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摘要

描述了两种相关方法，以可视化突触传递所需的亚细胞事件。这些方案能够使用 体外 培养神经元的活细胞成像实时监测突触前钙流入和突触囊泡膜融合的动态。

摘要

在神经元变性之前，肌萎缩性侧索硬化症（ALS）和/或额颞叶痴呆（FTLD）患者的运动和认知缺陷的原因是神经元与运动神经元和肌肉之间的通信功能障碍。突触传递的潜在过程涉及膜去极化依赖性突触囊泡融合和神经递质释放到突触中。该过程通过局部钙流入突触囊泡所在的突触前末端而发生。在这里，该协议描述了基于荧光的实时成像方法，该方法可靠地报告了培养神经元中去极化介导的突触囊泡胞吐作用和突触前末端钙流入动力学。

使用掺入突触囊泡膜的苯乙烯基染料，阐明突触囊泡释放。另一方面，为了研究钙的进入，使用Gcamp6m，一种遗传编码的荧光报告基因。我们采用高氯化钾介导的去极化来模仿神经元活动。为了明确地量化突触囊泡胞吐作用，我们测量归一化苯乙烯基染料荧光作为时间函数的损失。在类似的刺激条件下，在钙流入的情况下，Gcamp6m荧光增加。这种荧光变化的归一化和定量以与苯乙烯基染料方案类似的方式进行。这些方法可以与基于转染的荧光标记突变蛋白的过表达进行多重检测。这些方案已被广泛用于研究 FUS-ALS和 C9ORF72-ALS模型中的突触功能障碍，利用原代啮齿动物皮质和运动神经元。这些方案很容易允许快速筛选可能改善神经元通讯的化合物。因此，这些方法不仅对ALS的研究有价值，而且对神经退行性和发育性神经科学研究的所有领域都很有价值。

引言

由于超过 80% 的病例具有压倒性的散发性，再加上已知是致病性的大量基因突变2，因此在实验室中对肌萎缩性侧索硬化症 （ALS） 进行建模极具挑战性。尽管如此，所有ALS病例都有一个统一的特征，即在完全神经元变性之前，突触前运动神经元和突触后肌肉细胞之间存在功能障碍的通信3，4。临床上，当患者失去剩余的上下运动神经元的连接时，它们在整个疾病过程中表现出神经元过度和低兴奋性的特征5，6，7，8，9，反映了这些突触的复杂潜在分子变化，我们作为ALS研究人员试图理解这一点。

多种转基因模型表明，神经肌肉接头的恶化和紊乱随着ALS致病基因突变的表达而发生，包括SOD110，FUS11，12，C9orf7213，14，15，16和TDP4317，18，19 通过形态学评估，包括突触胸顿、脊柱密度和突触前/突触后组织的评估。从机制上讲，自20世纪30年代科尔，霍奇金和赫胥黎的里程碑式论文以来，还可以通过体外细胞培养或组织切片制剂中的电生理技术评估突触反应20。通过这些策略，许多ALS模型已经显示出突触传递缺陷。例如，TDP43的突变变体导致NSC-34（脊髓x神经母细胞瘤杂交细胞系34）运动神经元样细胞中的放电频率增强并降低动作电位阈值21。在小鼠模型中，这种相同的变异还会导致神经肌肉接头（NMJ）处的功能失调性突触传递，然后才出现行为运动缺陷22。先前显示，在运动缺陷发生之前，FUS-ALS果蝇模型中的突变FUS表达导致NMJ突触传递减少11。最近一份使用来自C9orf72扩增载体的诱导多能干细胞的报告显示，易释放的突触囊泡池减少23。总而言之，这些研究和其他研究强调了对ALS疾病相关模型中突触信号传导的潜在机制建立更全面理解的重要性。这对于了解ALS的病理生物学和为患者开发潜在的治疗靶点至关重要。

电流和电压钳位单元的方法在确定膜性质方面具有无可估量的价值，例如电导率，静息膜电位和单个突触的量子含量20，24。然而，电生理学的一个重大局限性是，它在技术上具有挑战性，并且一次只能提供来自单个神经元的见解。活细胞共聚焦显微镜，加上特定的荧光探针，为以时空方式研究神经元的突触传递提供了机会25，26，27。虽然不是神经元兴奋性的直接测量，但这种荧光方法可以相对测量突触功能的两种分子相关性:突触囊泡释放和突触末端的钙瞬变。

当动作电位到达神经元的突触前末端区域时，钙瞬变被触发，促进从电信号到神经递质释放过程的转变28。定位于这些区域的电压门控钙通道严格调节钙信号传导，以调节神经递质释放的动力学29。首次报道的基于荧光的钙瞬变记录是使用双波长指示剂Fura-2 AM或单波长染料Flu-3 AM30，31，32进行的。虽然这些染料在当时提供了很好的新见解，但它们存在一些局限性，例如细胞内非特异性区室化，标记细胞的主动或被动染料损失，光漂白以及长时间成像的毒性33。在过去的十年中，遗传编码的钙指示剂已成为对各种形式的神经元活动进行成像的主力军。这些指示剂将修饰的荧光蛋白与钙螯合蛋白结合，钙螯合蛋白在Ca2 + 离子结合后快速切换荧光强度34。这些新指标的应用范围很广，可以在体外和体内环境中更容易地可视化细胞内钙瞬变。这些基因编码报告基因的一个家族，称为GCaMP，现在被广泛使用。这些指示剂包含C端钙调蛋白结构域，后跟绿色荧光蛋白（GFP），并被N端钙调蛋白结合区覆盖35，36。钙与钙调蛋白结构域的结合触发与钙调蛋白结合区域的相互作用，导致整体蛋白质结构的构象变化和GFP部分荧光的显着增加35，36。多年来，这个报告员家族经历了几次演变，以便为具有特定动力学（慢，中和快）的特定钙瞬变提供不同的读数，每个都具有略微不同的性质37，38。在这里，已经强调了报告者GcaMP6的使用，其先前已被证明可以在体内和体外检测神经元中的单次动作电位和树突状钙瞬变37。

突触前区域的钙瞬变触发突触囊泡融合事件，导致神经递质释放到突触中并在突触后细胞中启动信号传导事件28，39。突触囊泡既能快速释放又可循环，因为细胞稳态地维持稳定的细胞膜表面积和易于释放的融合池，具有膜结合的囊泡40。这里使用的苯乙烯基染料对脂质膜具有亲和力，并根据周围脂质环境的顺序特异性地改变其发射特性41，42。因此，它是标记回收突触囊泡并随后跟踪这些囊泡的理想工具，因为它们随后在神经元刺激后释放41，42。已经生成和优化的方案是对Gaffield及其同事最初描述的概念的改编，这使我们能够随着时间的推移连续地可视化苯乙烯染料标记的突触囊泡点41。

在这里，描述了两种相关的基于荧光的方法，可靠地报告了突触传递中涉及的特定细胞事件。已经定义了方案来探测培养神经元中去极化介导的突触前终末期钙流入和突触囊泡胞吐作用的动力学。在这里，方法和代表性结果侧重于使用原代啮齿动物皮质或运动神经元作为体外模型系统，因为有已发表的使用这些细胞类型的研究43，44。然而，这些方法也适用于分化的人类i3皮质样神经元45，因为我们在实验室目前正在进行的实验中也成功地使用了这两种方案。一般协议以逐步线性格式概述，如图1所示。简而言之，为了研究神经突起中的钙动力学，成熟的神经元被质粒DNA转染，以在巨细胞病毒（CMV）启动子下表达荧光报告GCaMP6m37，46。转染的细胞具有低水平的基底绿色荧光，在钙的存在下增加。指定感兴趣的区域以监测整个操作过程中的荧光变化。这允许测量钙的高度空间和时间局部波动37，46。为了评估突触囊泡融合和释放，成熟的神经元被加载到掺入突触囊泡膜中的苯乙烯染料，因为它们被回收，重整并重新加载突触前细胞中的神经递质41，42，43，47，48。目前用于此目的的染料沿着神经突触囊泡标记，并在实时成像实验中用作这些区域的代表，正如Kraszewski及其同事对苯乙烯染料和突触标记素的共染色所显示的那样49。这里包括也进行了类似染色的代表性图像（图2A）。以前的研究人员广泛使用这种染料来报告神经肌肉接头和海马神经元的突触囊泡动力学48，49，50，51，52，53，54，55，56.通过选择含染料囊泡的点状区域并监测囊泡释放后荧光强度的降低，可以研究刺激后的功能突触传递能力和释放的时间动力学43。对于这两种方法，使用含有高浓度氯化钾的培养基来去极化细胞以模仿神经元活动。指定成像参数以捕获跨越基线归一化和刺激捕获周期的亚秒间隔。确定每个时间点的荧光测量值，归一化到背景，并在实验时间段内进行量化。钙流入介导的GCaMP6m荧光增加或有效的突触囊泡胞吐作用苯乙烯染料释放荧光减少可以通过该策略检测到。下面描述了这两种方案的详细方法设置和参数，并讨论了它们的优点和局限性。

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图 1:整体通用协议流程的可视化呈现。 （1） 在体外 分离并培养原代啮齿动物神经元到选定的成熟时间点。（2）引入GCaMP DNA或苯乙烯基染料作为突触活性的报告者。（3）使用配备实时成像的共聚焦显微镜和相关软件设置成像范例。开始基线记录期。（4）当细胞仍在进行实时图像捕获时，通过高KCl浴灌注刺激神经元。（5）评估荧光强度随时间的变化，以测量钙瞬变或突触囊泡融合。 请点击此处查看此图的放大版本。

研究方案

本研究中进行的所有动物程序均已获得杰斐逊大学机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 胚胎大鼠皮层神经元的原代培养

注意:原代皮质神经元从E17.5大鼠胚胎中分离出来，如前所述57，58。这种培养方案的成功似乎不存在菌株偏倚。下面简要介绍此方法。有关完整详细信息，应参考前面指出的文章。

  1. 通过吸入CO2 对怀孕的雌性大鼠实施安乐死，然后通过宫颈脱位进行二次确认。
  2. 在冰冷的20 mM HEPES缓冲汉克平衡盐溶液（HBSS）中收获胚胎并分离大脑。从外皮层壳中分离出来，然后丢弃纹状体和海马体。收集皮质。
  3. 使用细镊子从皮质中去除脑膜。为此，使用轻柔的压力，用一对封闭的镊子将皮层固定到位。
    注意:用第二对镊子放在第二只手上，捏住脑膜。用捏合的一对滚动运动剥离脑膜。用闭合的镊子重新定位，并根据需要重复，直到脑膜完全移除。
  4. 在37°C下用10μg/ mL木瓜蛋白酶在HBSS中孵育皮质4分钟。
  5. 在HBSS中洗涤三次，然后用火抛光玻璃巴斯德移液管轻轻研磨5-10次，以获得均匀的细胞悬浮液。
    注意:避免气泡;将移液管保持在细胞悬浮液内。
  6. 将神经元置于100μg/ mL聚-D-赖氨酸包被的35mm玻璃底培养皿上，密度为75，000个细胞/培养皿，在神经基质培养基中加入B27补充剂（2%）和青霉素 - 链霉素。

2. 胚胎大鼠脊髓运动神经元的原代培养

注意:原代运动神经元由E13.5大鼠胚胎制备，如前所述，几乎没有修饰59，60。这种培养方案的成功似乎不存在菌株偏倚。下面简要介绍此方法。有关完整详细信息，应参考上述文章。

  1. 对怀孕的雌性大鼠实施安乐死，如步骤1.1所示。
  2. 从胚胎中解剖10-20根脊髓，并使用两对镊子分别捏合和拉扯机械地分解成小碎片。
  3. 在0.025%胰蛋白酶中孵育8分钟，然后以1mg / mL加入DNase。
  4. 在4°C下通过4%w / v BSA垫在470× g 下离心5分钟，没有断裂。
  5. 在4°C下以830× g 离心沉淀细胞55分钟，无需制动，通过10.4%（v / v）密度梯度培养基（见 材料表）垫子。在视觉界面前移运动神经元带。
    注意:为确保捕获所有细胞，请在密度梯度步骤中使用无酚培养基，在所有其他步骤中使用含苯酚培养基。密度梯度和解离介质的界面基于色差很容易识别。
  6. 在4°C下以470× g 旋转收集的条带通过另一个4%w / v BSA垫5分钟，没有断裂。
  7. 将纯化的运动神经元重悬于含有 B27 补充剂 （2%）、谷氨酰胺 （0.25%）、2-巯基乙醇 （0.1%）、马血清 （2%） 和青霉素 -链霉素的完整神经基质中。
  8. 将神经元置于100μg/mL聚赖氨酸和3μg/mL层粘连蛋白包被盖玻片上，密度为50，000个细胞/35mm玻璃底培养皿。

3. 神经元转染

注意:此步骤是针对将进行GCaMP钙成像的神经元和/或在突触评估之前引入外源性DNA质粒或目标RNA的神经元进行的。相反，苯乙烯基染料在成像会议之前加载，并在第6节中解决。下面的摘要是所展示的示例中用于原代啮齿动物神经元的转染方案，但它可以很容易地根据用户的需求进行调整和优化。

  1. 培养的原代皮质神经元的转染 发生在体外 第12天（DIV 12），而运动神经元在第7天 体外 转染（DIV 7）。
    注意:以下所有步骤均在无菌生物安全柜内进行。
  2. 使用转染试剂以1:2的体积比转染500 ng GCaMP6m。对于共转染，总共加入1.25μg总DNA/培养皿，保持该DNA与试剂的比例。
    注意:在所示的实验实例中，已转染750ng感兴趣的ALS / FTD相关质粒以表达C9orf72-ALS连接二肽，突变FUS蛋白等。确保共转染质粒的荧光标记不会与GCaMP成像的FITC通道冲突。同样，如果进行苯乙烯基染料成像，请确保共转染的质粒不会与成像的TRITC通道发生冲突。在该方案中，突触生理素-GCaMP3的使用同样有效。因此，转染相同量的质粒，并按照第7节中的常规步骤进行操作。
  3. 将DNA转染试剂复合物在室温下孵育10分钟。
  4. 轻轻地将孵育的复合物加入神经元中，并旋转。将培养皿返回37°C的CO2 培养箱45-60分钟。
  5. 除去含有DNA转染试剂复合物的整个培养基，并用预处理和新鲜神经元培养基的50-50体积制备物代替。然后，将细胞放回CO2 培养箱48小时，直到成像。

4. 缓冲液和苯乙烯基染料储备溶液的制备

  1. 在成像之前，使用 表1中列出的成分使低和高aCSF溶液新鲜。使用前过滤两种缓冲溶液。
    注意:CaCl2 二水合物在储存时可形成Ca（OH）2 。为了获得最大的功效，请始终使用最近打开的容器。如果无法做到这一点，为了从外表面除去Ca（OH）2 并确保最大的溶解度，溶液可以在CaCl2添加之前用气态CO2 碳酸5 分钟。如果采取这一步骤，调整所得溶液的pH值以保持pH值为7.4，因为过量的碳酸化将导致Ca（HCO3）2 的形成。
低 KCL aCSF 缓冲液（pH 7.40 至 7.45）
试剂浓度
异丙酮10 毫米
氯化钠140 毫米
氯化钾5 毫米
葡萄糖10 毫米
氯化钙 2H2O2 兆米
氯化镁 4H2O1 毫米
高 KCL aCSF 缓冲液（pH 7.40 至 7.45）
试剂浓度
异丙酮10 毫米
氯化钠95 毫米
氯化钾50 毫米
葡萄糖10 毫米
氯化钙 2H2O2 兆米
氯化镁 4H2O1 毫米

表1:人工脑脊液（aCSF）缓冲液的组成。 该表包括用于制备低KCl和高KCl人工脑脊液缓冲液的成分，用于成像和刺激神经元。有关准备说明，请参阅第 4 节。

  1. 通过取100μg染料小瓶并将其与蒸馏水或神经基质培养基将其复构至10mM的储备浓度来制备苯乙烯基染料储备溶液。

5. 显微镜和灌注系统设置

注:对于成像玻璃底培养皿，由于灌注的灵活性和使用高数值孔径油浸物镜，因此首选倒置共聚焦荧光显微镜。请参阅 材料表 ，了解用于代表性 结果 部分详述的示例成像的共聚焦显微镜、相机和物镜。

  1. 使用培养箱系统耦合载物台安装座在 37 °C 下以恒定的 5% CO2 水平执行所有实验。
  2. 使用共聚焦软件控制图像采集。在成像会话开始时优化采集设置，以选择激励功率和增益，以确保信号的最佳可视化而不会出现光漂白。
    1. 在所有样品中保持激励功率、曝光时间、检测器增益和帧速率恒定。使用512 x 512的长宽比和2张图像/秒的帧速率进行延时成像，以最大限度地减少染料漂白。
      注意:虽然斑点应清晰可见，但激光强度应设置为尽可能小的尺寸，以避免漂白和光毒性。将共聚焦孔径设置为最窄设置，以实现神经突起内荧光点的最佳分辨率。曝光时间设置为200 ms或更短，在各个样品之间保持一致。所用相机的最大成像速度为2张/秒。如果使用更快的相机，可以拍摄更多的图像。如果可能，应选择时间影像学设置。
  3. 选择以下荧光激发/二向色性/发射滤光片组合，以使用共聚焦软件进行成像:分别使用FITC的Gcamp6m/Gcamp3和带有TRITC的苯乙烯染料。
  4. 在延时成像期间使用共聚焦成像软件的完美对焦功能，以避免 z轴漂移。
    注:由于成像速度快，可对单个平面进行成像。确保在实验过程中没有z漂移非常重要。
  5. 选择图像采集面板中的" 时间 "选项卡以设置录制周期和间隔。
    1. 将 阶段 #1 设置为 间隔 500 毫秒，持续时间 3 - 5 分钟。
    2. 将 阶段 #2 设置为 间隔 500 毫秒，持续时间 5 分钟。
      注意:阶段#1对应于基线记录，阶段#2分别对应于刺激期。
  6. 使用阀门控制系统和通道歧管组装用于aCSF的重力灌注装置。
    1. 将高KCl（见 表1）加载到设备顶部的50 mL注射器中，管道穿过系统。将流速设置为 1 mL/min。
  7. 将含有神经元的35毫米玻璃培养皿装载到共聚焦成像台上，并将灌注管的末端放置在培养皿边缘。选择要成像的字段。

6. 突触囊泡释放的苯乙烯染料成像

  1. 将细胞在低KCl aCSF（见 表1）中孵育10分钟，在37°C，转染后48小时。
  2. 用苯乙烯基染料将初级皮质或运动神经元加载到玻璃底培养皿上。
    1. 通过抽吸去除低 KCl aCSF。
    2. 使用移液器在黑暗中用10μM苯乙烯染料在含有50mM KCl的aCSF中加载神经元5分钟。
    3. 除去上样溶液并在低KCl aCSF中浸泡神经元10分钟，以消除非特异性染料上样。
  3. 将35 mm玻璃底培养皿放在成像台上，然后在倒置共聚焦显微镜的20倍空气物镜或40倍油浸物镜下观察。
    注意:使用GFP荧光定位转染的细胞，以防细胞与GFP标记的质粒共同转染。
  4. 使用546 nm激光激发苯乙烯染料，使用630-730 nm（TRITC）带通滤光片收集发射。
  5. 选择成像领域并实现完美对焦。接下来，拍摄具有明场，TRITC和荧光标记通道的单个静止图像以标记神经元边界。
  6. 在采集软件中启动 "立即运行" 。进行基础记录3-5分钟，以排除染料强度的变化（如果有的话）（阶段#1）。
    注意:必须确保染料强度的任何降低都是由于突触囊泡释放，而不是被动染料扩散或光漂白。这3-5分钟的预刺激期应导致稳定和维持的染料强度水平。该记录的最后30秒将用于确定每个ROI的平均基线荧光值。在评估实验条件之前，还可以使用预期的采集设置执行约10分钟的连续记录的额外非刺激条件，以确保长时间使用激光设置的稳定荧光值。
  7. 在切换到阶段 #2 时，触发灌注系统的" 在 "按钮上。然后，不断将50mM KCl灌注到神经元中，以促进染料卸载（阶段#2）。
    1. 在添加KCl后进行300秒的录制。在此之后，获取停止;触发灌注系统的 关闭 开关。
  8. 保存实验并使用共聚焦软件分析数据，如下文第8节所述。
    注意:此时可能会停止实验，稍后可以执行分析。在细胞不需要转染来表达目的蛋白的情况下，当寻求检查突触卸载的功能时，可以在 体外 的任何时间点执行该协议。在对照细胞进行测试以确保适当的突触卸载之后，实验者应对测试的每个培养皿的遗传或药理条件视而不见，以尽量减少偏倚。

7. Gcamp6m钙瞬变的荧光成像

  1. 转染在35毫米玻璃底培养皿上培养的原代啮齿动物皮质神经元，其中Gcamp6m为500ng，如第3节所示。
    注意:如果需要，用含有红色或远红色荧光标记的目标质粒共同转染神经元。
  2. 转染后48小时，用低KCl aCSF孵育神经元15分钟，然后将培养皿安装在成像平台上。
  3. 使用 FITC 滤光片 （488 nm） 和 20 倍或 40 倍物镜可视化 GCaMP6m 荧光。
  4. 选择成像领域并实现完美对焦。接下来，拍摄具有明场，FITC和荧光标记通道的单个静止图像以标记神经元边界。
  5. 在采集软件中启动 "立即运行" 。进行基线记录5分钟，然后以与第6节中描述的相同方式用含有50 mM KCL的acSF灌注苯乙烯染料实验。
    注:该影像学检查的目的是测量诱发的钙瞬变。如果神经元在刺激前期具有基础放电活性和钙通量，则不用于数据分析。相反，仅使用具有稳定背景荧光的细胞。对于钙瞬变，刺激后的时间也可以延长至 60 分钟，伴或不伴额外的连续高 KCl 灌注。
  6. 保存实验并使用共聚焦软件分析数据，如下文第8节所述。此时可以停止实验，稍后可以执行分析。
    注意:如果细胞不需要转染来表达目的蛋白，则在寻求检查钙瞬变时，可以在 体外 的任何时间点进行该方案。在对照细胞进行测试以确保测量钙瞬变之后，实验者应对所测试的每个培养皿的遗传或药理条件视而不见，以尽量减少偏倚。

8. 图像分析

  1. 使用共聚焦软件打开延时图像。
  2. 通过命令系列在延时系列中对齐 图像:图像|加工|对齐当前文档。选择" 与第一帧对齐"。
  3. 使用ROI选择工具（图像框右侧的豆形图标）沿神经突选择感兴趣区域（ROI）（图3B）。此外，标记表示背景荧光强度的ROI。
    注:ROI是通过沿着明场静止图像指示的神经元轨迹选择明显分离的点的区域来选择的。每个神经元至少选择五个ROI进行分析。背景 ROI 是在不包含神经突的视场区域中选择的。
  4. 使用以下命令系列测量选定投资回报率随时间变化的原始荧光: 测量|时间测量。
    1. 在"时间 测量 "面板的上半部分启动 测量 功能。生成原始荧光随时间变化的图形表示（图3C）和定量数据。
      注意:每个数据点表示与该特定测量时间点关联的帧的 ROI 的原始荧光。
  5. 将原始荧光强度导出到电子表格软件。
  6. 独立分析每个投资回报率。首先，通过从每个时间点的兴趣强度的 ROI 中减去背景 ROI 强度来规范化数据。
    1. 从每个特定时间点的背景ROI中取原始荧光值，并从该时间点的目标ROI原始强度值中减去该荧光值。
      注意:这是在整个记录期间完成的，包括基础和刺激阶段。
  7. 确定基线最后 30 秒的兴趣强度的平均 ROI。
    1. 在步骤8.6中从3-5分钟的基础记录期的最后30秒开始平均归一化的原始基础值。
      注意:整个基础记录期可用于生成此值。但是，当此值稳定并保持时，最后 30 秒的 60 个时间点具有足够的采样大小来表示整体。
  8. 将此基线值与每个时间点的归一化强度值进行比较，从而产生荧光（ΔF）值的变化。
    1. 取步骤8.7中的值并减去平均基线荧光值。在整个记录期间（基础阶段和刺激阶段）执行此步骤和后续步骤。
  9. 计算有关基线荧光值的此变化，生成荧光/基线荧光（ΔF/F）的变化。为此，取步骤8.8中的值并将其除以平均基线荧光值。
  10. 最后，将起始点值设置为 1，以便随着时间的推移，可以轻松地以图形方式可视化增加或减少。
    1. 取步骤 8.9 中生成的值，然后加 1。
      注意:正确完成此操作后，基准周期值的 30 秒应悬停在值 1 附近。在有效释放突触内容物的细胞中，该值应在刺激开始后从1趋势变为0。步骤 6-9 的示例如图 3E 所示。

9. 数据分析

注意:实验者可以不受实验条件的束缚，以便适当地汇集数据进行分析。使用来自三个独立实验中每个条件的至少10个神经元的样本量。仅当可以指定至少五个ROI区域时，才考虑将神经元纳入其中。在已发表的研究中，这种实验复制水平足以证明与GFP对照相比，ALS相关多GA细胞突触卸载的严重丧失（见 代表性结果）。但是，如果观察到更微妙的表型，则可能需要用户优化生物和/或技术重复的数量。

  1. 使用给定实验条件的投资回报率随时间推移计算的所有ΔF/F值，确定每个时间点的平均ΔF/F值以及SEM。
  2. 使用 xy 格式的图形和统计软件程序绘制数据，其中 x 是经过的时间，y 是在步骤 9.1 中计算的 ΔF/F 值。将所有值显示为均值± SEM。
  3. 要确定统计显著性，请使用学生 t 检验比较两组，使用单向方差分析 （ANOVA），然后使用 Tukey 的后角分析来比较三个或更多组。

结果

在成功实施上述方案后，显示了典型苯乙烯染料突触囊泡释放实验的代表性结果。使用第6节中描述的方法将培养的大鼠初级皮质神经元加载染料。染料上样量的特异性通过与突触囊泡标记突触蛋白共标记来确定。大多数苯乙烯染料阳性puncta对该标记物是共阳性的（图2A）。为了确定用于苯乙烯基染料成像的设置是否会导致光漂白，通常，在未处理的孔中加载染料并在没有刺?...

讨论

所描述的两种方法共有的三个步骤对于实验成功和可量化的结果至关重要。首先，按照所附说明，在每轮实验之前准备新鲜的aCSF是必不可少的。如果不这样做，可能会阻止适当的神经元去极化。在刺激任何实验组之前，应不断测试未经治疗的对照神经元样本，以确保适当的细胞去极化，并为在该成像过程中获得的积极结果提供基准。其次，为了成功跟踪特定突触区域随时间变化的荧光，在设置成...

披露声明

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

我们要感谢杰斐逊·温伯格ALS中心的现任和前任成员，他们为优化这些技术及其分析提供了重要的反馈和建议。这项工作得到了NIH（RF1-AG057882-01和R21-NS0103118到D.T），NINDS（R56-NS092572和R01-NS109150到P.P），肌肉萎缩症协会（D.T.），罗伯特帕卡德ALS研究中心（D.T.），Family Strong 4 ALS基金会和Farber家庭基金会（B.K.J.，K.K.和P.P.）的资助。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
20x air objectiveNikonFor imaging
40x oil immersion objectiveNikonFor imaging
B27 supplementThermo Scientific17504044Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mLThermo Scientific13-689-8Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hoodBakerSterilGARD III SG403AAsceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-MercaptoethanolMillipore SigmaM3148For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum AlbuminMillipore SigmaA9418For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrateMillipore Sigma223506Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubatorThermo Scientific13-998-123For culturing and maintenance of neurons
CentrifugeEppendorf5810RFor neuronal culture preparation
Confocal microscopeNikonEclipse Ti +A1R coreFor fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD cameraPhotometricsFor image acquisition
D-GlucoseMillipore SigmaG8270Component of aCSF solutions
DNaseMillipore SigmaD5025For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley ratsCharles river400SASSDFor preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cubeNikon77032509For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dyeInvitrogenT13320For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5)CellVisD35-10-1.5-NFor growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipetteGrainger52NK56For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Millipore SigmaH6648For preparing neuronal cultures
HEPESMillipore SigmaH3375Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)For imaging. Please see recipes*
horse serumMillipore SigmaH1138For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hoodNUAIRENU-301-630For preparing neuronal cultures
LamininThermo Scientific23017015For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 MediumThermo Scientific11415064For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol redThermo Scientific21083027For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM)Thermo Scientific25030149Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermo Scientific11668019For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)For imaging. Please see recipes*
Magnesium chlorideMillipore Sigma208337Component of aCSF solutions
Microsoft ExcelMicrosoftSoftware for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PESThermo Scientific565-0020Filter unit for aCSF solution
Neurobasal mediumThermo Scientific21103049For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced ResearchNikonSoftware for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubesThermo Scientific339650For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubesThermo Scientific339652For preparing neuronal culture and buffer solutions
OptiprepMillipore SigmaD1556For preparing neuronal cultures
PapainMillipore SigmaP4762For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Scientific15140122To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion systemWarner InstrumentsSF-77BFor exchange of aCSF
Perfusion tubingCole-ParmerUX-30526-14Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmidAddgene40754For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromideMillipore SigmaP7886Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chlorideMillipore SigmaP3911Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonateMillipore SigmaS5761Component of aCSF solutions
Sodium ChlorideMillipore SigmaS9888Component of aCSF solutions
Stage Top IncubatorTokai HitFor incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cubeNikon77032809For imaging FM4-64
Trypsin InhibitorMillipore SigmaT6414For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redThermo Scientific25200056For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation tableNew PortVIP320X2430-135520Table/stand for microscope

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