JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Заболевания печени вызваны многими причинами, которые способствуют фиброзу или циррозу. Трансплантация является единственным вариантом восстановления здоровья. Однако, учитывая нехватку трансплантируемых органов, необходимо изучить альтернативы. Наше исследование предлагает имплантацию коллагеновых каркасов в ткань печени с животной модели.

Аннотация

Заболевания печени являются основной причиной смерти во всем мире. Чрезмерное потребление алкоголя, диета с высоким содержанием жиров и вирусная инфекция гепатита С способствуют фиброзу, циррозу и / или гепатоцеллюлярной карциноме. Трансплантация печени является клинически рекомендуемой процедурой для улучшения и продления продолжительности жизни пациентов на поздних стадиях заболевания. Тем не менее, только 10% трансплантаций являются успешными, с наличием органов, предоперационными и послеоперационными процедурами, а высокие затраты напрямую коррелируют с этим результатом. Каркасы внеклеточного матрикса (ECM) появились в качестве альтернативы для восстановления тканей. Биосовместимость и прием трансплантата являются основными полезными характеристиками этих биоматериалов. Хотя способность восстанавливать размер и правильную функцию печени была оценена в моделях гепатэктомии печени, использование каркасов или какой-либо поддержки для замены объема истребленной массы печени не оценивалось.

Частичную гепатэктомию проводили в печени крысы с ксеноимплантацией каркаса коллагеновой матрицы (CMS) из мыщелка крупного рогатого готья. Ткань левой доли печени была удалена (примерно 40%), и равная доля CMS была имплантирована хирургическим путем. Тесты функции печени оценивались до и после хирургической процедуры. Через 3, 14 и 21 дни животных усыплены, проведены макроскопические и гистологические оценки. На 3 и 14 днях наблюдалась жировая ткань, окружающая CMS, без клинических признаков отторжения или инфекции, как и неоформация сосудов и реабсорбция CMS на 21-й день. Были гистологические доказательства незначительного воспалительного процесса и миграции соседних клеток в CMS, наблюдаемого с гематоксилином и эозином (H&E) и трихромным окрашиванием Массона. Было показано, что CMS хорошо работает в ткани печени и может быть полезной альтернативой для изучения регенерации и восстановления тканей при хронических заболеваниях печени.

Введение

Печень является одним из наиболее важных органов, участвующих в поддержании гомеостаза и выработке белка1. К сожалению, заболевания печени являются основной причиной смерти во всем мире. На поздних стадиях поражения печени, которые включают цирроз и гепатоцеллюлярную карциному, трансплантация печени является клинически рекомендуемой процедурой. Однако из-за дефицита доноров и низкого уровня успешных трансплантаций были разработаны новые методы в тканевой инженерии (ТЭ) и регенеративной медицине (РМ)2,3.

ТЭ предполагает использование стволовых клеток, каркасов и факторов роста4 для содействия восстановлению воспаленных, фиброзных и отечные органы и ткани1,5,6. Биоматериалы, используемые в каркасах, имитируют нативный ECM, обеспечивая физические, химические и биологические сигналы для управляемого клеточного ремоделирования7. Коллаген является одним из наиболее распространенных белков, получаемых из дермы, сухожилия, кишечника и перикарда8,9. Кроме того, коллаген может быть получен в виде биополимера для получения двух- и трехмерных каркасов посредством биопечати или электроспиннинга10,11. Эта группа первой сообщила об использовании коллагена из костного источника для регенерации ткани печени. В другом исследовании сообщается об использовании каркасов, синтезированных из бычьего коллагена, который был получен из кожи, с однородными и близко расположенными порами, без какой-либо связи между ними12.

Децеллюляризация сохраняет нативную ECM, позволяя впоследствии включать клетки с потенциалом стволовых клеток13,14. Тем не менее, эта процедура все еще находится в экспериментальной фазе в печени, сердце, почках, тонкой кишке и мочевом пузыре от мышей, крыс, кроликов, свиней, овец, крупного рогатого скота и лошадей3,14. В настоящее время резецированный объем массы печени не заменяется ни в одной из моделей гепатэктомии животных. Тем не менее, использование дополнительной поддержки или сети (биоматериалов), которая обеспечивает пролиферацию клеток и ангиогенез, может иметь важное значение для быстрого восстановления паренхиматозных функций печени. Таким образом, каркасы могут быть использованы в качестве альтернативных подходов к регенерации или восстановлению тканей при хронических заболеваниях печени, в свою очередь, устраняя ограничения из-за донорства и клинических осложнений трансплантации печени.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Настоящее исследование было одобрено комитетом по этике Медицинского факультета (DI/115/2015) в Национальном университете национальной авиационной медицины (UNAM) и комитетом по этике Главной больницы Мексики (CI/314/15). Учреждение выполняет все технические спецификации на производство, уход и использование лабораторных животных и юридически сертифицировано национальным законодательством (NOM-062-ZOO-1999). Самцы крыс Wistar весом 150-250 г (6-8 недель) были получены из Лаборатории лабораторных животных Медицинской школы UNAM для этого исследования.

1. Получение коллагеновых матричных каркасов из бедренной кости крупного рогатого готья

  1. Получите мыщелок из бедренной кости крупного рогатого готья на скотобойне, сертифицированной органами здравоохранения и сельского хозяйства Мексики.
    1. Тщательно рассекте мыщелковый жир, мышцы и хрящи хирургическим инструментом. Разрежьте фрагменты мыщелка на фрагменты 3 см х3 см с помощью пилорамы и очистите жир и кровь полотенцем. Вымойте фрагменты мыщелка водой.
    2. Отварить (92 °C) фрагменты с 1 л арионного моющего средства (10 г/л) в течение 30 мин. Дважды вымойте фрагменты мыщелка, чтобы удалить остатки антионного моющего средства.
    3. Высушите фрагменты мыщелка в течение 3 ч с помощью фильтровальной бумаги (0,5 мм).
  2. Подготовьте треугольную (1 см х1 см х1 см) CMS толщиной 0,5 см из фрагментов, упомянутых на шаге 1.1(рисунок 1A).
    1. Деминерализуют фрагменты в 100 мл 0,5 М HCl в течение 10 мин с постоянным перемешиванием. Удалите HCl.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нейтрализуют HCl гидроксидом натрия (10 М).
    2. Смойте фрагменты три раза 100 мл дистиллированной воды, по 15 мин каждый раз, с постоянным перемешиванием. Высушите CMS фильтровальной бумагой (0,5 мм) в течение 1 ч.
    3. Используйте стереомикроскоп15 для анализа структурных свойств CMS (размер пор, порообразование и порообразное соединение)(фиг.1B).
    4. Используйте сканирующий электронный микроскоп16 для анализа шероховатой поверхности трабекул CMS(фиг.1С).
    5. Используйте инструмент рассечения для смешивания и растяжения для оценки механических изменений (пластичности и гибкости) CMS(рисунок 1D).
    6. Упакуйте CMS в стерилизационный мешочек и стерилизуйте его плазмой перекиси водорода в течение 38 мин. Храните стерильную CMS в оригинальной упаковке в сухом месте при 20-25 °C до использования.

2. Подготовка хирургической области и обработка и подготовка животной модели

  1. Продезинфицируйте хирургическую зону, рабочий стол, микрохирургический микроскоп и сиденье 2% раствором хлоргексидина. Стерилизовать все хирургические инструменты, хирургическую губку, тампоны и одноразовые хирургические драпировки путем тепловой стерилизации (121 °C /30 мин/100 кПа)
  2. Назначьте крыс (n = 5) в три группы по пять крыс в группе: 1. фиктивная, 2. гепатэктомия и 3. гепатэктомия плюс CMS, и следите за всеми группами в дни 3, 14 и 21 день.
    1. Вводят кетамин (35 мг/кг) и ксилазин (2,5 мг/кг) внутримышечно в заднюю конечность.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Седативный период обычно длится 30-40 минут.
    2. Сбрить кожу живота (5 см х 2 см) с помощью хирургического мыла и обоюдоострого лезвия, а также продезинфицировать кожу с помощью местного 10% раствора повидона-йода в три раундапо 17.
    3. Поместите животное на теплую тарелку в продольном положении, с гиперпротянутой шеей для поддержания проницаемых дыхательных путей(рисунок 2).
    4. Оцените глубину анестезии через дыхательный паттерн и потерю рефлекса отмены в конечностях.
    5. Поместите одноразовую хирургическую драпировку вокруг бритой кожи и сделайте разрез (2,5 см) на линии альбуса скальпелем, используя в качестве ориентира кистоидный отрочек. Избегайте кровеносных сосудов брюшной стенки, чтобы предотвратить кровотечение.
    6. Поставьте брюшной ретрактор на место и наблюдайте за брюшной полостью. Используя рассеченные щипцы, извлеките левую мочку печени и поместите ее на металлическую пластину(рисунок 3А).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В фиктивной группе извлекают только левую мочку печени, а затем возвращают печень в брюшную полость. За швы брюшной стенки и кожи нейлоновым швом 3-0.
    7. В экспериментальных группах с CMS и без нее используйте лезвие скальпеля и стерильное лезвие скальпеля (No 15) для выполнения гепатэктомии (примерно 40%) с двумя разрезами. Используйте треугольный металлический шаблон (1 см х 1 см х 1 см) для выполнения гепатэктомии(рисунок 3B).
    8. Для предотвращения кровотечения печени поддерживают хирургическую компрессию тампоном на краю печени в течение 5 мин.
    9. Гидратировать CMS в стерильном физиологическом растворе за 20 мин до хирургической процедуры. Имплантировать CMS в место гепатэктомии с четырьмя швами швов между тканью печени и CMS для предотвращения смещения биоматериала. Используйте 7-0 нерассасывающихся полипропиленовых швов(Рисунок 3С).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не снимайте швы во второй операции; Швы могут быть использованы в качестве ориентира для идентификации места имплантации CMS.
    10. Вернуть печень в брюшную полость и зашвить брюшную стенку и кожу 3-0 нейлоновым швом. Очистите хирургический разрез хирургической губкой, пропитанной йодом, в два раунда. Наблюдайте и контролируйте жизненно важные показатели животных.

3. Послеоперационный уход

  1. Вводят меглюмин флуниксин (2,5 мг/кг) внутримышечно в заднюю конечность. Вводите анальгетики в том виде, в как это одобрено институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию.
  2. Для восстановления анестезии поместите животных в индивидуальные поликарбонатные ящики с подстилкой для лабораторных животных в бесшумной зоне с контролем температуры (23 °C).
  3. Наблюдайте за выздоровлением животных и контролируйте их потребление воды и пищи в течение 2 ч. Мониторинг животных после операции в том случае, если это одобрено институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию.

4. Оценка функции печени в сыворотке крови

  1. Забор образцов крови (500 мкл) из боковых хвостовых вен анестезированных животных перед хирургической процедурой (исходные значения) и на 3, 14 и 21 день оценки.
  2. Центрифугировать образцы крови при 850 × г/10 мин при комнатной температуре (23 °C); отделите сыворотку и храните ее при -80°C до использования.
  3. Выполняют панельных функциональных тестов печени: сывороточный альбумин (ALB), щелочная фосфатаза (ALP), аланинаминотрансфераза (ALT), аспартатаминотрансфераза (AST), общий билирубин (TB) и прямой билирубин (DB)(таблица 1).

5. Эвтаназия и управление тканями

  1. Анестезировать животных для каждой оценки (дни 3, 14 и 21), следуя протоколу, описанному выше.
  2. Эвтаназия с помощью методов, утверждаемых институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию.
  3. Выполняют разрез (5-6 см) на линии альбуса скальпелем для наблюдения за органами брюшной полости и фотографирования области гепатэктомии фиктивной и экспериментальной групп, с CMS и без нее.
  4. Берут образцы печени (2 см х 2 см; 0,40-0,45 г) у всех животных исследуемой группы и помещают их в 4% раствор формальдегида на 24 ч для последующей гистологической оценки.

6. Гистологический анализ

  1. Сохранить ткани печени в 4% формальдегиде и обезвоживать ткани с помощью ряда концентраций алкоголя (60%, 70%, 80%, 90%, 100%); поместите их в ксилол (1ч) и поместите в парафин16.
  2. Парафиновые блоки микротомом разрезать на участки толщиной 4 мкм для подготовки восьми слайдов.
  3. Выполните трихромное окрашивание H&E и Masson16.
  4. Наблюдайте за окрашенными участками под световым микроскопом, чтобы выбрать репрезентативные области печени, с CMS и без нее. Получайте фотофотографии с увеличением 4x, 10x и 40x и обрабатывайте изображения с помощью соответствующего программного обеспечения18 (см. Таблицу материалов).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Деминерализация кости влияет на механические свойства CMS без изменения первоначальной формы или взаимосвязи еепор. CMS может иметь любую форму, а значит, может быть скорректирована под размер и форму выбранного органа илиткани 19. В настоящем протоколе мы использов...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Трансплантация органов является основой лечения у пациентов с фиброзом печени или циррозом печени. Несколько пациентов получают пользу от этой процедуры, что делает необходимым предоставление терапевтических альтернатив для пациентов, ожидающих. Тканевая инженерия является перспек...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов. Бенхалин Леон-Мансилья является докторантом Программы докторантуры биомедицины Национального университета Мексики (УНАМ), и он получил стипендию DGAPA-UNAM.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить персонал Лаборатории животных Отделения экспериментальной медицины, медсестру Каролину Баньос Г. за техническую и хирургическую поддержку, Марко Э. Гудиньо З. за поддержку в микрофотографии и Эрика Апо за поддержку в гистологии печени. Национальный совет поддержал это исследование в области науки и техники(CONACyT),номер гранта SALUD-2016-272579 и PAPIIT-UNAM TA200515.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Anionic detergentAlconoxZ273228
Biopsy cassettesLeica3802453
Camera DMXNikonDXM1200F
CentrifugeEppendorf5424
Chlorhexidine gluconate 4%BD372412
Cover glasses 25 mm x 40 mmCorning2980-224
EosinSigma-Aldrich200-MCAS 17372-87-1
Ethyl alcohol, pureSigma-Aldrich459836CAS 64-17-5
Flunixine meglumideMSDQ-0273-035
Glass slides 75 mm x 25 mmCorning101081022
HematoxylinMerckH9627CAS 571-28-2
Hydrochloric acid 37%Merck339253CAS 7647-01-0
KetaminePisa agropecuariaQ-7833-028
Light microscopeNikonMicrophoto-FXA
Microsurgery stereomicroscopeZeissOPMI F170
Microtainer yellow capeBeckton Dickinson365967
MicrotomeLeicaRM2125
Model animal: Wistar ratsUniversidad Nacional Autónoma de México
Nylon 3-0 (Dermalon)Covidien1750-41
Polypropylene 7-0AtramatSE867/2-60
Povidone-iodine10% cutaneous solutionDiafra SA de CV1.37E+86
Scanning electronic microscopeZeissDSM-950
Sodium hydroxide, pelletsJ. T. Baker3722-01CAS 1310-73-2
Software ACT-1NikonVer 2.70
StereomicroscopeLeicaEZ4Stereo 8X-35X
Sterrad 100SJohnson and Johnson99970
Surgipath paraplastLeica39601006
Synringe of 1 mL with needle (27G x 13 mm)SensiMedicalLAN-078-077
Tissue Processor (Histokinette)LeicaTP1020
Tissue-Tek TEC 5 (Tissue embedder)Sakura Finetek USA5229
Trichrome stain kitSigma-AldrichHT15
Unicell DxC600 AnalyzerBeckman CoulterBC 200-10
XylazinePisa agropecuariaQ-7833-099
XyleneSigma-Aldrich534056CAS 1330-20-7

Ссылки

  1. Li, N., Hua, J. Immune cells in liver regeneration. Oncotarget. 8 (2), 3628-3639 (2017).
  2. Langer, R., Vacanti, J. Tissue Engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
  3. Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
  4. Shafiee, A., Atla, A. Tissue engineering: Toward a new era of medicine. Annual Review of Medicine. 68, 29-40 (2017).
  5. Hu, C., Zhao, L., Wu, Z., Li, L. Transplantation of mesenchymal stem cells and their derivatives effectively promotes liver regeneration to attenuate acetaminophen-induced liver injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 88(2020).
  6. Sancho-Bru, P. Therapeutic possibilities of stem cells in the treatment of liver diseases. Gastroenterologia y Hepatologia. 34 (10), 701-710 (2011).
  7. Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
  8. Freedman, B. R., Mooney, D. J. Biomaterials to mimic and heal connective tissues. Advanced Materials. 31 (19), 1806695(2019).
  9. Meyer, M. Processing of collagen based biomaterials and the resulting materials properties. Biomedical Engineering Online. 18 (1), 24(2019).
  10. El Baz, H., et al. Transplant of hepatocytes, undifferentiated mesenchymal stem cells, and in vitro hepatocyte-differentiated mesenchymal stem cells in a chronic lver failure experimental model: a comparative study. Experimental and Clinical Transplantation. 16 (1), 81-89 (2018).
  11. Nedjari, S., Awaja, F., Guarino, R., Gugutkov, D., Altankov, G. Establishing multiple osteogenic differentiation pathways of mesenchymal stem cells through different scaffold configurations. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (10), 1428-1437 (2020).
  12. Chan, E. C., et al. Three dimensional collagen scaffold promotes intrinsic vascularisation for tissue engineering applications. PLoS One. 11 (2), 0149799(2016).
  13. Arenas-Herrera, J. E., Ko, I. K., Atala, A., Yoo, J. J. Decellularization for whole organ bioengineering. Biomedical Materials. 8 (1), 014106(2013).
  14. Parmaksiz, M., Dogan, A., Odabas, S., Elçin, A. E., Elçin, Y. M. Clinical applications of decellularized extracellular matrices for tissue engineering and regenerative medicine. Biomedical Materials. 11 (2), 022003(2016).
  15. Gacek, G. Stereo microscope, neglected tool. Postepy Biochemii. 63 (1), 68-73 (2017).
  16. Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130(2019).
  17. The University of Texas at Austin Institutional Animal Care and Use Committee. Guidelines for the Use of Chemical Depilatory Agents on Laboratory Animals. , https://research.utexas.edu (2021).
  18. Sivridis, L., Kotini, A., Anninos, P. The process of learning in neural net models with Poisson and Gauss connectivities. Neural Networks. 21 (1), 28-35 (2008).
  19. León-Mancilla, B. H., Araiza-Téllez, M. A., Flores-Flores, J. O., Piña-Barba, M. C. Physico-chemical characterization of collagen scaffolds for tissue engineering. Journal of Applied Research and Technology. 14 (1), 77-85 (2016).
  20. León, A., et al. Hematological and biochemical parameters in Sprague Dawley laboratory rats breed in CENPALAB, Cenp:SPRD. Revista Electronica de Veterinaria. 12, 1-10 (2011).
  21. Tsuchiya, A., et al. Mesenchymal stem cell therapies for liver cirrhosis: MSCs as "conducting cells" for improvement of liver fibrosis and regeneration. Inflammation and Regeneration. 39, 18(2019).
  22. Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
  23. Acevedo, G. C. Xenoimplante de colágena en uretra de perro. Universidad Nacional Autónoma de México. , Specialty of Urology thesis (2011).
  24. Montalvo-Jave, E. E., et al. Absorbable bioprosthesis for the treatment of bile duct injury in an experimental model. International Journal of Surgery. 20, 163-169 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

172

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены