JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Karaciğer hastalıkları fibrozis veya sirozun teşvik ettiği birçok nedenden kaynaklanır. Sağlığın iyileşmesi için tek seçenek transplantasyondur. Bununla birlikte, nakledilebilir organların kıtlığı göz önüne alındığında, alternatifler araştırılmalıdır. Araştırmamız, karaciğer dokusuna bir hayvan modelinden kollajen iskelelerin yerleştirilmesini önermektedir.

Özet

Karaciğer hastalıkları dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir. Aşırı alkol tüketimi, yüksek yağlı bir diyet ve hepatit C virüs enfeksiyonu fibrozis, siroz ve/veya hepatosellüler karsinomu teşvik eder. Karaciğer nakli, ileri hastalık evrelerinde hastaların yaşam süresini iyileştirmek ve uzatmak için klinik olarak önerilen prosedürdür. Bununla birlikte, organ mevcudiyeti, presurgical ve postsurgical prosedürler ve bu sonuçla doğrudan ilişkili yüksek maliyetler ile nakillerin sadece% 10'u başarılıdır. Hücre dışı matris (ECM) iskeleleri doku restorasyonu için bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır. Biyouyumbilite ve greft kabulü bu biyomalzemelerin temel faydalı özellikleridir. Karaciğer hepatektomi modellerinde karaciğerin boyutunu ve doğru işlevini geri kazanma kapasitesi değerlendirilmiş olsa da, extirpated karaciğer kütlesinin hacmini değiştirmek için iskelelerin veya bir tür desteğin kullanımı değerlendirilmemiştir.

Bir sıçan karaciğerinde, bir sığır kondylesinden kollajen matrisli bir iskelenin (CMS) ksinoimplantasyonu ile kısmi hepatektomi yapıldı. Sol karaciğer lob dokusu alındı (yaklaşık %40) ve eşit oranda CMS cerrahi olarak yerleştirildi. Karaciğer fonksiyon testleri cerrahi işlem öncesi ve sonrası değerlendirildi. 3, 14 ve 21. 3 ve 14. günlerde, CMS'yi çevreleyen yağ dokusu gözlendi, 21. Hematoksilin ve eozin (H&E) ve Masson'un üç renkli lekelenmesi ile gözlenen önemsiz bir iltihaplanma süreci ve bitişik hücrelerin CMS'ye göçünün histolojik kanıtları vardı. CMS'nin karaciğer dokusunda iyi performans gösterdiği ve kronik karaciğer hastalıklarında doku yenilenmesi ve onarımı için yararlı bir alternatif olabileceği gösterilmiştir.

Giriş

Karaciğer homeostaz ve protein üretiminin sürdürülmesinde rol oynayan en önemli organlardan biridir1. Ne yazık ki, karaciğer hastalığı dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir. Siroz ve hepatosellüler karsinom içeren karaciğer hasarının ileri evrelerinde karaciğer nakli klinik olarak önerilen işlemdir. Ancak donörlerin azlığı ve başarılı nakil oranının düşük olması nedeniyle doku mühendisliği (TE) ve rejeneratif tıpta (RM) yeni teknikler geliştirilmiştir2,3.

TE, iltihaplı, fibrotik ve ödemli organ ve dokuların restorasyonu için kök hücrelerin, iskelelerin ve büyüme faktörlerinin4 kullanımını içerir1,5,6. İskelelerde kullanılan biyomalzemeler, kılavuzlu hücresel yeniden şekillendirme için fiziksel, kimyasal ve biyolojik ipuçları sağlayan yerelECM'yitaklit eder 7 . Kollajen dermis, tendon, bağırsak ve perikarddan elde edilen en bol proteinlerden biridir8,9. Ayrıca, kollajen biyobaskı veya elektrospinning yoluyla iki ve üç boyutlu iskeleler üretmek için bir biyopolimer olarak elde edilebilir10,11. Bu grup, karaciğer dokusunun yenilenmesi için bir kemik kaynağından kollajen kullanımını bildiren ilk gruptır. Başka bir çalışma, deriden elde edilen sığır kollajeninden sentezlenen iskelelerin homojen ve yakından yerleşmiş gözeneklerle, aralarında herhangi bir iletişim olmadan kullanıldığını bildirmektedir12.

Hücreden arındırma, yerel ECM'yi korur ve kök hücre potansiyeli13,14olan hücrelerin daha sonrabirleştirilmesineizin verir. Bununla birlikte, bu prosedür hala farelerden, sıçanlardan, tavşanlardan, domuzlardan, koyunlardan, sığırlardan ve atlardan karaciğer, kalp, böbrek, ince bağırsak ve idrar kesesinde deneyselaşamadadır 3,14. Şu anda, resected karaciğer kitle hacmi hayvan hepatektomi modellerinin hiçbirinde değiştirilmez. Bununla birlikte, hücre çoğalmasını ve anjiogenez sağlayan ek destek veya ağ (biyomalzemeler) kullanımı karaciğer parenkimal fonksiyonlarının hızlı restorasyonu için gerekli olabilir. Böylece, iskeleler kronik karaciğer hastalıklarında dokuyu yenilemek veya onarmak için alternatif yaklaşımlar olarak kullanılabilir, bu da bağış ve karaciğer naklinin klinik komplikasyonlarına bağlı sınırlamaları ortadan kaldırır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu araştırma, Universidad Nacional Autónoma de México'daki (UNAM) Tıp Fakültesi etik komitesi (DI/115/2015) ve General de Mexico Hastanesi etik komitesi (CI/314/15) tarafından onaylanmıştır. Kurum, laboratuvar hayvanlarının üretimi, bakımı ve kullanımı için tüm teknik şartnameleri yerine getirmektedir ve ulusal yasalar (NOM-062-ZOO-1999) tarafından yasal olarak onaylanmıştır. Bu çalışma için UNAM Tıp Fakültesi Laboratuvar Hayvan Tesisinden 150-250 g (6-8 haftalık) ağırlığında erkek Wistar sıçanları elde edilmiştir.

1. Sığır femurundan kollajen matris iskeleleri elde etmek

  1. Kondyle'u sığır femurundan Meksika sağlık ve tarım otoriteleri tarafından onaylanmış bir mezbahadan alın.
    1. Kondyle yağı, kası ve kıkırdağı cerrahi bir aletle dikkatlice parçalara ayrıştırın. Testere kesici kullanarak kondyle parçalarını 3 cm x3 cm parçalar halinde kesin ve yağ ve kanı bir havlu ile temizleyin. Kondyle parçalarını suyla yıkayın.
    2. Parçaları (92 °C) 1 L anionik deterjanla (10 g/L) 30 dakika kaynatın. Aniyonik deterjan kalıntılarını çıkarmak için kondyle parçalarını iki kez yıkayın.
    3. Kondyle parçalarını filtre kağıdı (0,5 mm) kullanarak 3 saat kurutun.
  2. Adım 1.1'de belirtilen parçalardan 0,5 cm kalınlığında üçgen (1 cm x1 cm x1 cm) CMS hazırlayın (Şekil 1A).
    1. Parçaları 100 mL 0,5 M HCl'de 10 dakika boyunca sürekli ajitasyonla demineralize edin. HCl'yi çıkarın.
      NOT: HCl'yi sodyum hidroksit (10 M) ile nötralize edin.
    2. Parçaları her seferinde 15 dakika, sürekli ajitasyonla 100 mL damıtılmış su ile üç kez durulayın. CMS'i filtre kağıdıyla (0,5 mm) 1 saat kurulayın.
    3. CMS'nin yapısal özelliklerini (gözeneklerin büyüklüğü, gözenek oluşumu ve gözenekli ara bağlantı) analiz etmek için stereo mikroskop15 kullanın (Şekil 1B).
    4. CMS trabeculae'nin pürüzlü yüzeyini analiz etmek için taramalı elektron mikroskobu16 kullanın (Şekil 1C).
    5. CMS'nin mekanik değişikliklerini (plastisite ve esneklik) değerlendirmek için karıştırma ve germe için diseksiyon aletini kullanın (Şekil 1D).
    6. CMS'yi sterilizasyon torbasına paketleyin ve hidrojen peroksit plazma ile 38 dakika sterilize edin. Steril CMS'yi orijinal pakette kullanıma kadar 20-25 °C kuru bir alanda saklayın.

2. Cerrahi alanın hazırlanması ve hayvan modelinin taşınması ve hazırlanması

  1. Cerrahi bölgeyi, çalışma masasını, mikrocerrahi mikroskobu ve koltuğu% 2 klorheksidin çözeltisi ile sterilize edin. Isı sterilizasyonu yoluyla tüm cerrahi aletleri, cerrahi süngeri, sürüntü örneklerini ve tek kullanımlık cerrahi örtüleri sterilize edin (121 °C/30 dk/100 kPa)
  2. Sıçanları (n=5) grup başına beş sıçandan oluşan üç gruba atayın: 1. sham, 2. hepatektomi ve 3. hepatektomi artı CMS ve tüm grupları 3, 14 ve 21 gün boyunca takip edin.
    1. Ketamin (35 mg/kg) ve ksilazin (2,5 mg/kg) intramüsküler olarak arka ekstuzda uygulanır.
      NOT: Yatıştırıcı süresi genellikle 30-40 dakika sürer.
    2. Cerrahi sabun ve çift kenarlı bir bıçak kullanarak karın derisini (5 cm x 2 cm) tıraş edin ve üç turda topikal% 10 povidon-iyot çözeltisi kullanarak cildi dezenfekte edin17.
    3. Hayvanı, geçirgen bir hava yolunu korumak için boynu aşırı uzamış olan decubitus dorsal pozisyonunda ılık bir tabağayerleştirin (Şekil 2).
    4. Anestezinin derinliğini solunum düzeni ve uzuvlardaki çekilme refleksinin kaybı ile değerlendirin.
    5. Tıraş edilen cildin etrafına tek kullanımlık bir cerrahi örtü yerleştirin ve xiphoid işlemini referans noktası olarak kullanarak neşterle albous hattına bir kesi (2,5 cm) yapın. Kanamayı önlemek için karın duvarı kan damarı kaçının.
    6. Karın retraktörini yerine koyun ve karın boşluğunu gözlemleyin. Diseksiyon apsesini kullanarak, sol karaciğer lobu çıkarın ve metal plakaya yerleştirin (Şekil 3A).
      NOT: Sham grubunda, sadece sol karaciğer lobını çıkarın ve ardından karaciğeri karın boşluğuna geri döndürün. Karın duvarını ve cildi 3-0 naylon dikiş ile dikin.
    7. CMS'li ve CMS'siz deney gruplarında, iki kesikle hepatektomi (yaklaşık% 40) yapmak için neşter bıçağı ve steril neşter bıçağı (#15) kullanın. Hepatektomiyi(Şekil 3B)gerçekleştirmek için üçgen metalik bir şablon (1 cm x 1 cm x 1 cm) kullanın.
    8. Karaciğerin kanamasını önlemek için, karaciğerin kenarında bir bezle cerrahi kompresyonun 5 dakika boyunca sürdürülmesini sağlayın.
    9. Cerrahi işlemden önce CMS'yi steril salin çözeltisinde 20 dakika nemlendirin. Biyomalzemenin yer değiştirmesini önlemek için karaciğer dokusu ile CMS arasında dört dikiş dikişi ile CMS'yi hepatektomi bölgesine takın. 7-0 emilemez polipropilen dikiş kullanın (Şekil 3C).
      NOT: İkinci bir ameliyatta dikişleri çıkarmayın; dikişler CMS implantasyon bölgesini tanımlamak için referans olarak kullanılabilir.
    10. Karaciğeri karın boşluğuna geri koyun ve karın duvarını ve cildi 3-0 naylon dikiş ile dikin. Cerrahi kesiği cerrahi iyotla ıslatılmış bir süngerle iki tur halinde temizleyin. Hayvanların yaşamsal belirtilerini gözlemleyin ve izleyin.

3. Ameliyat sonrası bakım

  1. Arka uzuvda meglumine flunixin (2.5 mg/kg) intramüsküler olarak verin. Analjezikleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından onaylandığı şekilde yönetin.
  2. Anestezi geri kazanımı için, hayvanları sıcaklık kontrolü (23 °C) ile gürültüsüz bir alana laboratuvar hayvan yatakları ile bireysel polikarbonat kutularına yerleştirin.
  3. Hayvanların geri kazanımını gözlemleyin ve su ve yiyecek tüketimini 2 saat boyunca izleyin. Kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından onaylandığı şekilde hayvanları ameliyat sonrası izleyin.

4. Serumda karaciğer fonksiyonlarının değerlendirilmesi

  1. Cerrahi işlemden önce anestezi yapılan hayvanların lateral kuyruk damarlarından (500 μL) ve değerlendirme günleri 3, 14 ve 21'de kan örnekleri toplayın.
  2. Kan örneklerini oda sıcaklığında (23 °C) 850 × g/10 dk'da santrifüjlayın; serumu ayırın ve kullanıma kadar -80°C'de saklayın.
  3. Karaciğer fonksiyon testlerinden oluşan bir panel gerçekleştirin: serum albümin (ALB), alkalin fosfataz (ALP), alanin aminotransferaz (ALT), aspartat aminotransferaz (AST), total bilirubin (TB) ve doğrudan bilirubin (DB) (Tablo 1).

5. Ötenazi ve doku yönetimi

  1. Yukarıda açıklanan protokole uyarak hayvanları her değerlendirme için (3, 14 ve 21. günler) uyuşturun.
  2. Kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından onaylayan yöntemlerle ötenazi.
  3. Karın boşluğunun organlarını gözlemlemek ve CMS ile ve CMS olmadan, sham ve deneysel grupların hepatektomi alanının fotoğraflarını çekmek için neşterle albous hattında bir kesi (5-6 cm) yapın.
  4. Tüm çalışma grubu hayvanlardan karaciğer örnekleri (2 cm x 2 cm; 0,40-0,45 g) alın ve sonraki histolojik değerlendirme için 24 saat boyunca% 4 formaldehit çözeltisine yerleştirin.

6. Histolojik analiz

  1. Karaciğer dokularını% 4 formaldehitte koruyun ve bir dizi alkol konsantrasyonu kullanarak dokuyu susuz bırakır (%60, %70, %80, %90, %100); onları ksilen (1h) içine yerleştirin ve parafin16içine gömülü .
  2. Parafin bloklarını bir mikrotom ile sekiz slaytın hazırlanması için 4 μm kalınlığında bölümlere kesin.
  3. H&E ve Masson'un üç renkli boyama16'sınıgerçekleştirin.
  4. CMS'li ve CMS'siz karaciğerin temsili bölgelerini seçmek için lekeli bölümleri hafif bir mikroskop altında gözlemleyin. Fotomikrografları 4x, 10x ve 40x büyütme ile elde edin ve görüntüleri uygun yazılım18 kullanarak işleyin (bkz. Malzeme Tablosu).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Kemik demineralizasyonu, gözeneklerinin orijinal şeklini veya ara bağlantısını değiştirmeden CMS'nin mekanik özelliklerinietkiler. CMS herhangi bir şekle sahip olabilir ve bu nedenle seçilen organın veya dokunun büyüklüğüne ve şekline ayarlanabilir19. Mevcut protokolde üçgen CMS ( Şekil1A-D) kullandık. Karaciğerdeki CMS ksnoimplantının rejeneratif kapasitesini değerlendirmek için bir sıça...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Organ nakli karaciğer fibrozisi veya sirozlu hastalarda tedavinin temel dayanağıdır. Birkaç hasta bu işlemden yararlanarak bekleme listesindeki hastalar için terapötik alternatifler sunmayı zorunlu hale getirir. Doku mühendisliği, rejeneratif potansiyele sahip iskeleleri ve hücreleri kullanan umut verici bir stratejidir2,4,13. Karaciğerin bir kısmının alınması, bu damarlı organın bol kanaması nedeniyle bu i?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler. Benjamín León-Mancilla, Program de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) doktora öğrencisidir ve DGAPA-UNAM bursu almıştır.

Teşekkürler

Yazarlar, Deneysel Tıp Birimi Laboratuvar Hayvan Tesisi personeline, teknik ve cerrahi destek için Hemşire Carolina Baños G.'ye, mikrofotoğrafçılıktaki destek için Marco E. Gudiño Z.'ye ve karaciğer histolojislerindeki destek için Erick Apo'ya teşekkür etmek istiyor. Ulusal Konsey, BILIM ve Teknoloji(CONACyT),SALUD-2016-272579 ve PAPIIT-UNAM TA200515 hibe numarasını destekledi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Anionic detergentAlconoxZ273228
Biopsy cassettesLeica3802453
Camera DMXNikonDXM1200F
CentrifugeEppendorf5424
Chlorhexidine gluconate 4%BD372412
Cover glasses 25 mm x 40 mmCorning2980-224
EosinSigma-Aldrich200-MCAS 17372-87-1
Ethyl alcohol, pureSigma-Aldrich459836CAS 64-17-5
Flunixine meglumideMSDQ-0273-035
Glass slides 75 mm x 25 mmCorning101081022
HematoxylinMerckH9627CAS 571-28-2
Hydrochloric acid 37%Merck339253CAS 7647-01-0
KetaminePisa agropecuariaQ-7833-028
Light microscopeNikonMicrophoto-FXA
Microsurgery stereomicroscopeZeissOPMI F170
Microtainer yellow capeBeckton Dickinson365967
MicrotomeLeicaRM2125
Model animal: Wistar ratsUniversidad Nacional Autónoma de México
Nylon 3-0 (Dermalon)Covidien1750-41
Polypropylene 7-0AtramatSE867/2-60
Povidone-iodine10% cutaneous solutionDiafra SA de CV1.37E+86
Scanning electronic microscopeZeissDSM-950
Sodium hydroxide, pelletsJ. T. Baker3722-01CAS 1310-73-2
Software ACT-1NikonVer 2.70
StereomicroscopeLeicaEZ4Stereo 8X-35X
Sterrad 100SJohnson and Johnson99970
Surgipath paraplastLeica39601006
Synringe of 1 mL with needle (27G x 13 mm)SensiMedicalLAN-078-077
Tissue Processor (Histokinette)LeicaTP1020
Tissue-Tek TEC 5 (Tissue embedder)Sakura Finetek USA5229
Trichrome stain kitSigma-AldrichHT15
Unicell DxC600 AnalyzerBeckman CoulterBC 200-10
XylazinePisa agropecuariaQ-7833-099
XyleneSigma-Aldrich534056CAS 1330-20-7

Referanslar

  1. Li, N., Hua, J. Immune cells in liver regeneration. Oncotarget. 8 (2), 3628-3639 (2017).
  2. Langer, R., Vacanti, J. Tissue Engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
  3. Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
  4. Shafiee, A., Atla, A. Tissue engineering: Toward a new era of medicine. Annual Review of Medicine. 68, 29-40 (2017).
  5. Hu, C., Zhao, L., Wu, Z., Li, L. Transplantation of mesenchymal stem cells and their derivatives effectively promotes liver regeneration to attenuate acetaminophen-induced liver injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 88(2020).
  6. Sancho-Bru, P. Therapeutic possibilities of stem cells in the treatment of liver diseases. Gastroenterologia y Hepatologia. 34 (10), 701-710 (2011).
  7. Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
  8. Freedman, B. R., Mooney, D. J. Biomaterials to mimic and heal connective tissues. Advanced Materials. 31 (19), 1806695(2019).
  9. Meyer, M. Processing of collagen based biomaterials and the resulting materials properties. Biomedical Engineering Online. 18 (1), 24(2019).
  10. El Baz, H., et al. Transplant of hepatocytes, undifferentiated mesenchymal stem cells, and in vitro hepatocyte-differentiated mesenchymal stem cells in a chronic lver failure experimental model: a comparative study. Experimental and Clinical Transplantation. 16 (1), 81-89 (2018).
  11. Nedjari, S., Awaja, F., Guarino, R., Gugutkov, D., Altankov, G. Establishing multiple osteogenic differentiation pathways of mesenchymal stem cells through different scaffold configurations. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (10), 1428-1437 (2020).
  12. Chan, E. C., et al. Three dimensional collagen scaffold promotes intrinsic vascularisation for tissue engineering applications. PLoS One. 11 (2), 0149799(2016).
  13. Arenas-Herrera, J. E., Ko, I. K., Atala, A., Yoo, J. J. Decellularization for whole organ bioengineering. Biomedical Materials. 8 (1), 014106(2013).
  14. Parmaksiz, M., Dogan, A., Odabas, S., Elçin, A. E., Elçin, Y. M. Clinical applications of decellularized extracellular matrices for tissue engineering and regenerative medicine. Biomedical Materials. 11 (2), 022003(2016).
  15. Gacek, G. Stereo microscope, neglected tool. Postepy Biochemii. 63 (1), 68-73 (2017).
  16. Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130(2019).
  17. The University of Texas at Austin Institutional Animal Care and Use Committee. Guidelines for the Use of Chemical Depilatory Agents on Laboratory Animals. , https://research.utexas.edu (2021).
  18. Sivridis, L., Kotini, A., Anninos, P. The process of learning in neural net models with Poisson and Gauss connectivities. Neural Networks. 21 (1), 28-35 (2008).
  19. León-Mancilla, B. H., Araiza-Téllez, M. A., Flores-Flores, J. O., Piña-Barba, M. C. Physico-chemical characterization of collagen scaffolds for tissue engineering. Journal of Applied Research and Technology. 14 (1), 77-85 (2016).
  20. León, A., et al. Hematological and biochemical parameters in Sprague Dawley laboratory rats breed in CENPALAB, Cenp:SPRD. Revista Electronica de Veterinaria. 12, 1-10 (2011).
  21. Tsuchiya, A., et al. Mesenchymal stem cell therapies for liver cirrhosis: MSCs as "conducting cells" for improvement of liver fibrosis and regeneration. Inflammation and Regeneration. 39, 18(2019).
  22. Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
  23. Acevedo, G. C. Xenoimplante de colágena en uretra de perro. Universidad Nacional Autónoma de México. , Specialty of Urology thesis (2011).
  24. Montalvo-Jave, E. E., et al. Absorbable bioprosthesis for the treatment of bile duct injury in an experimental model. International Journal of Surgery. 20, 163-169 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 172

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır