肝再生戦略としての三次元コラーゲンマトリックス足場移植

要約

肝疾患は、線維症や肝硬変を促進する多くの原因によって誘発される。移植は健康回復のための唯一の選択肢です。しかし、移植可能な臓器の不足を考えると、代替案を検討する必要があります。我々の研究は、動物モデルからの肝臓組織におけるコラーゲン足場の移植を提案する。

要約

肝臓病は世界中の主要な死因です。過度のアルコール摂取、高脂肪食、C型肝炎ウイルス感染は、線維症、肝硬変、および/または肝細胞癌を促進します。肝臓移植は、進行した疾患段階における患者の寿命を改善し、延長するための臨床的に推奨される手順である。しかし、移植の10%だけが成功し、臓器の入手可能性、術前および術後の処置、および上昇したコストはその結果と直接相関している。細胞外マトリックス(ECM)足場は、組織修復の代替手段として登場しました。生体適合性および移植片の受容は、これらの生体材料の主な有益な特性である。肝臓の大きさと正しい機能を回復する能力は肝臓肝切除モデルで評価されているが、押し出された肝臓質量の体積を置き換える足場または何らかの支持の使用は評価されていない。

部分的な肝切除術は、ウシのコンダイルからのコラーゲンマトリックス足場(CMS)の異種移植を伴うラット肝臓で行った。左肝葉組織を取り除き(約40%)、同じ割合のCMSを外科的に移植した。肝機能検査は、外科的処置の前後に評価された。3日目、14日、21日後、動物を安楽死させ、巨視的および組織学的評価を行った。3日目と14日目には、21日目に血管の新形化およびCMS再吸収と同様に、拒絶反応または感染の臨床的証拠を伴って、CMSを取り巻く脂肪組織が観察された。ヘマトキシリンとエオシン(H&E)とマッソンのトリクローム染色で観察されたCMSへの微小な炎症プロセスと隣接する細胞の移行の組織学的証拠があった。CMSは肝臓組織で良好なパフォーマンスを示し、慢性肝疾患における組織再生および修復を研究するための有用な代替手段となり得る。

概要

肝臓は、ホメオスタシスおよびタンパク質産生の維持に関与する最も重要な器官^{の1つである。}残念ながら、肝臓病は世界的に主要な死因です。肝硬変や肝細胞癌を含む肝臓損傷の進行段階では、肝臓移植が臨床的に推奨される手順です。しかし、ドナーの不足と移植の成功率が低いため、組織工学(TE)および再生医療(RM)における新しい技術が^2,3に開発された。

TEは、炎症、線維性、および浮腫性の器官および組織^1、5、6の回復を促進するために幹細胞^、足場、および成長因子4^を使用^{することを含む}。足場に使用される生体材料は、ネイティブECMを模倣し、誘導細胞リモデリング⁷のための物理的、化学的、生物学的手掛かりを提供する。コラーゲンは、真皮、腱、腸、心膜^8、9から得られる最も豊富なタンパク質の一つです。さらに、コラーゲンは、バイオプリンティングまたはエレクトロスピニング^10、11を介して二次元および3次元足場を生成するバイオポリマーとして得ることができる。このグループは、肝臓組織の再生のための骨源からのコラーゲンの使用を報告する最初のグループです。別の研究は、皮膚から得られたウシコラーゲンから合成された足場の使用を、均質で密接に位置する細孔で、それらの間に何の通信もせずに¹²を報告する。

脱細胞化は、ネイティブECMを保存し、幹細胞電位^13、14を有する細胞のその後の組み込みを可能^にする。しかし、この手順は、マウスから肝臓、心臓、腎臓、小腸、および尿膀胱の実験段階にまだあるが、ラット、ウサギ、豚、羊、牛、および馬^3、14。現在、切除された肝臓質量容積は、いずれの動物肝切除モデルにも置き換えられない。しかし、細胞増殖や血管新生を可能にする追加の支援またはネットワーク(生体材料)の使用は、肝臓の小葉機能の迅速な回復に不可欠である可能性があります。したがって、足場は慢性肝疾患の組織を再生または修復するための代替アプローチとして採用することができ、ひいては寄付や肝臓移植の臨床合併症による制限を排除する。

プロトコル

本研究は、国立大学オートノマ・デ・メヒコ(UNAM)医学部の倫理委員会(DI/115/2015)とメキシコ病院総合倫理委員会(CI/314/15)によって承認されました。この機関は、実験動物の生産、ケア、使用に関するすべての技術仕様を満たしており、国内法(NOM-062-ZOO-1999)によって法的に認定されています。この研究のために、150〜250g(生後6〜8週齢)の雄のウィスターラットを医学部の実験動物施設から得た。

1. 牛の大腿骨からコラーゲンマトリックス足場を得る

1. メキシコの保健・農業当局によって認定された食肉処理場から牛の大腿骨からコンディレを入手してください。
   1. 手術器具でコンディレの脂肪、筋肉、軟骨を慎重に解剖する。鋸カッターを使用してコンディレの断片を3cm x3 cmの断片に切り、タオルで脂肪と血液をきれいにします。コンディレの破片を水で洗います。
   2. 1Lのアニオン性洗剤(10g/L)で30分間沸騰させます( 92°C)。顆片を2回洗い、アニオン性洗剤の残骸を取り除きます。
   3. フィルターペーパー(0.5mm)を使用して、コンディレフラグメントを3時間乾燥させます。
2. ステップ 1.1 で述べた断片から厚さ 0.5 cm の三角形 (1 cm x 1 cm x1 cm) の CMS を準備します (図 1A)。
   1. 0.5 M HClの100 mLで一定の撹拌で10分間、断片を脱塩します。HCl を削除します。
      メモ:水酸化ナトリウム(10 M)でHClを中和します。
   2. 断片を100mLの蒸留水で3回、毎回15分、一定の攪拌ですすります。CMSを濾紙(0.5mm)で1時間乾燥させます。
   3. 立体顕微鏡¹⁵を用いて、CMSの構造特性(細孔の大きさ、細孔形成、多孔性相互接続)を解析する(図1B)。
   4. 走査型電子顕微鏡¹⁶を用いて、CMSの荒い表面を解析する(図1C)。
   5. CMSの機械的変化(可塑性と柔軟性)を評価するために、ブレンドとストレッチのための解剖器を使用してください(図1D)。
   6. CMSを殺菌パウチに詰め込み、過酸化水素プラズマで38分間殺菌します。滅菌されたCMSを使用するまで20〜25°Cの乾燥した場所に元のパックに保管してください。

2. 手術領域の準備と動物モデルの取り扱いと準備

1. 手術領域、作業台、マイクロサージャスト顕微鏡、および2%クロルヘキシジン溶液でシートを消毒します。すべての手術器具、手術用スポンジ、綿棒、および使い捨て手術用ドレープを熱殺菌(121 °C/30分/100kPa)で殺菌する
2. ラット(n=5)を1群あたり5匹のラット(1.シャム、2.肝切除術、3.肝切除術とCMS)の3つのグループに割り当て、3日目、14日、21日目にすべてのグループに従ってください。
   1. 後肢にケタミン(35mg/kg)およびキシラジン(2.5mg/kg)を筋肉内投与する。
      注:鎮静期間は通常30〜40分間持続します。
   2. 外科用石鹸と両刃を用いて腹部皮膚(5cm×2cm)を剃り、3ラウンド¹⁷で局所10%ポビドネヨウ素溶液を使用して皮膚を消毒する。
   3. 動物を褥瘡の後部位置の暖かいプレートの上に置き、頸部が透過性の気道を維持するために伸長した状態で(図2)。
   4. 呼吸パターンを通して麻酔の深さを評価し、手足の離脱反射の損失を評価する。
   5. 剃った皮膚の周りに使い捨ての外科用カーテンを置き、xiphoidプロセスを基準点として使用して、メスでアルボウラインに切開(2.5cm)を作ります。出血を防ぐために腹壁の血管を避けてください。
   6. 腹部リトラクタを所定の位置に置き、腹腔を観察します。解剖鉗子を用いて、左肝葉を抽出し、金属板の上に置く(図3A)。
      注:シャムグループでは、左肝葉を抽出し、肝臓を腹腔に戻すだけです。3-0ナイロン縫合糸で腹壁と皮膚を縫合します。
   7. CMSの有無にかかわらず実験群では、2つの切り傷でヘパテ切除術(約40%)を行うためにメスの刃および無菌のメスの刃(#15)を使用する。ヘパテクトミーを実行するには、三角形の金属テンプレート(1 cm x 1 cm x 1 cm)を使用します(図3B)。
   8. 肝臓の出血を防ぐために、5分間、肝臓の端に綿棒で外科的圧迫を維持する。
   9. 手術の前に20分間、生殖不能生理食塩水でCMSを水和する。肝切除部位に、生体材料の変位を防ぐために、肝臓組織とCMSの間の4つの縫合糸を移植する。7-0非吸収性ポリプロピレン縫合糸を使用する(図3C)。
      注意:2回目の手術で縫合糸を取り除かないでください。縫合糸は、CMS移植部位を特定するための基準として使用することができる。
   10. 肝臓を腹腔に戻し、3-0ナイロン縫合糸で腹壁と皮膚を縫合する。手術用ヨウ素浸しスポンジで外科的切開を2ラウンドで洗浄します。動物の生命徴候を観察し、監視する。

3. 術後ケア

1. 後肢に筋肉内でメグルミン・フリンチン(2.5mg/kg)を投与する。施設の動物のケアと使用委員会によって承認された鎮痛薬を管理します。
2. 麻酔回復のために、温度制御(23°C)と騒音のない区域の実験室の動物の寝具が付いている個々のポリカーボネート箱に動物を置く。
3. 動物の回復を観察し、2時間の水と食物の消費量を監視します。動物を監視は、機関の動物のケアと使用委員会によって承認されたように作動的に投稿します。

4. 血清中肝機能の評価

1. 外科的処置の前に麻酔動物の横尾静脈(ベースライン値)および評価日3、14、および21で血液サンプル(500 μL)を採取する。
2. 室温(23°C)で850 ×g/10分で血液サンプルを遠心分離します。血清を分離し、使用するまで-80°Cで保存してください。
3. 肝機能検査のパネルを行う:血清アルブミン(ALB)、アルカリホスファターゼ(ALP)、アラニンアミノトランスビセラーゼ(ALT)、アスパラギンアミノトランスビラーゼ(AST)、総ビリルビン(TB)、および直接ビリルビン(DB)(表1)。

5. 安楽死と組織管理

1. 上記のプロトコルに従って、評価(3日目、14日、21日)ごとに動物を麻酔する。
2. 制度的な動物のケアと使用委員会によって承認される方法を介して安楽死させる。
3. 頭皮を持つ アルボウスライン の切開(5〜6cm)を行い、腹腔の器官を観察し、CMSの有無にかかわらず、シャムと実験群の肝切除領域の写真を撮ります。
4. すべての研究グループ動物から肝臓サンプル(2cm x 2 cm;0.40-0.45 g)を採取し、その後の組織学的評価のために24時間4%ホルムアルデヒド溶液に入れます。

6. 組織学的分析

1. 肝臓組織を4%ホルムアルデヒドで保存し、アルコール濃度のシリーズ(60%、70%、80%、90%、100%)を使用して組織を脱水します。それらをキシレン(1h)に入れ、パラフィン¹⁶に埋め込む。
2. 8枚のスライドを作成するために、ミクロトームでパラフィンブロックを4μmの厚さのセクションに切ります。
3. H&Eとマッソンのトリクローム染色¹⁶を実行します。
4. 染色された切片を光顕微鏡で観察し、CMSの有無にかかわらず肝臓の代表的な領域を選択します。4倍、10倍、40倍の倍率で顕微鏡写真を取得し、適切なソフトウェア¹⁸を使用して画像を処理します( 資料表を参照)。

結果

骨脱塩は、元の形状や毛穴の相互接続を変更することなく、CMSの機械的特性に影響を与えます。CMSは任意の形状を有することができ、したがって、選択された器官または組織¹⁹の大きさおよび形状に調整することができる。本プロトコルでは、三角形のCMSを使用しました(図1A-D)。ラットモデルを用いて、肝臓にお?...

ディスカッション

臓器移植は、肝線維症または肝硬変患者における治療の主力である。いくつかの患者がこの処置の恩恵を受け、待機リストの患者に治療的代替手段を提供する必要がある。組織工学は、再生電位^2、4、13を有する足場と細胞^を採用する有望な戦略である。肝臓の一部の除去は、この血管化された器官の多量の出血のために?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anionic detergent	Alconox	Z273228
Biopsy cassettes	Leica	3802453
Camera DMX	Nikon	DXM1200F
Centrifuge	Eppendorf	5424
Chlorhexidine gluconate 4%	BD	372412
Cover glasses 25 mm x 40 mm	Corning	2980-224
Eosin	Sigma-Aldrich	200-M	CAS 17372-87-1
Ethyl alcohol, pure	Sigma-Aldrich	459836	CAS 64-17-5
Flunixine meglumide	MSD	Q-0273-035
Glass slides 75 mm x 25 mm	Corning	101081022
Hematoxylin	Merck	H9627	CAS 571-28-2
Hydrochloric acid 37%	Merck	339253	CAS 7647-01-0
Ketamine	Pisa agropecuaria	Q-7833-028
Light microscopy	Nikon	Microphoto-FXA
Microtainer yellow cape	Beckton Dickinson	365967
Microtome	Leica	RM2125
Model animal: Wistar rats	Universidad Nacional Autónoma de México
Nylon 3-0 (Dermalon)	Covidien	1750-41
Polypropylene 7-0	Atramat	SE867/2-60
Povidone-iodine10% cutaneous solution	Diafra SA de CV	1.37E+86
Scaning electronic microscopy	Zeiss	DSM-950
Sodium hydroxide, pellets	J. T. Baker	3722-01	CAS 1310-73-2
Software ACT-1	Nikon	Ver 2.70
Stereoscopy macroscopy	Leica	EZ4Stereo 8X-35X
Sterrad 100S	Johnson and Johnson	99970
Surgipath paraplast	Leica	39601006
Synringe of 1 mL with needle (27G x 13 mm)	SensiMedical	LAN-078-077
Tissue Processor (Histokinette)	Leica	TP1020
Tissue-Tek TEC 5 (Tissue embedder)	Sakura Finetek USA	5229
Trichrome stain kit	Sigma-Aldrich	HT15
Unicell DxC600 Analyzer	Beckman Coulter	BC 200-10
Xylazine	Pisa agropecuaria	Q-7833-099
Xylene	Sigma-Aldrich	534056	CAS 1330-20-7