序。然而，由于供体的稀缺和成功移植率低，组织工程（TE）和再生医学（RM）的新技术已经开发出来^2，3。

TE涉及使用干细胞，支架和生长因子⁴来促进发炎，纤维化和水肿器官和组织的恢复^1，5，6。支架中使用的生物材料模仿天然ECM，为引导细胞重塑提供物理，化学和生物线索^7。胶原蛋白是从真皮，肌腱，肠和心包^8，9中获得的最丰富的蛋白质之一。此外，胶原蛋白可以作为生物聚合物获得，通过生物打印或静电纺丝产生二维和三维支架^10，11。该小组是第一个报告使用骨源胶原蛋白进行肝组织再生的组织。另一项研究报告了使用从牛胶原蛋白合成的支架，该支架是从皮肤获得的，具有均匀且紧密排列的毛孔，它们之间没有任何通讯¹²。

去细胞化保留了天然的ECM，允许随后掺入具有干细胞电位的细胞^13，14。然而，该程序仍处于实验阶段，在肝脏，心脏，肾脏，小肠和膀胱中来自小鼠，大鼠，兔子，猪，羊，牛和马^3，14。目前，切除的肝脏质量体积在任何动物肝切除术模型中都没有被替换。然而，使用额外的支持或网络（生物材料）使细胞增殖和血管生成对于迅速恢复肝实质功能可能是必不可少的。因此，支架可以用作再生或修复慢性肝病组织的替代方法，从而消除由于捐赠和肝移植的临床并发症而产生的局限性。

研究方案

本研究已获得墨西哥国立自治大学医学院伦理委员会（DI/115/2015）和墨西哥总医院伦理委员会（CI/314/15）的批准。该机构符合实验动物生产，护理和使用的所有技术规范，并通过了国家法律（NOM-062-ZOO-1999）的法律认证。本研究从墨西哥国立自治大学医学院实验动物设施获得体重150-250克（6-8周龄）的雄性Wistar大鼠。

1. 从牛股骨获得胶原基质支架

1. 从墨西哥卫生和农业当局认证的屠宰场从牛股骨获得髁突。
   1. 用手术器械仔细解剖髁突脂肪、肌肉和软骨。使用锯切刀将髁突碎片切成3 cm x 3 cm的碎片，并用毛巾清洁脂肪和血液。用水清洗髁突碎片。
   2. 用1L阴离子洗涤剂（10g / L）煮沸（92°C）片段30分钟。将髁突碎片洗涤两次，以除去阴离子洗涤剂的任何残留物。
   3. 使用滤纸（0.5毫米）干燥髁突碎片3小时。
2. 准备一个三角形（1厘米x1厘米x1厘米）CMS，厚度为0.5厘米，距离步骤1.1中提到的碎片（图1A）。
   1. 在100 mL 0.5 M HCl中脱矿质10分钟，不断搅拌。取出盐酸盐。
      注意:用氢氧化钠（10 M）中和HCl。
   2. 用100 mL蒸馏水冲洗碎片三次，每次15分钟，不断搅拌。用滤纸（0.5毫米）干燥CMS1小时。
   3. 使用立体显微镜¹⁵分析CMS的结构特性（孔的大小，孔隙形成和多孔互连）（图1B）。
   4. 使用扫描电子显微镜¹⁶分析CMS小梁的粗糙表面（图1C）。
   5. 使用解剖仪器进行混合和拉伸，以评估CMS的机械变化（可塑性和柔韧性）（图1D）。
   6. 将CMS装入灭菌袋中，并用过氧化氢等离子体灭菌38分钟。将无菌CMS存放在20-25°C的干燥区域的原始包装中，直到使用。

2. 手术区域的准备以及动物模型的处理和准备

1. 用2%氯己定溶液消毒手术区域，工作台，显微手术显微镜和座椅。通过热灭菌对所有手术器械、手术海绵、拭子和一次性手术悬垂物进行灭菌 （121 °C/30 分钟/100 kPa）
2. 将大鼠（n = 5）分为三组，每组五只大鼠:1.假，2.肝切除术和3.肝切除术加CMS，并在第3天，第14天和第21天跟踪所有组。
   1. 在后肢肌内注射氯胺酮（35 mg / kg）和木拉嗪（2.5 mg / kg）。
      注意:镇静期通常持续30-40分钟。
   2. 使用手术肥皂和双刃刀片剃须腹部皮肤（5 cm x 2 cm），并使用局部10%聚维酮碘溶液在三轮中消毒皮肤¹⁷。
   3. 将动物放在位于背侧卧位的温板上，颈部过度伸展以保持可通透的气道（图2）。
   4. 通过呼吸模式评估麻醉深度和四肢戒断反射的丧失。
   5. 在剃须的皮肤周围放置一次性手术悬垂物，并用手术刀在白化线上做一个切口（2.5厘米），使用xiphoid工艺作为参考点。避免腹壁血管，防止出血。
   6. 将腹部牵开器放置到位并观察腹腔。使用解剖镊子，提取左肝叶并将其放在金属板上（图3A）。
      注意:在假组中，仅提取左肝叶，然后将肝脏返回腹腔。用3-0尼龙缝合腹壁和皮肤。
   7. 在有和没有CMS的实验组中，使用手术刀刀片和无菌手术刀刀片（#15）进行肝切除术（约40%），并进行两次切割。使用三角形金属模板（1 cm x 1 cm x 1 cm）进行肝切除术（图3B）。
   8. 为了防止肝脏出血，用拭子在肝脏边缘保持手术按压5分钟。
   9. 在手术前将CMS在无菌盐水溶液中加水20分钟。在肝切除术部位植入CMS，在肝脏组织和CMS之间缝合四针，以防止生物材料的位移。使用7-0不可吸收的聚丙烯缝合线（图3C）。
      注意:不要在第二次手术中移除缝合线;缝合线可用作识别CMS植入部位的参考。
   10. 将肝脏放回腹腔，并用3-0尼龙缝合腹壁和皮肤。用手术浸透碘的海绵分两轮清洁手术切口。观察和监测动物的生命体征。

3. 术后护理

1. 在后肢肌内注射葡甲胺氟尼辛（2.5 mg / kg）。根据机构动物护理和使用委员会的批准管理镇痛药。
2. 为了恢复麻醉，将动物放在带有实验室动物垫料的单独聚碳酸酯盒中，该盒子位于温度控制（23°C）的无噪音区域。
3. 观察动物的恢复情况，并监测它们的水和食物消耗2小时。根据机构动物护理和使用委员会的批准，在术后监测动物。

4. 血清肝功能的评估

1. 在手术前和评估第3天，第14天和第21天从麻醉动物的侧尾静脉收集血液样本（500μL）（基线值）。
2. 在室温（23°C）下以850×g / 10分钟离心血液样品; 分离血清并将其储存在-80°C直至使用。
3. 进行一系列肝功能检查:血清白蛋白（ALB），碱性磷酸酶（ALP），丙氨酸氨基转移酶（ALT），天冬氨酸氨基转移酶（AST），总胆红素（TB）和直接胆红素（DB）（表1）。

5. 安乐死和组织管理

1. 按照上述方案对每次评估（第3天，第14天和第21天）的动物进行麻醉。
2. 通过机构动物护理和使用委员会批准的方法实施安乐死。
3. 用手术刀在 肺动脉上做一 个切口（5-6厘米），观察腹腔器官，并拍摄假体的肝切除术区域和实验组的照片，有和没有CMS。
4. 从所有研究组动物中取出肝脏样本（2 cm x 2 cm; 0.40-0.45 g），并将它们置于4%甲醛溶液中24小时，以进行随后的组织学评估。

6. 组织学分析

1. 将肝脏组织保存在4%甲醛中，并使用一系列酒精浓度（60%，70%，80%，90%，100%）使组织脱水;将它们置于二甲苯（1h）中并将它们嵌入石蜡¹⁶中。
2. 用切片机将石蜡块切成4μm厚的部分，以制备八张载玻片。
3. 执行H&E和Masson的三色染色^16。
4. 在光学显微镜下观察染色切片，以选择肝脏的代表性区域，有和没有CMS。获得4倍、10倍和40倍放大倍率的显微照片，并使用适当的软件¹⁸处理图像（参见 材料表）。

结果

骨脱矿质会影响CMS的机械性能，而不会改变其毛孔的原始形状或相互连接。CMS可以具有任何形状，因此，可以调整到所选器官或组织的大小和形状^19。在目前的协议中，我们使用三角形CMS（图1A-D）。使用大鼠模型评估CMS异种激素在肝脏中的再生能力。尽管肝脏是一个易碎和柔软的器官，但在该协议中进行的外科手术确?...

讨论

器官移植是肝纤维化或肝硬化患者的主要治疗方法。少数患者从这一程序中受益，因此有必要为等待名单上的患者提供治疗替代方案。组织工程是一种有前途的策略，采用支架和具有再生潜力^{的细胞2，4，13。}切除肝脏的一部分是该过程的关键步骤，因为该血管化器官大量出血。因此，必须进行手术床止血以防止这种并发症。?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anionic detergent	Alconox	Z273228
Biopsy cassettes	Leica	3802453
Camera DMX	Nikon	DXM1200F
Centrifuge	Eppendorf	5424
Chlorhexidine gluconate 4%	BD	372412
Cover glasses 25 mm x 40 mm	Corning	2980-224
Eosin	Sigma-Aldrich	200-M	CAS 17372-87-1
Ethyl alcohol, pure	Sigma-Aldrich	459836	CAS 64-17-5
Flunixine meglumide	MSD	Q-0273-035
Glass slides 75 mm x 25 mm	Corning	101081022
Hematoxylin	Merck	H9627	CAS 571-28-2
Hydrochloric acid 37%	Merck	339253	CAS 7647-01-0
Ketamine	Pisa agropecuaria	Q-7833-028
Light microscopy	Nikon	Microphoto-FXA
Microtainer yellow cape	Beckton Dickinson	365967
Microtome	Leica	RM2125
Model animal: Wistar rats	Universidad Nacional Autónoma de México
Nylon 3-0 (Dermalon)	Covidien	1750-41
Polypropylene 7-0	Atramat	SE867/2-60
Povidone-iodine10% cutaneous solution	Diafra SA de CV	1.37E+86
Scaning electronic microscopy	Zeiss	DSM-950
Sodium hydroxide, pellets	J. T. Baker	3722-01	CAS 1310-73-2
Software ACT-1	Nikon	Ver 2.70
Stereoscopy macroscopy	Leica	EZ4Stereo 8X-35X
Sterrad 100S	Johnson and Johnson	99970
Surgipath paraplast	Leica	39601006
Synringe of 1 mL with needle (27G x 13 mm)	SensiMedical	LAN-078-077
Tissue Processor (Histokinette)	Leica	TP1020
Tissue-Tek TEC 5 (Tissue embedder)	Sakura Finetek USA	5229
Trichrome stain kit	Sigma-Aldrich	HT15
Unicell DxC600 Analyzer	Beckman Coulter	BC 200-10
Xylazine	Pisa agropecuaria	Q-7833-099
Xylene	Sigma-Aldrich	534056	CAS 1330-20-7