Implantación de andamio de matriz de colágeno tridimensional como estrategia de regeneración hepática

Resumen

Las enfermedades hepáticas son inducidas por muchas causas que promueven la fibrosis o la cirrosis. El trasplante es la única opción para recuperar la salud. Sin embargo, dada la escasez de órganos trasplantables, se deben explorar alternativas. Nuestra investigación propone la implantación de andamios de colágeno en tejido hepático a partir de un modelo animal.

Resumen

Las enfermedades hepáticas son la principal causa de muerte en todo el mundo. El consumo excesivo de alcohol, una dieta alta en grasas y la infección por el virus de la hepatitis C promueven la fibrosis, la cirrosis y / o el carcinoma hepatocelular. El trasplante de hígado es el procedimiento clínicamente recomendado para mejorar y extender la vida útil de los pacientes en etapas avanzadas de la enfermedad. Sin embargo, solo el 10% de los trasplantes son exitosos, con disponibilidad de órganos, procedimientos prequirúrgicos y posquirúrgicos, y costos elevados directamente correlacionados con ese resultado. Los andamios de matriz extracelular (ECM) han surgido como una alternativa para la restauración de tejidos. La biocompatibilidad y la aceptación del injerto son las principales características beneficiosas de esos biomateriales. Aunque la capacidad de restaurar el tamaño y la función correcta del hígado se ha evaluado en modelos de hepatectomía hepática, no se ha evaluado el uso de andamios o algún tipo de soporte para reemplazar el volumen de la masa hepática extirpada.

La hepatectomía parcial se realizó en un hígado de rata con la xenoimplantación de un andamio de matriz de colágeno (CMS) de un cóndilo bovino. Se extirpó tejido del lóbulo hepático izquierdo (aproximadamente el 40%), y se implantó quirúrgicamente una proporción igual de CMS. Las pruebas de función hepática se evaluaron antes y después del procedimiento quirúrgico. Después de los días 3, 14 y 21, los animales fueron sacrificados y se realizaron evaluaciones macroscópicas e histológicas. En los días 3 y 14, se observó tejido adiposo alrededor del CMS, sin evidencia clínica de rechazo o infección, al igual que neoformación de vasos y reabsorción de CMS en el día 21. Hubo evidencia histológica de un proceso de inflamación insignificante y migración de células adyacentes al CMS, observado con la hematoxilina y la eosina (H&E) y la tinción tricrómica de Masson. Se demostró que el CMS funciona bien en el tejido hepático y podría ser una alternativa útil para estudiar la regeneración y reparación de tejidos en enfermedades hepáticas crónicas.

Introducción

El hígado es uno de los órganos más importantes implicados en el mantenimiento de la homeostasis y la producción de proteínas¹. Desafortunadamente, la enfermedad hepática es la principal causa de muerte en todo el mundo. En etapas avanzadas de daño hepático, que incluyen cirrosis y carcinoma hepatocelular, el trasplante de hígado es el procedimiento clínicamente recomendado. Sin embargo, debido a la escasez de donantes y la baja tasa de trasplantes exitosos, se han desarrollado nuevas técnicas en ingeniería de tejidos (TE) y medicina regenerativa (RM)^2,3.

La TE implica el uso de células madre, andamios y factores de crecimiento⁴ para promover la restauración de órganos y tejidos inflamados, fibróticos y edematosos^1,5,6. Los biomateriales utilizados en los andamios imitan la ECM nativa, proporcionando las señales físicas, químicas y biológicas para la remodelación celular guiada⁷. El colágeno es una de las proteínas más abundantes obtenidas de la dermis, tendón, intestino y pericardio^8,9. Además, el colágeno se puede obtener como biopolímero para producir andamios bidimensionales y tridimensionales mediante bioimpresión o electropinning^10,11. Este grupo es el primero en reportar el uso de colágeno de una fuente ósea para la regeneración del tejido hepático. Otro estudio reporta el uso de andamios sintetizados a partir de colágeno bovino, que se obtuvo a partir de la piel, con poros homogéneos y estrechamente situados, sin ninguna comunicación entre ellos¹².

La descelularización preserva la ECM nativa, permitiendo la posterior incorporación de células con potencial de células madre^13,14. Sin embargo, este procedimiento aún se encuentra en fase experimental en el hígado, corazón, riñón, intestino delgado y vejiga urinaria de ratones, ratas, conejos, cerdos, ovejas, bovinos y equinos^3,14. Actualmente, el volumen de masa hepática resecada no se reemplaza en ninguno de los modelos de hepatectomía animal. Sin embargo, el uso de soporte adicional o red (biomateriales) que permite la proliferación celular y la angiogénesis podría ser esencial para la pronta restauración de las funciones del parénquima hepático. Por lo tanto, los andamios podrían emplearse como enfoques alternativos para regenerar o reparar tejidos en enfermedades hepáticas crónicas, a su vez, eliminando las limitaciones debidas a la donación y las complicaciones clínicas del trasplante hepático.

Protocolo

La presente investigación fue aprobada por el comité de ética de la Facultad de Medicina (DI/115/2015) de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) y el comité de ética del Hospital General de México (CI/314/15). La institución cumple con todas las especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso de animales de laboratorio y está legalmente certificada por la legislación nacional (NOM-062-ZOO-1999). Las ratas Wistar macho que pesan 150-250 g (6-8 semanas de edad) fueron obtenidas del Centro de Animales de Laboratorio de la Facultad de Medicina de la UNAM para este estudio.

1. Obtención de andamios de matriz de colágeno a partir del fémur bovino

1. Obtener el cóndilo del fémur bovino de un matadero certificado por las autoridades sanitarias y agrícolas de México.
   1. Diseccione cuidadosamente la grasa, el músculo y el cartílago del cóndilo con un instrumento quirúrgico. Cortar los fragmentos de cóndilo en fragmentos de 3 cm x3 cm con un cortador de sierra y limpiar la grasa y la sangre con una toalla. Lave los fragmentos del cóndilo con agua.
   2. Hervir (92 °C) los fragmentos con 1 L de detergente aniónico (10 g/L) durante 30 min. Lave los fragmentos del cóndilo dos veces para eliminar cualquier resto del detergente aniónico.
   3. Secar los fragmentos del cóndilo durante 3 h con papel de filtro (0,5 mm).
2. Preparar un CMS triangular (1 cm x1 cm x1 cm) de espesor 0,5 cm a partir de los fragmentos mencionados en el paso 1.1 (Figura 1A).
   1. Desmineralizar los fragmentos en 100 mL de 0,5 M HCl durante 10 min con agitación constante. Retire el HCl.
      NOTA: Neutralizar el HCl con hidróxido de sodio (10 M).
   2. Enjuague los fragmentos tres veces con 100 ml de agua destilada, 15 minutos cada vez, con agitación constante. Secar el CMS con papel de filtro (0,5 mm) durante 1 h.
   3. Utilice un microscopio estereoscópico¹⁵ para analizar las propiedades estructurales del CMS (tamaño de los poros, formación de poros e interconexión porosa) (Figura 1B).
   4. Utilice un microscopio electrónico de^{barrido 16} para analizar la superficie rugosa de las trabéculas CMS (Figura 1C).
   5. Utilice el instrumento de disección para mezclar y estirar para evaluar los cambios mecánicos (plasticidad y flexibilidad) del CMS(Figura 1D).
   6. Empaque el CMS en la bolsa de esterilización y esteriléctelo con plasma de peróxido de hidrógeno durante 38 minutos. Guarde el CMS estéril en el envase original en una zona seca a 20-25 °C hasta su uso.

2. Preparación del área quirúrgica y manejo y preparación del modelo animal

1. Desinfecte el área quirúrgica, la mesa de trabajo, el microscopio de microcirugía y el asiento con solución de clorhexidina al 2%. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos, esponja quirúrgica, hisopos y cortinas quirúrgicas desechables mediante esterilización por calor (121 °C/30 min/100 kPa)
2. Asigne a las ratas (n = 5) en tres grupos de cinco ratas por grupo: 1. simulación, 2. hepatectomía y 3. hepatectomía más CMS, y siga a todos los grupos en los días 3, 14 y 21 días.
   1. Administrar ketamina (35 mg/kg) y xilazina (2,5 mg/kg) por vía intramuscular en la extremidad posterior.
      NOTA: El período sedante generalmente dura de 30 a 40 minutos.
   2. Afeitar la piel abdominal (5 cm x 2 cm) con jabón quirúrgico y una cuchilla de doble filo, y desinfectar la piel con una solución tópica de povidona-yodo al 10% en tres rondas¹⁷.
   3. Coloque al animal en una placa caliente en la posición dorsal del decúbito, con el cuello hiperextendido para mantener una vía aérea permeable (Figura 2).
   4. Evaluar la profundidad de la anestesia a través del patrón respiratorio y la pérdida del reflejo de abstinencia en las extremidades.
   5. Coloque una cortina quirúrgica desechable alrededor de la piel afeitada y haga una incisión (2,5 cm) en la línea de albous con un bisturí, utilizando el proceso xifoide como punto de referencia. Evite el vaso sanguíneo de la pared abdominal para prevenir el sangrado.
   6. Coloque el retractor abdominal en su lugar y observe la cavidad abdominal. Usando las fórceps de disección, extraiga el lóbulo hepático izquierdo y colóquelo sobre la placa de metal (Figura 3A).
      NOTA: En el grupo simulado, solo extraiga el lóbulo hepático izquierdo y luego devuelva el hígado a la cavidad abdominal. Sutura la pared abdominal y la piel con una sutura de nylon 3-0.
   7. En los grupos experimentales con y sin CMS, use una cuchilla de bisturí y una hoja de bisturí estéril (# 15) para realizar la hepatectomía (aproximadamente el 40%) con dos cortes. Utilice una plantilla metálica triangular (1 cm x 1 cm x 1 cm) para realizar la hepatectomía (Figura 3B).
   8. Para prevenir el sangrado del hígado, mantenga la compresión quirúrgica con un hisopo en el borde del hígado durante 5 min.
   9. Hidratar el CMS en solución salina estéril durante 20 minutos antes del procedimiento quirúrgico. Implantar el CMS en el sitio de la hepatectomía con cuatro suturas de puntos entre el tejido hepático y el CMS para evitar el desplazamiento del biomaterial. Utilice 7-0 suturas de polipropileno no absorbibles(Figura 3C).
      NOTA: No retire las suturas en una segunda cirugía; las suturas se pueden utilizar como referencia para identificar el sitio de implantación de CMS.
   10. Devuelva el hígado a la cavidad abdominal y suture la pared abdominal y la piel con una sutura de nylon 3-0. Limpie la incisión quirúrgica con una esponja quirúrgica empapada de yodo en dos rondas. Observar y vigilar los signos vitales de los animales.

3. Cuidados postoperatorios

1. Administrar meglumina flunixina (2,5 mg/kg) por vía intramuscular en la extremidad posterior. Administrar analgésicos según lo aprobado por el comité institucional de cuidado y uso de animales.
2. Para la recuperación de la anestesia, coloque a los animales en cajas individuales de policarbonato con ropa de cama de animales de laboratorio en un área libre de ruido con control de temperatura (23 ° C).
3. Observar la recuperación de los animales y controlar su consumo de agua y alimentos durante 2 h. Monitorear a los animales después de la operación según lo aprobado por el comité institucional de cuidado y uso de animales.

4. Evaluación de la función hepática en suero

1. Recolectar muestras de sangre (500 μL) de las venas laterales de la cola de los animales anestesiados antes del procedimiento quirúrgico (valores basales) y en los días de evaluación 3, 14 y 21.
2. Centrifugar las muestras de sangre a 850 × g/10 min a temperatura ambiente (23 °C); separar el suero y almacenarlo a -80°C hasta su uso.
3. Realizar un panel de pruebas de función hepática: albúmina sérica (ALB), fosfatasa alcalina (ALP), alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), bilirrubina total (TB) y bilirrubina directa (DB) (Tabla 1).

5. Eutanasia y manejo de tejidos

1. Anestesiar a los animales para cada evaluación (días 3, 14 y 21) siguiendo el protocolo descrito anteriormente.
2. La eutanasia a través de métodos aprobados por el comité institucional de cuidado y uso de animales.
3. Realizar una incisión (5-6 cm) en la línea albous con un bisturí para observar los órganos de la cavidad abdominal y tomar fotografías de la zona de hepatectomía de los grupos simulado y experimental, con y sin el CMS.
4. Tomar muestras de hígado (2 cm x 2 cm; 0,40-0,45 g) de todos los animales del grupo de estudio y colocarlas en una solución de formaldehído al 4% durante 24 h para su posterior evaluación histológica.

6. Análisis histológico

1. Preservar los tejidos hepáticos en formaldehído al 4% y deshidratar el tejido utilizando una serie de concentraciones de alcohol (60%, 70%, 80%, 90%, 100%); colóquelos en xileno (1h) y colóquelos en parafina¹⁶.
2. Cortar los bloques de parafina con un microtomo en secciones de 4 μm de espesor para la preparación de ocho portaobjetos.
3. Realizar tinción tricrómica de H&E y Masson¹⁶.
4. Observe las secciones teñidas bajo un microscopio de luz para seleccionar las áreas representativas del hígado, con y sin CMS. Obtenga fotomicrografías a un aumento de 4x, 10x y 40x y procese las imágenes utilizando el software apropiado¹⁸ (consulte la Tabla de Materiales).

Resultados

La desmineralización ósea afecta las propiedades mecánicas de CMS sin alterar la forma original o la interconexión de susporos. CmS puede tener cualquier forma, y por lo tanto, se puede ajustar al tamaño y forma del órgano o tejido seleccionado¹⁹. En el presente protocolo, utilizamos un CMS triangular(Figura 1A-D). Se utilizó un modelo de rata para evaluar la capacidad regenerativa del xenoimplante CMS en el h...

Discusión

El trasplante de órganos es el pilar del tratamiento en pacientes con fibrosis hepática o cirrosis. Algunos pacientes se benefician de este procedimiento, por lo que es necesario proporcionar alternativas terapéuticas para los pacientes en lista de espera. La ingeniería de tejidos es una estrategia prometedora que emplea andamios y células con potencial regenerativo^2,4,13. La extirpación de una porción del hígado es un p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anionic detergent	Alconox	Z273228
Biopsy cassettes	Leica	3802453
Camera DMX	Nikon	DXM1200F
Centrifuge	Eppendorf	5424
Chlorhexidine gluconate 4%	BD	372412
Cover glasses 25 mm x 40 mm	Corning	2980-224
Eosin	Sigma-Aldrich	200-M	CAS 17372-87-1
Ethyl alcohol, pure	Sigma-Aldrich	459836	CAS 64-17-5
Flunixine meglumide	MSD	Q-0273-035
Glass slides 75 mm x 25 mm	Corning	101081022
Hematoxylin	Merck	H9627	CAS 571-28-2
Hydrochloric acid 37%	Merck	339253	CAS 7647-01-0
Ketamine	Pisa agropecuaria	Q-7833-028
Light microscopy	Nikon	Microphoto-FXA
Microtainer yellow cape	Beckton Dickinson	365967
Microtome	Leica	RM2125
Model animal: Wistar rats	Universidad Nacional Autónoma de México
Nylon 3-0 (Dermalon)	Covidien	1750-41
Polypropylene 7-0	Atramat	SE867/2-60
Povidone-iodine10% cutaneous solution	Diafra SA de CV	1.37E+86
Scaning electronic microscopy	Zeiss	DSM-950
Sodium hydroxide, pellets	J. T. Baker	3722-01	CAS 1310-73-2
Software ACT-1	Nikon	Ver 2.70
Stereoscopy macroscopy	Leica	EZ4Stereo 8X-35X
Sterrad 100S	Johnson and Johnson	99970
Surgipath paraplast	Leica	39601006
Synringe of 1 mL with needle (27G x 13 mm)	SensiMedical	LAN-078-077
Tissue Processor (Histokinette)	Leica	TP1020
Tissue-Tek TEC 5 (Tissue embedder)	Sakura Finetek USA	5229
Trichrome stain kit	Sigma-Aldrich	HT15
Unicell DxC600 Analyzer	Beckman Coulter	BC 200-10
Xylazine	Pisa agropecuaria	Q-7833-099
Xylene	Sigma-Aldrich	534056	CAS 1330-20-7