JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מחלות כבד נגרמות על ידי גורמים רבים המקדמים פיברוזיס או שחמת הכבד. השתלה היא האפשרות היחידה להחלים בריאות. עם זאת, בהתחשב במחסור באיברים הניתנים להשתלה, יש לחקור חלופות. המחקר שלנו מציע השתלת פיגומי קולגן ברקמת הכבד ממודל של בעלי חיים.

Abstract

מחלות כבד הן הגורם המוביל למוות ברחבי העולם. צריכת אלכוהול מופרזת, דיאטה עתירת שומן, זיהום וירוס הפטיטיס C לקדם פיברוזיס, שחמת הכבד, ו/או קרצינומה hepatocellular. השתלת כבד היא ההליך המומלץ קלינית כדי לשפר ולהאריך את תוחלת החיים של חולים בשלבי מחלה מתקדמים. עם זאת, רק 10% מההשתלות מצליחות, עם זמינות איברים, הליכים פרהיסטוריים ופוסט-כירורגיים, ועלויות גבוהות מתואמות ישירות עם תוצאה זו. פיגומים מטריצה חוץ תאית (ECM) הופיעו כחלופה לשיקום רקמות. תאימות ביולוגית וקבלת שתל הם המאפיינים המועילים העיקריים של אותם ביו-חומרים. למרות היכולת לשחזר את הגודל ואת הפונקציה הנכונה של הכבד כבר מוערך במודלים hepatectomy הכבד, השימוש פיגומים או איזה תמיכה כדי להחליף את נפח מסת הכבד extirpated לא הוערך.

כריתת חזה חלקית בוצעה בכבד חולדה עם קסנוימפלנטייה של פיגום מטריצת קולגן (CMS) מקונדיל בקר. רקמת האונה השמאלית של הכבד הוסרה (כ-40%), וחלק שווה של CMS הושתל בניתוח. בדיקות תפקודי כבד הוערכו לפני ואחרי ההליך הכירורגי. לאחר ימים 3, 14 ו - 21, בעלי החיים הומתו, והערכות מקרוסקופיות והיסטולוגיות בוצעו. בימים 3 ו -14, רקמת שומן נצפתה סביב CMS, ללא ראיות קליניות של דחייה או זיהום, כמו גם neoformation כלי ו CMS reabsorption ביום 21. היו עדויות היסטולוגיות לתהליך דלקת חסר משמעות ונדידה של תאים סמוכים ל- CMS, שנצפו עם ההמטוקסילין והאאוזין (H&E) והכתמת הטריכרום של מאסון. ה- CMS הוכח כביצועים טובים ברקמת הכבד ויכול להיות חלופה שימושית לחקר התחדשות רקמות ותיקון במחלות כבד כרוניות.

Introduction

הכבד הוא אחד האיברים החשובים ביותר המעורבים בשמירה על הומאוסטזיס וייצור חלבון1. למרבה הצער, מחלת כבד היא הגורם המוביל למוות ברחבי העולם. בשלבים מתקדמים של נזק לכבד, הכוללים שחמת הכבד וקרצינומה hepatocellular, השתלת כבד היא ההליך המומלץ קלינית. עם זאת, בשל המחסור של תורמים ואת השיעור הנמוך של השתלות מוצלחות, טכניקות חדשות בהנדסתרקמות(TE) ורפואה רגנרטיבית (RM) פותחו 2,3.

TE כרוך בשימוש בתאי גזע, פיגומים וגורמי גדילה4 כדי לקדם את השיקום של איברים ובטטות מודלקים, פיברוטיים ובדים1,5,6. הביו-חומרים המשמשים בפיגומים מחקים את ה- ECM המקומי, ומספקים את הרמזים הפיזיים, הכימיים והביולוגיים לשיפוץ תאי מודרך7. קולגן הוא אחד החלבונים הנפוצים ביותר המתקבלים מהדרמיס, הגיד, המעי וקרום הלב8,9. יתר על כן, קולגן ניתן להשיג כמו ביופולימר לייצר פיגומים דו-ממדיים ותלת ממדיים באמצעות ביו הדפסה או electrospinning10,11. קבוצה זו היא הראשונה לדווח על השימוש בקולגן ממקור עצם להתחדשות של רקמת הכבד. מחקר אחר מדווח על שימוש בפיגומים מסונתזים מקולגן בקר, אשר הושג מהעור, עם נקבוביות הומוגניות הממוקמות מקרוב, ללא כל תקשורתביניהם 12.

Decellularization משמר את ECM המקורי, המאפשר שילוב הבא של תאים עם פוטנציאל לתאי גזע13,14. עם זאת, הליך זה הוא עדיין בשלב הניסוי בכבד, בלב, בכליות, המעי הדק, ושלפוחית השתן מעכברים, חולדות, ארנבות, חזירים, כבשים, בקר, וסוסים3,14. נכון לעכשיו, נפח מסת הכבד שנקטף אינו מוחלף באף אחד מהדגמים של כריתת הפטקטומיה של בעלי חיים. עם זאת, השימוש בתמיכה נוספת או ברשת (ביו-חומרים) המאפשרת התפשטות תאים ואנגיוגנזה יכול להיות חיוני לשיקום מהיר של פונקציות פרנשימאליות בכבד. לכן, פיגומים יכולים להיות מועסקים כגישות חלופיות כדי לחדש או לתקן רקמה במחלות כבד כרוניות, בתורו, ביטול מגבלות עקב תרומה ואת הסיבוכים הקליניים של השתלת כבד.

Protocol

המחקר הנוכחי אושר על ידי ועדת האתיקה של בית הספר לרפואה (DI/115/2015) באוניברסיטת נאסיונאל אוטונומה דה מקסיקו (UNAM) וועדת האתיקה של בית החולים הכללי של מקסיקו (CI/314/15). המוסד ממלא את כל המפרטים הטכניים לייצור, טיפול ושימוש בחיות מעבדה ומאושר על פי חוק לאומי (NOM-062-ZOO-1999). חולדות ויסטאר זכר במשקל 150-250 גרם (6-8 שבועות) התקבלו ממתקן החיות במעבדה של בית הספר לרפואה, UNAM, למחקר זה.

1. השגת פיגומי מטריצת קולגן מגוף הירך

  1. להשיג את ההסתה מעצם הירך של בקר מבית מטבחיים המאושר על ידי רשויות הבריאות והחקלאות של מקסיקו.
    1. בזהירות לנתח את שומן condyle, שריר, וסחוס עם מכשיר כירורגי. חותכים את שברי הקונדיליה לרסיסי 3 ס"מ x3 ס"מ באמצעות חותך מסור ומנקים את השומן והדם במגבת. לשטוף את שברי הקונדיליה עם מים.
    2. מרתיחים (92 °C) את השברים עם 1 ליטר של חומר ניקוי אניוני (10 גרם / ליטר) במשך 30 דקות. לשטוף את שברי התיל פעמיים כדי להסיר כל שרידים של חומר הניקוי אניוני.
    3. יבשו את שברי השען למשך 3 שעות באמצעות נייר סינון (0.5 מ"מ).
  2. הכן CMS משולש (1 ס"מ x1 ס"מ x1 ס"מ) בעובי 0.5 ס"מ מהשברים המוזכרים בשלב 1.1 (איור 1A).
    1. Demineralize את השברים ב 100 מ"ל של 0.5 M HCl במשך 10 דקות עם עצבנות מתמדת. הסר את HCL.
      הערה: לנטרל את HCl עם נתרן הידרוקסיד (10 M).
    2. לשטוף את השברים שלוש פעמים עם 100 מ"ל של מים מזוקקים, 15 דקות בכל פעם, עם עצבנות מתמדת. יבש את ה- CMS בנייר סינון (0.5 מ"מ) למשך שעה אחת.
    3. השתמש במיקרוסקופ סטריאו15 כדי לנתח את המאפיינים המבניים של ה- CMS (גודל הנקבוביות, היווצרות הנקבוביות והיחסים הנקבוביים) (איור 1B).
    4. השתמש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק16 כדי לנתח את פני השטח המחוספסים של trabeculae CMS (איור 1C).
    5. השתמש בכלי ההפצה למיזוג ומתיחות כדי להעריך את השינויים המכניים (פלסטיות וגמישות) של ה- CMS (איור 1D).
    6. לארוז את CMS לתוך כיס עיקור ולחטא אותו עם פלזמה מי חמצן במשך 38 דקות. יש לאחסן את ה-CMS הסטרילי באריזה המקורית באזור יבש ב-20-25 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

2. הכנת התחום הכירורגי וטיפול והכנת מודל בעלי החיים

  1. לחטא את האזור הכירורגי, שולחן העבודה, מיקרוסקופ מיקרוכירורגיה, ואת המושב עם פתרון 2% כלורהקסידין. לחטא את כל המכשירים הכירורגיים, ספוג כירורגי, מטליות, וילון כירורגי חד פעמי באמצעות עיקור חום (121 °C /30 דקות / 100 kPa)
  2. הקצה את החולדות (n = 5) לשלוש קבוצות של חמש חולדות לכל קבוצה: 1. זיוף, 2. כריתת הפטקטומיה, ו -3. כריתת הפטקטומיה פלוס CMS, ועקוב אחר כל הקבוצות בימים 3, 14 ו -21 ימים.
    1. יש לנהל קטמין (35 מ"ג/ק"ג) וקסילאסין (2.5 מ"ג/ק"ג) תוך שרירית בגפה האחורית.
      הערה: תקופת ההרגעה נמשכת בדרך כלל 30-40 דקות.
    2. גילחו את עור הבטן (5 ס"מ על 2 ס"מ) באמצעות סבון כירורגי ולהב דו-צדדי, וחטאו את העור באמצעות תמיסת פוידון-יוד אקטואלי 10% בשלושה סיבובים17.
    3. מניחים את החיה על צלחת חמה בתנוחת הגב דקוביטוס, כשהצוואר מודגש יתר על המידה כדי לשמור על דרכי הנשימה החודרות(איור 2).
    4. להעריך את עומק ההרדמה באמצעות דפוס הנשימה ואובדן רפלקס הנסיגה בגפיים.
    5. מניחים וילון כירורגי חד פעמי סביב העור המגולח ומבצעים חתך (2.5 ס"מ) על הקו האלבי עם אזמל, תוך שימוש בתהליך xiphoid כנקודת התייחסות. הימנע מכלי הדם בדופן הבטן כדי למנוע דימום.
    6. שים את מפסק הבטן במקום להתבונן בחלל הבטן. בעזרת מלקחיים, לחלץ את אונת הכבד השמאלית ומניחים אותו על צלחת המתכת(איור 3A).
      הערה: בקבוצת זיוף, רק לחלץ את האונה הכבד השמאלי ולאחר מכן להחזיר את הכבד לחלל הבטן. לתפור את דופן הבטן ואת העור עם תפל ניילון 3-0.
    7. בקבוצות הניסוי עם ובלי CMS, השתמש בלהב אזמל ולהב אזמל סטרילי (#15) כדי לבצע כריתת הפטקטומיה (כ -40%) עם שני חתכים. השתמש בתבנית מתכתית משולשת (1 ס"מ x 1 ס"מ x 1 ס"מ) כדי לבצע את כריתת ההפטקטומיה(איור 3B).
    8. כדי למנוע דימום של הכבד, לשמור על דחיסה כירורגית עם ספוגית על קצה הכבד במשך 5 דקות.
    9. יש להרטיב את ה-CMS בתמיסת מלח סטרילית למשך 20 דקות לפני ההליך הכירורגי. השתילו את ה-CMS באתר כריתת ההפטקטומיה עם ארבעה תפרים בין רקמת הכבד ל- CMS כדי למנוע תזוזה של הביו-חומרים. השתמשו ב-7-0 תפרי פוליפרופילן שאינם נספגים(איור 3C).
      הערה: אין להסיר את התפרים בניתוח שני; תפרים יכולים לשמש כהפניה לזיהוי האתר של השתלת CMS.
    10. להחזיר את הכבד לחלל הבטן ולתפור את דופן הבטן ואת העור עם תבר ניילון 3-0. נקה את החתך הכירורגי עם ספוג ספוג יוד כירורגי בשני סיבובים. התבונן ונטר את הסימנים החיוניים של בעלי החיים.

3. טיפול לאחר הניתוח

  1. יש לנהל פלוניקסין מגלומינים (2.5 מ"ג/ק"ג) תוך שרירית בגפה האחורית. לנהל את המכאים כפי שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש.
  2. להתאוששות הרדמה, למקם את בעלי החיים בקופסאות פוליקרבונט בודדים עם מצעים בעלי חיים במעבדה באזור ללא רעש עם בקרת טמפרטורה (23 °C (23 °F).
  3. שים לב להתאוששות של בעלי החיים ולעקוב אחר צריכת המים והמזון שלהם במשך 2 שעות. פיקוח על בעלי חיים פוסט אופרטיבי כפי שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש.

4. הערכת תפקוד הכבד בסרום

  1. לאסוף דגימות דם (500 μL) מן הוורידים הזנב לרוחב של בעלי החיים המרידים לפני ההליך הכירורגי (ערכים בסיסיים) ובימי הערכה 3, 14, ו 21.
  2. צנטריפוגות דגימות הדם ב 850 × g/ 10 דקות בטמפרטורת החדר (23 °F); מפרידים את הסרום ומאחסנים אותו ב-80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  3. בצע פאנל של בדיקות תפקוד כבד: אלבומין בסרום (ALB), אלקליין פוספטאז (ALP), אלנין אמינו טרנספראז (ALT), אספרטט aminotransferase (AST), בילירובין הכולל (TB), ובילירובין ישיר (DB) (טבלה 1).

5. המתת חסד וניהול רקמות

  1. למרדים את בעלי החיים עבור כל הערכה (ימים 3, 14 ו-21) על-ידי ביצוע הפרוטוקול המתואר לעיל.
  2. המתת חסד באמצעות שיטות המאשרות על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש.
  3. בצע חתכים (5-6 ס"מ) על הקו הלבבי עם אזמל כדי לצפות באיברי חלל הבטן ולצלם את אזור כריתת ההפטקטומיה של ה- sham וקבוצות הניסוי, עם ובלי CMS.
  4. קח דגימות כבד (2 ס"מ x 2 ס"מ; 0.40-0.45 גרם) מכל בעלי החיים בקבוצת המחקר והנח אותם בתמיסת פורמלדהיד 4% עבור 24 שעות להערכה היסתולוגית לאחר מכן.

6. ניתוח היסתולוגי

  1. לשמר את רקמות הכבד ב 4% פורמלדהיד ולייבש את הרקמה באמצעות סדרה של ריכוזי אלכוהול (60%, 70%, 80%, 90%, 100%); מניחים אותם בקסילן (1h) ומטביעים אותם בפרפין16.
  2. חותכים את בלוקי הפרפין עם מיקרוטום ל-4 חלקים בעובי מיקרומטר להכנת שמונה שקופיות.
  3. בצעו את טריכרום H&E ו-Masson מכתים16.
  4. שים לב לחלקים המוכתמים תחת מיקרוסקופ אור כדי לבחור את האזורים היציגים של הכבד, עם ובלי CMS. השג פוטומיקרוגרוגרפיות בהגדלה של פי 4, פי 10 ו- 40 ועיבוד התמונות באמצעות תוכנה מתאימה18 (ראה טבלת החומרים).

תוצאות

demineralization העצם משפיע על המאפיינים המכניים של CMS מבלי לשנות את הצורה המקורית או חיבור של הנקבוביות שלה. CMS יכול להיות כל צורה, ולכן, ניתן להתאים לגודל ולצורה של האיבר או הרקמה שנבחר19. בפרוטוקול הנוכחי, השתמשנו ב- CMS משולש (איור 1A-D). מודל ח...

Discussion

השתלת איברים היא עמוד התווך של הטיפול בחולים עם פיברוזיס בכבד או שחמת הכבד. כמה חולים נהנים מהליך זה, מה שהופך את הצורך לספק חלופות טיפוליות עבור חולים ברשימת ההמתנה. הנדסת רקמות היא אסטרטגיה מבטיחה המעסיקה פיגומים ותאים עם פוטנציאל התחדשות2,4,

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים. בנג'אמין לאון-מנסילה הוא דוקטורנט מ-Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Óiversidad Nacional Autónoma de México (UNAM) וקיבל מלגת DGAPA-UNAM.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות לאנשי מתקן חיות המעבדה של היחידה לרפואה ניסיונית, האחות קרולינה באניוס G. על תמיכה טכנית וניתוחית, מרקו א Gudiño Z. על תמיכה מיקרופוטוגרפים, ואריק אפו לתמיכה היסתולוגיה בכבד. המועצה הלאומית תמכה במחקר זה למדע וטכנולוגיה (CONACyT), מספר המענק SALUD-2016-272579 ו- PAPIIT-UNAM TA200515.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anionic detergentAlconoxZ273228
Biopsy cassettesLeica3802453
Camera DMXNikonDXM1200F
CentrifugeEppendorf5424
Chlorhexidine gluconate 4%BD372412
Cover glasses 25 mm x 40 mmCorning2980-224
EosinSigma-Aldrich200-MCAS 17372-87-1
Ethyl alcohol, pureSigma-Aldrich459836CAS 64-17-5
Flunixine meglumideMSDQ-0273-035
Glass slides 75 mm x 25 mmCorning101081022
HematoxylinMerckH9627CAS 571-28-2
Hydrochloric acid 37%Merck339253CAS 7647-01-0
KetaminePisa agropecuariaQ-7833-028
Light microscopeNikonMicrophoto-FXA
Microsurgery stereomicroscopeZeissOPMI F170
Microtainer yellow capeBeckton Dickinson365967
MicrotomeLeicaRM2125
Model animal: Wistar ratsUniversidad Nacional Autónoma de México
Nylon 3-0 (Dermalon)Covidien1750-41
Polypropylene 7-0AtramatSE867/2-60
Povidone-iodine10% cutaneous solutionDiafra SA de CV1.37E+86
Scanning electronic microscopeZeissDSM-950
Sodium hydroxide, pelletsJ. T. Baker3722-01CAS 1310-73-2
Software ACT-1NikonVer 2.70
StereomicroscopeLeicaEZ4Stereo 8X-35X
Sterrad 100SJohnson and Johnson99970
Surgipath paraplastLeica39601006
Synringe of 1 mL with needle (27G x 13 mm)SensiMedicalLAN-078-077
Tissue Processor (Histokinette)LeicaTP1020
Tissue-Tek TEC 5 (Tissue embedder)Sakura Finetek USA5229
Trichrome stain kitSigma-AldrichHT15
Unicell DxC600 AnalyzerBeckman CoulterBC 200-10
XylazinePisa agropecuariaQ-7833-099
XyleneSigma-Aldrich534056CAS 1330-20-7

References

  1. Li, N., Hua, J. Immune cells in liver regeneration. Oncotarget. 8 (2), 3628-3639 (2017).
  2. Langer, R., Vacanti, J. Tissue Engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
  3. Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
  4. Shafiee, A., Atla, A. Tissue engineering: Toward a new era of medicine. Annual Review of Medicine. 68, 29-40 (2017).
  5. Hu, C., Zhao, L., Wu, Z., Li, L. Transplantation of mesenchymal stem cells and their derivatives effectively promotes liver regeneration to attenuate acetaminophen-induced liver injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 88 (2020).
  6. Sancho-Bru, P. Therapeutic possibilities of stem cells in the treatment of liver diseases. Gastroenterologia y Hepatologia. 34 (10), 701-710 (2011).
  7. Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
  8. Freedman, B. R., Mooney, D. J. Biomaterials to mimic and heal connective tissues. Advanced Materials. 31 (19), 1806695 (2019).
  9. Meyer, M. Processing of collagen based biomaterials and the resulting materials properties. Biomedical Engineering Online. 18 (1), 24 (2019).
  10. El Baz, H., et al. Transplant of hepatocytes, undifferentiated mesenchymal stem cells, and in vitro hepatocyte-differentiated mesenchymal stem cells in a chronic lver failure experimental model: a comparative study. Experimental and Clinical Transplantation. 16 (1), 81-89 (2018).
  11. Nedjari, S., Awaja, F., Guarino, R., Gugutkov, D., Altankov, G. Establishing multiple osteogenic differentiation pathways of mesenchymal stem cells through different scaffold configurations. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (10), 1428-1437 (2020).
  12. Chan, E. C., et al. Three dimensional collagen scaffold promotes intrinsic vascularisation for tissue engineering applications. PLoS One. 11 (2), 0149799 (2016).
  13. Arenas-Herrera, J. E., Ko, I. K., Atala, A., Yoo, J. J. Decellularization for whole organ bioengineering. Biomedical Materials. 8 (1), 014106 (2013).
  14. Parmaksiz, M., Dogan, A., Odabas, S., Elçin, A. E., Elçin, Y. M. Clinical applications of decellularized extracellular matrices for tissue engineering and regenerative medicine. Biomedical Materials. 11 (2), 022003 (2016).
  15. Gacek, G. Stereo microscope, neglected tool. Postepy Biochemii. 63 (1), 68-73 (2017).
  16. Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130 (2019).
  17. The University of Texas at Austin Institutional Animal Care and Use Committee. . Guidelines for the Use of Chemical Depilatory Agents on Laboratory Animals. , (2021).
  18. Sivridis, L., Kotini, A., Anninos, P. The process of learning in neural net models with Poisson and Gauss connectivities. Neural Networks. 21 (1), 28-35 (2008).
  19. León-Mancilla, B. H., Araiza-Téllez, M. A., Flores-Flores, J. O., Piña-Barba, M. C. Physico-chemical characterization of collagen scaffolds for tissue engineering. Journal of Applied Research and Technology. 14 (1), 77-85 (2016).
  20. León, A., et al. Hematological and biochemical parameters in Sprague Dawley laboratory rats breed in CENPALAB, Cenp:SPRD. Revista Electronica de Veterinaria. 12, 1-10 (2011).
  21. Tsuchiya, A., et al. Mesenchymal stem cell therapies for liver cirrhosis: MSCs as "conducting cells" for improvement of liver fibrosis and regeneration. Inflammation and Regeneration. 39, 18 (2019).
  22. Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
  23. Acevedo, G. C. Xenoimplante de colágena en uretra de perro. Universidad Nacional Autónoma de México. , (2011).
  24. Montalvo-Jave, E. E., et al. Absorbable bioprosthesis for the treatment of bile duct injury in an experimental model. International Journal of Surgery. 20, 163-169 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

172

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved