Implantation d’échafaudage à matrice de collagène tridimensionnelle comme stratégie de régénération du foie

Résumé

Les maladies du foie sont induites par de nombreuses causes qui favorisent la fibrose ou la cirrhose. La transplantation est la seule option pour retrouver la santé. Cependant, étant donné la rareté des organes transplantables, des alternatives doivent être explorées. Notre recherche propose l’implantation d’échafaudages de collagène dans le tissu hépatique à partir d’un modèle animal.

Résumé

Les maladies du foie sont la principale cause de décès dans le monde. Une consommation excessive d’alcool, un régime riche en graisses et une infection par le virus de l’hépatite C favorisent la fibrose, la cirrhose et / ou le carcinome hépatocellulaire. La transplantation hépatique est la procédure cliniquement recommandée pour améliorer et prolonger la durée de vie des patients à un stade avancé de la maladie. Cependant, seulement 10% des greffes sont réussies, avec la disponibilité des organes, les procédures préchirurgicales et postchirurgicales, et les coûts élevés directement corrélés avec ce résultat. Les échafaudages à matrice extracellulaire (ECM) sont apparus comme une alternative pour la restauration des tissus. La biocompatibilité et l’acceptation des greffons sont les principales caractéristiques bénéfiques de ces biomatériaux. Bien que la capacité de restaurer la taille et la fonction correcte du foie ait été évaluée dans des modèles d’hépatectomie hépatique, l’utilisation d’échafaudages ou d’une sorte de support pour remplacer le volume de la masse hépatique disparue du pays n’a pas été évaluée.

Une hépatectomie partielle a été réalisée dans un foie de rat avec la xénoimplantation d’un échafaudage à matrice de collagène (CMS) d’un condyle bovin. Le tissu du lobe hépatique gauche a été enlevé (environ 40%) et une proportion égale de CMS a été implantée chirurgicalement. Les tests de la fonction hépatique ont été évalués avant et après l’intervention chirurgicale. Après les jours 3, 14 et 21, les animaux ont été euthanasiés et des évaluations macroscopiques et histologiques ont été effectuées. Aux jours 3 et 14, du tissu adipeux a été observé autour de la CMS, sans signe clinique de rejet ou d’infection, tout comme la néoformation des vaisseaux et la réabsorption de la CMS au jour 21. Il y avait des preuves histologiques d’un processus d’inflammation insignifiant et de la migration des cellules adjacentes vers le CMS, observé avec l’hématoxyline et l’éosine (H & E) et la coloration trichrome de Masson. Il a été démontré que le CMS fonctionne bien dans le tissu hépatique et pourrait être une alternative utile pour étudier la régénération et la réparation des tissus dans les maladies hépatiques chroniques.

Introduction

Le foie est l’un des organes les plus importants impliqués dans le maintien de l’homéostasie et de la production de protéines¹. Malheureusement, les maladies du foie sont la principale cause de décès dans le monde. Aux stades avancés des lésions hépatiques, qui comprennent la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire, la transplantation hépatique est la procédure cliniquement recommandée. Cependant, en raison de la rareté des donneurs et du faible taux de greffes réussies, de nouvelles techniques en génie tissulaire (TE) et en médecine régénérative (RM) ont été développées^2,3.

TE implique l’utilisation de cellules souches, d’échafaudages et de facteurs de croissance⁴ pour favoriser la restauration des organes et tissus enflammés, fibrotiques et hédémateux^1,5,6. Les biomatériaux utilisés dans les échafaudages imitent l’ECM natif, fournissant les indices physiques, chimiques et biologiques pour le remodelage cellulaire guidé⁷. Le collagène est l’une des protéines les plus abondantes obtenues à partir du derme, du tendon, de l’intestin et du péricarde^8,9. De plus, le collagène peut être obtenu sous forme de biopolymère pour produire des échafaudages bidimensionnels et tridimensionnels par bio-impression ou électrofilage^10,11. Ce groupe est le premier à signaler l’utilisation de collagène provenant d’une source osseuse pour la régénération du tissu hépatique. Une autre étude rapporte l’utilisation d’échafaudages synthétisés à partir de collagène bovin, qui a été obtenu à partir de peau, avec des pores homogènes et étroitement situés, sans aucune communication entre eux¹².

La décellularisation préserve l’ECM natif, permettant l’incorporation ultérieure de cellules à potentiel de cellules souches^13,14. Cependant, cette procédure est encore en phase expérimentale dans le foie, le cœur, les reins, l’intestin grêle et la vessie de souris, de rats, de lapins, de porcs, de moutons, de bovins et de chevaux^3,14. Actuellement, le volume de masse hépatique réséqué n’est remplacé dans aucun des modèles d’hépatectomie animale. Cependant, l’utilisation d’un support ou d’un réseau supplémentaire (biomatériaux) qui permet la prolifération cellulaire et l’angiogenèse pourrait être essentielle pour la restauration rapide des fonctions parenchymateuses du foie. Ainsi, les échafaudages pourraient être utilisés comme approches alternatives pour régénérer ou réparer les tissus dans les maladies hépatiques chroniques, éliminant ainsi les limitations dues au don et aux complications cliniques de la transplantation hépatique.

Protocole

La présente recherche a été approuvée par le comité d’éthique de l’École de médecine (DI/115/2015) de l’Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) et le comité d’éthique de l’Hôpital général de Mexico (CI/314/15). L’institution répond à toutes les spécifications techniques pour la production, l’entretien et l’utilisation des animaux de laboratoire et est légalement certifiée par la législation nationale (NOM-062-ZOO-1999). Des rats Wistar mâles pesant de 150 à 250 g (âgés de 6 à 8 semaines) ont été obtenus auprès de l’installation pour animaux de laboratoire de l’École de médecine de l’UNAM pour cette étude.

1. Obtention d’échafaudages à matrice de collagène à partir du fémur bovin

1. Obtenir le condyle du fémur bovin dans un abattoir certifié par les autorités sanitaires et agricoles du Mexique.
   1. Disséquez soigneusement la graisse condyle, le muscle et le cartilage avec un instrument chirurgical. Coupez les fragments de condyle en fragments de 3 cm x 3 cm à l’aide d’un coupe-scie et nettoyez la graisse et le sang avec une serviette. Lavez les fragments de condyle avec de l’eau.
   2. Faire bouillir (92 °C) les fragments avec 1 L d’un détergent anionique (10 g/L) pendant 30 min. Lavez les fragments de condyle deux fois pour éliminer les restes du détergent anionique.
   3. Sécher les fragments de condyle pendant 3 h à l’aide de papier filtre (0,5 mm).
2. Préparer un CMS triangulaire (1 cm x1 cm x1 cm) d’épaisseur 0,5 cm à partir des fragments mentionnés à l’étape 1.1(Figure 1A).
   1. Déminéraliser les fragments dans 100 mL de 0,5 M HCl pendant 10 min avec une agitation constante. Retirez le HCl.
      REMARQUE: Neutraliser le HCl avec de l’hydroxyde de sodium (10 M).
   2. Rincez les fragments trois fois avec 100 mL d’eau distillée, 15 min à chaque fois, avec une agitation constante. Sécher le CMS avec du papier filtre (0,5 mm) pendant 1 h.
   3. Utilisez un stéréomicroscope¹⁵ pour analyser les propriétés structurelles du CMS (taille des pores, formation des pores et interconnexion poreuse)(Figure 1B).
   4. Utilisez un microscope électronique à balayage¹⁶ pour analyser la surface rugueuse des trabécules CMS (Figure 1C).
   5. Utilisez l’instrument de dissection pour le mélange et l’étirement afin d’évaluer les changements mécaniques (plasticité et flexibilité) du CMS(Figure 1D).
   6. Emballez le CMS dans la poche de stérilisation et stérilisez-le avec du plasma de peroxyde d’hydrogène pendant 38 min. Conserver le CMS stérile dans l’emballage d’origine dans un endroit sec à 20-25 °C jusqu’à utilisation.

2. Préparation de la zone chirurgicale et manipulation et préparation du modèle animal

1. Désinfectez la zone chirurgicale, la table de travail, le microscope de microchirurgie et le siège avec une solution de chlorhexidine à 2%. Stériliser tous les instruments chirurgicaux, l’éponge chirurgicale, les écouvillons et le drap chirurgical jetable par stérilisation thermique (121 °C/30 min/100 kPa)
2. Assignez les rats (n = 5) en trois groupes de cinq rats par groupe: 1. simulacre, 2. hépatectomie et 3. hépatectomie plus CMS, et suivez tous les groupes les jours 3, 14 et 21 jours.
   1. Administrer de la kétamine (35 mg/kg) et de la xylazine (2,5 mg/kg) par voie intramusculaire dans le membre postérieur.
      REMARQUE: La période sédative dure généralement de 30 à 40 minutes.
   2. Raser la peau abdominale (5 cm x 2 cm) à l’aide de savon chirurgical et d’une lame à double tranchant, et désinfecter la peau à l’aide d’une solution topique de povidone-iode à 10% en trois tours¹⁷.
   3. Placer l’animal sur une plaque chaude en position dorsale décubile, avec le cou hyperétendu pour maintenir des voies respiratoires perméables (Figure 2).
   4. Évaluer la profondeur de l’anesthésie à travers le schéma respiratoire et la perte du réflexe de sevrage dans les membres.
   5. Placez un drap chirurgical jetable autour de la peau rasée et faites une incision (2,5 cm) sur la ligne albous avec un scalpel, en utilisant le processus xiphoïde comme point de référence. Évitez le vaisseau sanguin de la paroi abdominale pour prévenir les saignements.
   6. Mettez le rétracteur abdominal en place et observez la cavité abdominale. À l’aide de la pince à dissection, extraire le lobe hépatique gauche et le placer sur la plaque métallique (Figure 3A).
      REMARQUE: Dans le groupe simulé, extrayez uniquement le lobe hépatique gauche, puis retournez le foie dans la cavité abdominale. Suturez la paroi abdominale et la peau avec une suture en nylon 3-0.
   7. Dans les groupes expérimentaux avec et sans CMS, utilisez une lame de scalpel et une lame de scalpel stérile (#15) pour effectuer une hépatectomie (environ 40%) avec deux coupes. Utiliser un gabarit métallique triangulaire (1 cm x 1 cm x 1 cm) pour effectuer l’hépatectomie(Figure 3B).
   8. Pour prévenir les saignements du foie, maintenez la compression chirurgicale avec un écouvillon sur le bord du foie pendant 5 min.
   9. Hydrater le CMS dans une solution saline stérile pendant 20 minutes avant l’intervention chirurgicale. Implantez le CMS dans le site de l’hépatectomie avec quatre sutures de points de suture entre le tissu hépatique et le CMS pour éviter le déplacement du biomatériau. Utilisez 7-0 sutures en polypropylène non résorbables(Figure 3C).
      REMARQUE: Ne retirez pas les sutures lors d’une deuxième chirurgie; les sutures peuvent être utilisées comme référence pour identifier le site d’implantation de CMS.
   10. Retournez le foie dans la cavité abdominale et suturez la paroi abdominale et la peau avec une suture en nylon 3-0. Nettoyez l’incision chirurgicale avec une éponge chirurgicale imbibée d’iode en deux tours. Observez et surveillez les signes vitaux des animaux.

3. Soins postopératoires

1. Administrer la méglumine flunixine (2,5 mg/kg) par voie intramusculaire dans le membre postérieur. Administrer les analgésiques approuvés par le comité de soins et d’utilisation des animaux de l’établissement.
2. Pour la récupération de l’anesthésie, placez les animaux dans des boîtes individuelles en polycarbonate avec litière pour animaux de laboratoire dans une zone sans bruit avec contrôle de la température (23 ° C).
3. Observez la récupération des animaux et surveillez leur consommation d’eau et de nourriture pendant 2 h. Surveiller les animaux après l’opération, tel qu’approuvé par le comité de soins et d’utilisation des animaux de l’établissement.

4. Évaluation de la fonction hépatique dans le sérum

1. Prélever des échantillons de sang (500 μL) dans les veines latérales de la queue des animaux anesthésiés avant l’intervention chirurgicale (valeurs de base) et aux jours d’évaluation 3, 14 et 21.
2. Centrifuger les échantillons de sang à 850 × g/10 min à température ambiante (23 °C); séparer le sérum et le conserver à -80°C jusqu’à utilisation.
3. Effectuer un panel de tests de la fonction hépatique : albumine sérique (ALB), phosphatase alcaline (ALP), alanine aminotransférase (ALT), aspartate aminotransférase (AST), bilirubine totale (TB) et bilirubine directe (DB)(Tableau 1).

5. Euthanasie et gestion des tissus

1. Anesthésiez les animaux pour chaque évaluation (jours 3, 14 et 21) en suivant le protocole décrit ci-dessus.
2. Euthanasier par des méthodes approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux.
3. Effectuer une incision (5-6 cm) sur la ligne albous avec un scalpel pour observer les organes de la cavité abdominale et prendre des photos de la zone d’hépatectomie du simulacre et des groupes expérimentaux, avec et sans le CMS.
4. Prélever des échantillons de foie (2 cm x 2 cm; 0,40-0,45 g) sur tous les animaux du groupe d’étude et les placer dans une solution de formaldéhyde à 4% pendant 24 h pour une évaluation histologique ultérieure.

6. Analyse histologique

1. Préserver les tissus hépatiques dans du formaldéhyde à 4% et déshydrater les tissus en utilisant une série de concentrations d’alcool (60%, 70%, 80%, 90%, 100%); placez-les dans du xylène (1h) et incrustez-les dans de la paraffine^16.
2. Coupez les blocs de paraffine avec un microtome en sections de 4 μm d’épaisseur pour la préparation de huit lames.
3. Effectuer la coloration trichrome de H&E et Masson¹⁶.
4. Observez les sections colorées au microscope optique pour sélectionner les zones représentatives du foie, avec et sans CMS. Obtenez des photomicrographies à grossissement 4x, 10x et 40x et traitez les images à l’aide du logiciel approprié¹⁸ (voir la Table des matériaux).

Résultats

La déminéralisation osseuse affecte les propriétés mécaniques du CMS sans altérer la forme d’origine ou l’interconnexion de sespores. CMS peut avoir n’importe quelle forme, et par conséquent, peut être ajusté à la taille et à la forme de l’organe ou du tissu sélectionné¹⁹. Dans le protocole actuel, nous avons utilisé un CMS triangulaire (Figure 1A-D). Un modèle de rat a été utilisé pour éva...

Discussion

La transplantation d’organes est le pilier du traitement chez les patients atteints de fibrose hépatique ou de cirrhose. Quelques patients bénéficient de cette procédure, ce qui rend nécessaire de fournir des alternatives thérapeutiques aux patients sur la liste d’attente. L’ingénierie tissulaire est une stratégie prometteuse qui utilise des échafaudages et des cellules à potentiel de régénération^2,4,13. L’a...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anionic detergent	Alconox	Z273228
Biopsy cassettes	Leica	3802453
Camera DMX	Nikon	DXM1200F
Centrifuge	Eppendorf	5424
Chlorhexidine gluconate 4%	BD	372412
Cover glasses 25 mm x 40 mm	Corning	2980-224
Eosin	Sigma-Aldrich	200-M	CAS 17372-87-1
Ethyl alcohol, pure	Sigma-Aldrich	459836	CAS 64-17-5
Flunixine meglumide	MSD	Q-0273-035
Glass slides 75 mm x 25 mm	Corning	101081022
Hematoxylin	Merck	H9627	CAS 571-28-2
Hydrochloric acid 37%	Merck	339253	CAS 7647-01-0
Ketamine	Pisa agropecuaria	Q-7833-028
Light microscope	Nikon	Microphoto-FXA
Microsurgery stereomicroscope	Zeiss	OPMI F170
Microtainer yellow cape	Beckton Dickinson	365967
Microtome	Leica	RM2125
Model animal: Wistar rats	Universidad Nacional Autónoma de México
Nylon 3-0 (Dermalon)	Covidien	1750-41
Polypropylene 7-0	Atramat	SE867/2-60
Povidone-iodine10% cutaneous solution	Diafra SA de CV	1.37E+86
Scanning electronic microscope	Zeiss	DSM-950
Sodium hydroxide, pellets	J. T. Baker	3722-01	CAS 1310-73-2
Software ACT-1	Nikon	Ver 2.70
Stereomicroscope	Leica	EZ4Stereo 8X-35X
Sterrad 100S	Johnson and Johnson	99970
Surgipath paraplast	Leica	39601006
Synringe of 1 mL with needle (27G x 13 mm)	SensiMedical	LAN-078-077
Tissue Processor (Histokinette)	Leica	TP1020
Tissue-Tek TEC 5 (Tissue embedder)	Sakura Finetek USA	5229
Trichrome stain kit	Sigma-Aldrich	HT15
Unicell DxC600 Analyzer	Beckman Coulter	BC 200-10
Xylazine	Pisa agropecuaria	Q-7833-099
Xylene	Sigma-Aldrich	534056	CAS 1330-20-7