Dreidimensionale Kollagenmatrix-Gerüstimplantation als Leberregenerationsstrategie

Zusammenfassung

Lebererkrankungen werden durch viele Ursachen verursacht, die Fibrose oder Zirrhose fördern. Die Transplantation ist die einzige Option zur Wiederherstellung der Gesundheit. Angesichts des Mangels an transplantierbaren Organen müssen jedoch Alternativen erforscht werden. Unsere Forschung schlägt die Implantation von Kollagengerüsten in Lebergewebe aus einem Tiermodell vor.

Zusammenfassung

Lebererkrankungen sind weltweit die häufigste Todesursache. Übermäßiger Alkoholkonsum, eine fettreiche Ernährung und eine Hepatitis-C-Virusinfektion fördern Fibrose, Zirrhose und / oder hepatozelluläres Karzinom. Die Lebertransplantation ist das klinisch empfohlene Verfahren zur Verbesserung und Verlängerung der Lebensdauer von Patienten in fortgeschrittenen Krankheitsstadien. Allerdings sind nur 10% der Transplantationen erfolgreich, wobei die Verfügbarkeit von Organen, prächirurgische und postoperative Eingriffe und erhöhte Kosten direkt mit diesem Ergebnis korrelieren. Extrazelluläre Matrix (ECM) -Gerüste haben sich als Alternative für die Gewebewiederherstellung herausgestellt. Biokompatibilität und Transplantatakzeptanz sind die wichtigsten vorteilhaften Eigenschaften dieser Biomaterialien. Obwohl die Fähigkeit, die Größe und korrekte Funktion der Leber wiederherzustellen, in Leberhepatektomiemodellen bewertet wurde, wurde die Verwendung von Gerüsten oder einer Art Unterstützung, um das Volumen der ausgedienten Lebermasse zu ersetzen, nicht bewertet.

Die partielle Hepatektomie wurde in einer Rattenleber mit der Xenoimplantation eines Kollagenmatrix-Gerüsts (CMS) aus einem Rinderkondylus durchgeführt. Linkes Leberlappengewebe wurde entfernt (ca. 40%), und ein gleicher Anteil von CMS wurde chirurgisch implantiert. Leberfunktionstests wurden vor und nach dem chirurgischen Eingriff ausgewertet. Nach den Tagen 3, 14 und 21 wurden die Tiere eingeschläfert und makroskopische und histologische Auswertungen durchgeführt. An den Tagen 3 und 14 wurde Fettgewebe um das CMS herum beobachtet, ohne klinische Hinweise auf Abstoßung oder Infektion, ebenso wie die Gefäßneubildung und die CMS-Reabsorption an Tag 21. Es gab histologische Hinweise auf einen unbedeutenden Entzündungsprozess und die Migration benachbarter Zellen zum CMS, beobachtet mit dem Hämatoxylin und Eosin (H & E) und der Trichromfärbung von Masson. Es wurde gezeigt, dass das CMS im Lebergewebe gut funktioniert und eine nützliche Alternative für die Untersuchung der Geweberegeneration und -reparatur bei chronischen Lebererkrankungen sein könnte.

Einleitung

Die Leber ist eines der wichtigsten Organe, die an der Aufrechterhaltung der Homöostase und der Proteinproduktion beteiligt sind¹. Leider sind Lebererkrankungen weltweit die häufigste Todesursache. In fortgeschrittenen Stadien der Leberschädigung, zu denen Zirrhose und hepatozelluläres Karzinom gehören, ist die Lebertransplantation das klinisch empfohlene Verfahren. Aufgrund des Mangels an Spendern und der geringen Rate erfolgreicher Transplantationen wurden jedoch neue Techniken im Tissue Engineering (TE) und in der regenerativen Medizin (RM) entwickelt^2,3.

TE beinhaltet die Verwendung von Stammzellen, Gerüsten und Wachstumsfaktoren^4, um die Wiederherstellung entzündeter, fibrotischer und ödematöser Organe und Gewebe zu fördern^1,5,6. Die in Gerüsten verwendeten Biomaterialien ahmen das native ECM nach und liefern die physikalischen, chemischen und biologischen Hinweise für den geführten zellulären Umbau⁷. Kollagen ist eines der am häufigsten vorkommenden Proteine, die aus der Dermis, der Sehne, dem Darm und dem Perikard gewonnen werden^8,9. Weiterhin kann Kollagen als Biopolymer erhalten werden, um durch Bioprinting oder Elektrospinnen zwei- und dreidimensionale Gerüste herzustellen^10,11. Diese Gruppe ist die erste, die über die Verwendung von Kollagen aus einer Knochenquelle für die Regeneration von Lebergewebe berichtet. Eine andere Studie berichtet über die Verwendung von Gerüsten, die aus Rinderkollagen synthetisiert wurden, das aus der Haut gewonnen wurde, mit homogenen und eng gelegenen Poren, ohne jegliche Kommunikation zwischen ihnen¹².

Die Dezellularisation bewahrt das native ECM und ermöglicht den anschließenden Einbau von Zellen mit Stammzellpotential^13,14. Dieses Verfahren befindet sich jedoch noch in der experimentellen Phase in Leber, Herz, Niere, Dünndarm und Harnblase von Mäusen, Ratten, Kaninchen, Schweinen, Schafen, Rindern und^Pferden3,¹⁴. Derzeit wird das resezierte Lebermassenvolumen in keinem der tierexperimentellen Hepatektomiemodelle ersetzt. Die Verwendung zusätzlicher Unterstützung oder eines Netzwerks (Biomaterialien), das die Zellproliferation und Angiogenese ermöglicht, könnte jedoch für die sofortige Wiederherstellung der Leberparenchymfunktionen unerlässlich sein. So könnten Gerüste als alternative Ansätze zur Regeneration oder Reparatur von Gewebe bei chronischen Lebererkrankungen eingesetzt werden, wodurch Wiederum Einschränkungen aufgrund von Spenden und klinischen Komplikationen der Lebertransplantation beseitigt werden.

Protokoll

Die vorliegende Forschung wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät (DI/115/2015) der Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) und der Ethikkommission des Hospital General de Mexico (CI/314/15) genehmigt. Die Einrichtung erfüllt alle technischen Spezifikationen für die Produktion, Pflege und Verwendung von Versuchstieren und ist nach nationalem Recht gesetzlich zertifiziert (NOM-062-ZOO-1999). Männliche Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 150-250 g (6-8 Wochen alt) wurden für diese Studie von der Labortiereinrichtung der School of Medicine, UNAM, erhalten.

1. Kollagenmatrix-Gerüste aus Rinder-Femur erhalten

1. Beziehen Sie den Kondylen aus rinderem Femur von einem Schlachthof, der von den Gesundheits- und Landwirtschaftsbehörden Mexikos zertifiziert ist.
   1. Sezieren Sie vorsichtig das Kondylenfett, den Muskel und den Knorpel mit einem chirurgischen Instrument. Schneiden Sie die Kondylfragmente mit einem Sägeschneider in 3 cm x3 cm große Fragmente und reinigen Sie das Fett und Blut mit einem Handtuch. Waschen Sie die Kondylfragmente mit Wasser.
   2. Die Fragmente mit 1 L eines anionischen Detergens (10 g/L) 30 min kochen (92 °C) kochen. Waschen Sie die Kondylfragmente zweimal, um Reste des anionischen Reinigungsmittels zu entfernen.
   3. Trocknen Sie die Kondylfragmente 3 h lang mit Filterpapier (0,5 mm).
2. Bereiten Sie ein dreieckiges (1 cm x1 cm x1 cm) CMS mit einer Dicke von 0,5 cm aus den in Schritt 1.1 genannten Fragmenten vor (Abbildung 1A).
   1. Entmineralisieren Sie die Fragmente in 100 mL 0,5 M HCl für 10 min unter ständiger Bewegung. Entfernen Sie die HCl.
      HINWEIS: Neutralisieren Sie das HCl mit Natriumhydroxid (10 M).
   2. Spülen Sie die Fragmente dreimal mit 100 ml destilliertem Wasser, jeweils 15 min, unter ständiger Bewegung. Trocknen Sie das CMS mit Filterpapier (0,5 mm) für 1 h.
   3. Verwenden Sie ein Stereomikroskop^15, um die strukturellen Eigenschaften des CMS (Größe der Poren, Porenbildung und poröse Verbindung) zu analysieren (Abbildung 1B).
   4. Verwenden Sie ein Rasterelektronenmikroskop^16, um die raue Oberfläche der CMS-Trabekeln zu analysieren (Abbildung 1C).
   5. Verwenden Sie das Dissektionsinstrument zum Mischen und Dehnen, um die mechanischen Änderungen (Plastizität und Flexibilität) des CMS zu bewerten (Abbildung 1D).
   6. Verpacken Sie das CMS in den Sterilisationsbeutel und sterilisieren Sie es mit Wasserstoffperoxidplasma für 38 min. Lagern Sie das sterile CMS in der Originalverpackung in einem trockenen Bereich bei 20-25 °C bis zum Gebrauch.

2. Vorbereitung des Operationsbereichs und Handhabung und Vorbereitung des Tiermodells

1. Desinfizieren Sie den Operationsbereich, den Arbeitstisch, das Mikrochirurgiemikroskop und den Sitz mit 2% iger Chlorhexidinlösung. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente, chirurgischen Schwämme, Tupfer und chirurgischen Einwegvorhänge durch Hitzesterilisation (121 °C/30 min/100 kPa)
2. Ordnen Sie die Ratten (n = 5) in drei Gruppen von fünf Ratten pro Gruppe ein: 1. Schein, 2. Hepatektomie und 3. Hepatektomie plus CMS, und folgen Sie allen Gruppen an den Tagen 3, 14 und 21 Tagen.
   1. Ketamin (35 mg/kg) und Xylazin (2,5 mg/kg) intramuskulär in der Hintergliedmaße verabreichen.
      HINWEIS: Die Beruhigungsphase dauert in der Regel 30-40 Minuten.
   2. Rasieren Sie die Bauchhaut (5 cm x 2 cm) mit chirurgischer Seife und einer zweischneidigen Klinge und desinfizieren Sie die Haut mit topischer 10% iger Povidon-Jod-Lösung in drei Runden¹⁷.
   3. Legen Sie das Tier auf eine warme Platte in der dorsalen Position des Dekubitus, wobei der Hals überdehnt ist, um einen durchlässigen Atemweg aufrechtzuerhalten (Abbildung 2).
   4. Bewerten Sie die Tiefe der Anästhesie durch das Atemmuster und den Verlust des Entzugsreflexes in den Gliedmaßen.
   5. Legen Sie einen chirurgischen Einwegvorhang um die rasierte Haut und machen Sie einen Schnitt (2,5 cm) auf der Albous-Linie mit einem Skalpell, wobei Sie den Xiphoid-Prozess als Referenzpunkt verwenden. Vermeiden Sie das Blutgefäß der Bauchdecke, um Blutungen zu vermeiden.
   6. Setzen Sie den Bauchretraktor ein und beobachten Sie die Bauchhöhle. Extrahieren Sie mit der Dissektionszange den linken Leberlappen und legen Sie ihn auf die Metallplatte (Abbildung 3A).
      HINWEIS: Extrahieren Sie in der Scheingruppe nur den linken Leberlappen und bringen Sie dann die Leber in die Bauchhöhle zurück. Nähen Sie die Bauchdecke und die Haut mit einer 3-0 Nylonnaht.
   7. Verwenden Sie in den experimentellen Gruppen mit und ohne CMS eine Skalpellklinge und eine sterile Skalpellklinge (# 15), um eine Hepatektomie (ca. 40%) mit zwei Schnitten durchzuführen. Verwenden Sie eine dreieckige Metallschablone (1 cm x 1 cm x 1 cm), um die Hepatektomie durchzuführen (Abbildung 3B).
   8. Um Blutungen der Leber zu verhindern, halten Sie die chirurgische Kompression mit einem Tupfer am Leberrand für 5 Minuten aufrecht.
   9. Hydratisieren Sie das CMS in steriler Kochsalzlösung für 20 minuten vor dem chirurgischen Eingriff. Implantieren Sie das CMS in die Hepatektomiestelle mit vier Stichnähten zwischen dem Lebergewebe und dem CMS, um eine Verschiebung des Biomaterials zu verhindern. Verwenden Sie 7-0 nicht resorbierbare Polypropylennähte (Abbildung 3C).
      HINWEIS: Entfernen Sie die Nähte nicht in einer zweiten Operation; Nähte können als Referenz verwendet werden, um die Stelle der CMS-Implantation zu identifizieren.
   10. Bringen Sie die Leber in die Bauchhöhle zurück und nähen Sie die Bauchdecke und die Haut mit einer 3-0 Nylonnaht. Reinigen Sie den chirurgischen Schnitt mit einem chirurgischen jodgetränkten Schwamm in zwei Runden. Beobachten und überwachen Sie die Vitalfunktionen der Tiere.

3. Postoperative Versorgung

1. Meglumin Flunixin (2,5 mg/kg) intramuskulär in der Hintergliedmaße verabreichen. Verabreichen Sie Analgetika, wie vom institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschuss genehmigt.
2. Zur Wiederherstellung der Anästhesie legen Sie die Tiere in einzelne Polycarbonatboxen mit Labortiereinstreu in einem geräuschfreien Bereich mit Temperaturkontrolle (23 °C).
3. Beobachten Sie die Erholung der Tiere und überwachen Sie ihren Wasser- und Futterverbrauch für 2 h. Überwachen Sie tiere postoperativ, wie vom institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschuss genehmigt.

4. Beurteilung der Leberfunktion im Serum

1. Sammeln Sie Blutproben (500 μL) aus den seitlichen Schwanzvenen der anästhesierten Tiere vor dem chirurgischen Eingriff (Ausgangswerte) und an den Bewertungstagen 3, 14 und 21.
2. Zentrifugieren Sie die Blutproben bei 850 × g/10 min bei Raumtemperatur (23 °C); Trennen Sie das Serum und lagern Sie es bis zur Verwendung bei -80 °C.
3. Führen Sie ein Panel von Leberfunktionstests durch: Serumalbumin (ALB), alkalische Phosphatase (ALP), Alaninaminotransferase (ALT), Aspartataminotransferase (AST), Gesamtbilirubin (TB) und direktes Bilirubin (DB) (Tabelle 1).

5. Euthanasie und Gewebemanagement

1. Betäuben Sie die Tiere für jede Bewertung (Tage 3, 14 und 21), indem Sie das oben beschriebene Protokoll befolgen.
2. Einschläfern sie mit Methoden, die vom institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschuss genehmigt wurden.
3. Führen Sie einen Schnitt (5-6 cm) an der Albous-Linie mit einem Skalpell durch, um die Organe der Bauchhöhle zu beobachten, und fotografieren Sie den Hepatektomiebereich des Scheins und der experimentellen Gruppen mit und ohne CMS.
4. Nehmen Sie Leberproben (2 cm x 2 cm; 0,40-0,45 g) von allen Tieren der Studiengruppe und geben Sie sie für 24 h in eine 4% ige Formaldehydlösung zur anschließenden histologischen Beurteilung.

6. Histologische Analyse

1. Konservieren Sie das Lebergewebe in 4% Formaldehyd und dehydrieren Sie das Gewebe mit einer Reihe von Alkoholkonzentrationen (60%, 70%, 80%, 90%, 100%); legen Sie sie in Xylol (1h) und betten Sie sie in Paraffin¹⁶ein.
2. Schneiden Sie die Paraffinblöcke mit einem Mikrotom in 4 μm dicke Abschnitte für die Vorbereitung von acht Objektträgern.
3. Führen Sie die trichrome Färbung von H&E und Masson^{durch 16}.
4. Beobachten Sie die gefärbten Abschnitte unter einem Lichtmikroskop, um die repräsentativen Bereiche der Leber mit und ohne CMS auszuwählen. Erhalten Sie Mikroaufnahmen mit 4-facher, 10-facher und 40-facher Vergrößerung und verarbeiten Sie die Bilder mit entsprechender Software¹⁸ (siehe Materialtabelle).

Ergebnisse

Die Knochendemineralisierung beeinflusst die mechanischen Eigenschaften von CMS, ohne die ursprüngliche Form oder Verbindung seiner Poren zuverändern. CMS kann jede Beliebige Form haben und kann daher an die Größe und Form des ausgewählten Organs oder Gewebes angepasst werden¹⁹. Im vorliegenden Protokoll haben wir ein dreieckiges CMS verwendet (Abbildung 1A-D). Ein Rattenmodell wurde verwendet, um die Regenerati...

Diskussion

Die Organtransplantation ist die Hauptstütze der Behandlung bei Patienten mit Leberfibrose oder Leberzirrhose. Einige wenige Patienten profitieren von diesem Verfahren, so dass es notwendig ist, therapeutische Alternativen für Patienten auf der Warteliste bereitzustellen. Tissue Engineering ist eine vielversprechende Strategie, die Gerüste und Zellen mit regenerativem Potenzial^{einsetzt 2,4,13}. Die Entfernung eines Teils der L...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anionic detergent	Alconox	Z273228
Biopsy cassettes	Leica	3802453
Camera DMX	Nikon	DXM1200F
Centrifuge	Eppendorf	5424
Chlorhexidine gluconate 4%	BD	372412
Cover glasses 25 mm x 40 mm	Corning	2980-224
Eosin	Sigma-Aldrich	200-M	CAS 17372-87-1
Ethyl alcohol, pure	Sigma-Aldrich	459836	CAS 64-17-5
Flunixine meglumide	MSD	Q-0273-035
Glass slides 75 mm x 25 mm	Corning	101081022
Hematoxylin	Merck	H9627	CAS 571-28-2
Hydrochloric acid 37%	Merck	339253	CAS 7647-01-0
Ketamine	Pisa agropecuaria	Q-7833-028
Light microscope	Nikon	Microphoto-FXA
Microsurgery stereomicroscope	Zeiss	OPMI F170
Microtainer yellow cape	Beckton Dickinson	365967
Microtome	Leica	RM2125
Model animal: Wistar rats	Universidad Nacional Autónoma de México
Nylon 3-0 (Dermalon)	Covidien	1750-41
Polypropylene 7-0	Atramat	SE867/2-60
Povidone-iodine10% cutaneous solution	Diafra SA de CV	1.37E+86
Scanning electronic microscope	Zeiss	DSM-950
Sodium hydroxide, pellets	J. T. Baker	3722-01	CAS 1310-73-2
Software ACT-1	Nikon	Ver 2.70
Stereomicroscope	Leica	EZ4Stereo 8X-35X
Sterrad 100S	Johnson and Johnson	99970
Surgipath paraplast	Leica	39601006
Synringe of 1 mL with needle (27G x 13 mm)	SensiMedical	LAN-078-077
Tissue Processor (Histokinette)	Leica	TP1020
Tissue-Tek TEC 5 (Tissue embedder)	Sakura Finetek USA	5229
Trichrome stain kit	Sigma-Aldrich	HT15
Unicell DxC600 Analyzer	Beckman Coulter	BC 200-10
Xylazine	Pisa agropecuaria	Q-7833-099
Xylene	Sigma-Aldrich	534056	CAS 1330-20-7