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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Sono descritti due metodi correlati per visualizzare gli eventi subcellulari necessari per la trasmissione sinaptica. Questi protocolli consentono il monitoraggio in tempo reale della dinamica dell'afflusso di calcio presinaptico e della fusione della membrana delle vescicole sinaptiche utilizzando l'imaging a cellule vive di neuroni in coltura in vitro .

Abstract

Prima della degenerazione neuronale, la causa dei deficit motori e cognitivi nei pazienti con sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e /o demenza del lobo frontotemporale (FTLD) è la disfunzione della comunicazione tra neuroni e motoneuroni e muscoli. Il processo sottostante della trasmissione sinaptica coinvolge la fusione delle vescicole sinaptiche dipendenti dalla depolarizzazione della membrana e il rilascio di neurotrasmettitori nella sinapsi. Questo processo avviene attraverso l'afflusso localizzato di calcio nei terminali presinaptici dove risiedono le vescicole sinaptiche. Qui, il protocollo descrive metodologie di live-imaging basate sulla fluorescenza che riportano in modo affidabile l'esocitosi delle vescicole sinaptiche mediate dalla depolarizzazione e le dinamiche di afflusso terminale di calcio presinaptico nei neuroni in coltura.

Utilizzando un colorante stirilico incorporato nelle membrane delle vescicole sinaptiche, viene chiarito il rilascio di vescicole sinaptiche. D'altra parte, per studiare l'ingresso del calcio, viene utilizzato Gcamp6m, un reporter fluorescente geneticamente codificato. Impieghiamo una depolarizzazione ad alto contenuto mediata da cloruro di potassio per imitare l'attività neuronale. Per quantificare l'esocitosi delle vescicole sinaptiche in modo inequivocabile, misuriamo la perdita di fluorescenza normalizzata del colorante stirilico in funzione del tempo. In condizioni di stimolazione simili, in caso di afflusso di calcio, aumenta la fluorescenza di Gcamp6m. La normalizzazione e la quantificazione di questo cambiamento di fluorescenza vengono eseguite in modo simile al protocollo del colorante stirilico. Questi metodi possono essere multiplexati con sovraespressione basata sulla trasfezione di proteine mutanti marcate fluorescentemente. Questi protocolli sono stati ampiamente utilizzati per studiare la disfunzione sinaptica in modelli di FUS-ALS e C9ORF72-ALS, utilizzando i neuroni corticali e motori dei roditori primari. Questi protocolli consentono facilmente uno screening rapido di composti che possono migliorare la comunicazione neuronale. In quanto tali, questi metodi sono preziosi non solo per lo studio della SLA, ma per tutte le aree della ricerca neurodegenerativa e delle neuroscienze dello sviluppo.

Introduzione

La modellazione della sclerosi laterale amiotrofica (SLA) in laboratorio è resa particolarmente impegnativa a causa della natura estremamente sporadica di oltre l'80% dei casi1, insieme al vasto numero di mutazioni genetiche note per essere causative della malattia2. Nonostante ciò, tutti i casi di SLA condividono la caratteristica unificante che prima della degenerazione neuronale vera e propria, esiste una comunicazione disfunzionale tra motoneuroni presinaptici e cellule muscolari postsinaptiche3,4. Clinicamente, poiché i pazienti perdono la connettività dei restanti motoneuroni superiori e inferiori, presentano caratteristiche di iper- e ipoeccitabilità neuronale in tutta la malattia5,6,7,8,9, riflettendo complessi cambiamenti molecolari sottostanti a queste sinapsi, che noi, come ricercatori della SLA, cerchiamo di capire.

Molteplici modelli transgenici hanno dimostrato che il deterioramento e la disorganizzazione della giunzione neuromuscolare si verificano con l'espressione di mutazioni genetiche causative della SLA, tra cui SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 e TDP4317,18,19 attraverso valutazioni morfologiche, compresa la valutazione dei bouton sinaptici, delle densità della colonna vertebrale e dell'organizzazione pre/postsinaptica. Meccanicamente, a partire dai documenti di riferimento di Cole, Hodgkin e Huxley nel 1930, è stato anche possibile valutare le risposte sinaptiche attraverso tecniche elettrofisiologiche in colture cellulari in vitro o preparazioni di fette di tessuto20. Attraverso queste strategie, molti modelli di SLA hanno dimostrato deficit di trasmissione sinaptica. Ad esempio, una variante mutante di TDP43 provoca una maggiore frequenza di attivazione e diminuisce la soglia del potenziale d'azione nelle cellule simili a motoneuroni NSC-34 (midollo spinale x neuroblastoma ibrido linea 34)21. Questa stessa variante causa anche la trasmissione sinaptica disfunzionale alla giunzione neuromuscolare (NMJ) prima dell'insorgenza di deficit motori comportamentali in un modello murino22. In precedenza è stato dimostrato che l'espressione di FUS mutante provoca una ridotta trasmissione sinaptica all'NMJ in un modello di drosophila di FUS-ALS prima dei difetti locomotori11. Un recente rapporto che utilizza cellule staminali pluripotenti indotte derivate da portatori di espansione C9orf72 ha rivelato una riduzione del pool prontamente rilasciabile di vescicole sinaptiche23. Complessivamente, questi studi e altri evidenziano l'importanza di costruire una comprensione più completa dei meccanismi alla base della segnalazione sinaptica nei modelli rilevanti per la malattia della SLA. Questo sarà fondamentale per comprendere la patobiologia della SLA e sviluppare potenziali bersagli terapeutici per i pazienti.

I metodi delle celle di serraggio di corrente e tensione sono stati preziosi nel determinare le proprietà della membrana come la conduttanza, il potenziale di membrana a riposo e il contenuto quantico delle singole sinapsi20,24. Tuttavia, uno dei limiti significativi dell'elettrofisiologia è che è tecnicamente impegnativo e fornisce solo approfondimenti da un singolo neurone alla volta. La microscopia confocale a cellule vive, accoppiata con specifiche sonde fluorescenti, offre l'opportunità di indagare la trasmissione sinaptica dei neuroni in modo spaziotemporale25,26,27. Sebbene non sia una misura diretta dell'eccitabilità neuronale, questo approccio di fluorescenza può fornire una misura relativa di due correlazioni molecolari della funzione sinaptica: rilascio di vescicole sinaptiche e transienti di calcio ai terminali sinaptici.

Quando un potenziale d'azione raggiunge la regione terminale presinaptica dei neuroni, si innescano transitori di calcio, facilitando la transizione da un segnale elettrico al processo di rilascio di neurotrasmettitori28. I canali del calcio voltaggio-dipendenti localizzati in queste aree regolano strettamente la segnalazione del calcio per modulare la cinetica del rilascio dei neurotrasmettitori29. Le prime registrazioni riportate a fluorescenza di transienti di calcio sono state eseguite utilizzando l'indicatore a doppia lunghezza d'onda Fura-2 AM o il colorante a singola lunghezza d'onda Fluo-3 AM30,31,32. Mentre questi coloranti offrivano grandi nuove intuizioni all'epoca, soffrono di diverse limitazioni come la compartimentazione non specifica all'interno delle cellule, la perdita di colorante attiva o passiva dalle cellule etichettate, il fotosbiancamento e la tossicità se ripresi per lunghi periodi di tempo33. Negli ultimi dieci anni, gli indicatori di calcio geneticamente codificati sono diventati i cavalli di battaglia per l'imaging di varie forme di attività neuronale. Questi indicatori combinano una proteina fluorescente modificata con una proteina chelante di calcio che cambia rapidamente l'intensità di fluorescenza dopo il legame degli ioni Ca2+34. L'applicazione di questi nuovi indicatori è vasta, consentendo una visualizzazione molto più semplice dei transitori intracellulari di calcio sia in vitro che in vivo. Una famiglia di questi reporter geneticamente codificati, nota come GCaMP, è ora ampiamente utilizzata. Questi indicatori contengono un dominio calmodulina C-terminale, seguito da una proteina fluorescente verde (GFP), e sono coperti da una regione di legame con la calmodulina N-terminale35,36. Il legame del calcio al dominio calmodulina innesca un'interazione con la regione di legame con la calmodulina, con conseguente cambiamento conformazionale nella struttura complessiva della proteina e un sostanziale aumento della fluorescenza della porzione GFP35,36. Nel corso degli anni, questa famiglia di reporter ha subito diverse evoluzioni per consentire letture distinte per particolari transienti di calcio con cinetica specifica (lenta, media e veloce), ognuno con proprietà leggermente diverse37,38. Qui, è stato evidenziato l'uso del reporter GcaMP6, che ha precedentemente dimostrato di rilevare potenziali d'azione singoli e transitori di calcio dendritico nei neuroni sia in vivo che in vitro37.

I transienti di calcio nella regione presinaptica innescano eventi di fusione delle vescicole sinaptiche, causando il rilascio di neurotrasmettitori nella sinapsi e l'inizio di eventi di segnalazione nella cellula postsinaptica28,39. Le vescicole sinaptiche vengono rilasciate rapidamente e riciclate, poiché la cellula mantiene omeostaticamente una superficie di membrana cellulare stabile e un pool prontamente rilasciabile di vescicole legate alla membrana in grado di fusione40. Il colorante stirilico qui utilizzato ha un'affinità verso le membrane lipidiche e cambia specificamente le sue proprietà di emissione in base all'ordinamento dell'ambiente lipidico circostante41,42. Pertanto, è uno strumento ideale per etichettare le vescicole sinaptiche di riciclaggio e il successivo tracciamento di queste vescicole in seguito alla stimolazione neuronale41,42. Il protocollo che è stato generato e ottimizzato è un adattamento dei concetti descritti inizialmente da Gaffield e colleghi, che ci consente di visualizzare continuamente la puntura di vescicole sinaptiche marcate con colorante stirilico nel tempo41.

Qui vengono descritte due metodologie correlate basate sulla fluorescenza, che riportano in modo affidabile eventi cellulari specifici coinvolti nella trasmissione sinaptica. Sono stati definiti protocolli per sondare la dinamica dell'afflusso terminale di calcio presinaptico mediato dalla depolarizzazione e dell'esocitosi delle vescicole sinaptiche nei neuroni in coltura. Qui, i metodi e i risultati rappresentativi si concentrano sull'uso di neuroni corticali o motoneuroni primari dei roditori come sistema modello in vitro, poiché ci sono studi pubblicati che utilizzano questi tipi di cellule43,44. Tuttavia, questi metodi sono applicabili anche ai neuroni corticali i3 umani differenziati45, poiché abbiamo anche avuto successo con entrambi i protocolli nella sperimentazione attualmente in corso nel nostro laboratorio. Il protocollo generale è delineato in un formato lineare graduale, mostrato nella Figura 1. In breve, per studiare la dinamica del calcio nei neuriti, i neuroni maturi vengono trasfettati con DNA plasmidico per esprimere il reporter fluorescente GCaMP6m sotto un promotore del citomegalovirus (CMV)37,46. Le cellule trasfettate hanno un basso livello di fluorescenza verde basale, che aumenta in presenza di calcio. Le regioni di interesse sono specificate per monitorare i cambiamenti di fluorescenza durante la nostra manipolazione. Ciò consente di misurare fluttuazioni del calcio altamente localizzate spazialmente e temporalmente37,46. Per valutare la fusione e il rilascio delle vescicole sinaptiche, i neuroni maturi vengono caricati con colorante stirilico incorporato nelle membrane delle vescicole sinaptiche mentre vengono riciclati, riformati e ricaricati con neurotrasmettitori nelle cellule presinaptiche41,42,43,47,48. Gli attuali coloranti utilizzati a questo scopo etichettano le vescicole sinaptiche lungo i neuriti e sono usati come proxy per queste regioni in esperimenti di imaging dal vivo, come è stato dimostrato dalla co-colorazione del colorante stirilico e della sinaptotagmina di Kraszewski e colleghi49. Qui sono incluse immagini rappresentative di colorazioni simili che sono state eseguite (Figura 2A). Precedenti ricercatori hanno ampiamente utilizzato tali coloranti per riportare la dinamica delle vescicole sinaptiche alla giunzione neuromuscolare e ai neuroni dell'ippocampo48,49,50,51,52,53,54,55,56 . Selezionando regioni puntiformi di vescicole cariche di colorante e monitorando le diminuzioni dell'intensità di fluorescenza dopo il rilascio delle vescicole, la capacità di trasmissione sinaptica funzionale e la dinamica temporale di rilascio possono essere studiate dopo la stimolazione43. Per entrambi i metodi, un mezzo contenente un'alta concentrazione di cloruro di potassio viene impiegato per depolarizzare le cellule per imitare l'attività neuronale. I parametri di imaging sono specificati per catturare intervalli inferiori al secondo che coprono una normalizzazione di base seguita dal nostro periodo di cattura della stimolazione. Le misure di fluorescenza in ogni punto temporale sono determinate, normalizzate sullo sfondo e quantificate nel periodo di tempo sperimentale. L'aumento della fluorescenza GCaMP6m mediato dall'afflusso di calcio o l'efficace diminuzione della fluorescenza dell'esocitosi delle vescicole sinaptiche styryl dye release può essere rilevata attraverso questa strategia. Di seguito sono descritti la configurazione metodologica dettagliata e i parametri per questi due protocolli e una discussione sui loro vantaggi e limiti.

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Figura 1: Rendering visivo del processo generale del protocollo generale. (1) Isolare e coltivare i neuroni primari dei roditori in vitro fino al punto temporale di maturazione scelto. (2) Introdurre il DNA GCaMP o il colorante stirilico come reporter dell'attività sinaptica. (3) Impostare il paradigma di imaging utilizzando il microscopio confocale dotato di live-imaging e il software associato. Inizia il periodo di registrazione di base. (4) Mentre le cellule sono ancora in fase di acquisizione di immagini dal vivo, stimolare i neuroni attraverso un'elevata perfusione del bagno KCl. (5) Valutare le misurazioni dell'intensità di fluorescenza nel tempo per misurare i transitori di calcio o la fusione delle vescicole sinaptiche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

Tutte le procedure animali eseguite in questo studio sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Jefferson University.

1. Coltura primaria di neuroni dalla corteccia embrionale di ratto

NOTA: I neuroni corticali primari sono isolati dagli embrioni di ratto E17.5 come descritto in precedenza57,58. Nessun bias di ceppo sembra esistere con il successo di questo protocollo di coltivazione. Questo metodo è descritto brevemente di seguito. Gli articoli precedenti indicati dovrebbero essere referenziati per i dettagli completi.

  1. Eutanasia di femmine di ratto gravide per inalazione di CO2 seguita da conferma secondaria per lussazione cervicale.
  2. Raccogli embrioni e isola cervelli in una soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) ghiacciata da 20 mM tamponata da HEPES. Dal guscio esterno della corteccia, separare e quindi scartare lo striato e l'ippocampo. Raccogli le cortecce.
  3. Utilizzare una pinza fine per rimuovere le meningi dalle cortecce. Per fare questo, tenere la corteccia in posizione con un paio di pinze chiuse usando una leggera pressione.
    NOTA: Con il secondo paio di pinze nella lancetta dei secondi, pizzicare le meningi. Staccare le meningi usando il movimento rotolante con coppia pizzicata. Riposizionare con la pinza chiusa e ripetere se necessario fino a quando le meningi non vengono completamente rimosse.
  4. Incubare le cortecce con 10 μg/mL di papaina in HBSS per 4 minuti a 37 °C.
  5. Lavare tre volte in HBSS e quindi triturare delicatamente 5-10 volte con una pipetta Pasteur in vetro ignifugo per ottenere una sospensione cellulare omogenea.
    NOTA: Evitare le bolle; mantenere la pipetta all'interno della sospensione cellulare.
  6. Neuroni a piastra su 100 μg/mL di poli-D-lisina rivestiti con piatti con fondo di vetro da 35 mm ad una densità di 75.000 cellule/piatto in mezzo neurobasale con integratore di B27 (2%) e penicillina-streptomicina.

2. Coltura primaria di motoneuroni dal midollo spinale embrionale di ratto

NOTA: I motoneuroni primari sono preparati da embrioni di ratto E13.5 come descritto in precedenza, con poche modifiche59,60. Nessun bias di ceppo sembra esistere con il successo di questo protocollo di coltivazione. Questo metodo è descritto brevemente di seguito. Gli articoli precedenti indicati devono essere referenziati per i dettagli completi.

  1. Eutanasia delle femmine di ratto gravide come nella fase 1.1.
  2. Seziona 10-20 midollo spinale da embrioni e rompi in piccoli frammenti meccanicamente usando due paia di pinze per pizzicare e tirare, rispettivamente.
  3. Incubare in tripsina allo 0,025% per 8 minuti, seguita dall'aggiunta di DNasi a 1 mg/ml.
  4. Centrifugare attraverso un cuscino BSA al 4% p/v a 470 x g per 5 minuti a 4 °C senza interruzioni.
  5. Centrifugare celle pellettate per 55 min a 830 x g a 4 °C senza freno attraverso un cuscino di gradiente di densità del 10,4% (v/v) (vedi Tabella dei materiali). Portare avanti la banda del motoneurone all'interfaccia visiva.
    NOTA: per garantire l'acquisizione di tutte le celle, utilizzare un supporto privo di fenolo per la fase del gradiente di densità e un supporto contenente fenolo per tutti gli altri passaggi. L'interfaccia del gradiente di densità e dei mezzi di dissociazione è facilmente identificabile in base alla differenza di colore.
  6. Spin ha raccolto bande attraverso un altro cuscino BSA del 4% p/v a 470 x g per 5 minuti a 4 °C senza interruzioni.
  7. Risospendo motoneuroni purificati in mezzo neurobasale completo con integratore B27 (2%), glutammina (0,25%), 2-mercaptoetanolo (0,1%), siero equino (2%) e penicillina-streptomicina.
  8. Neuroni a piastra su 100 μg/mL di poli-lisina e 3 μg/mL di coverslip rivestiti di laminina ad una densità di 50.000 cellule/piatto con fondo di vetro da 35 mm.

3. Trasfezioni neuronali

NOTA: Questo passaggio viene eseguito per i neuroni che saranno sottoposti a imaging del calcio GCaMP e / o neuroni in cui viene introdotto un plasmide di DNA esogeno o RNA di interesse prima della valutazione sinaptica. Al contrario, il colorante stirilico viene caricato poco prima della sessione di imaging e viene affrontato nella sezione 6. Il riassunto che segue è il protocollo di trasfezione utilizzato per i neuroni primari dei roditori negli esempi presentati, ma può essere facilmente adattato e ottimizzato alle esigenze dell'utente.

  1. Le trasfezioni per i neuroni corticali primari in coltura si verificano al giorno 12 in vitro (DIV 12), mentre i motoneuroni vengono trasfettati al giorno 7 in vitro (DIV 7).
    NOTA: tutti i seguenti passaggi si verificano all'interno di un armadio di biosicurezza asettico.
  2. Trasfettura 500 ng di GCaMP6m utilizzando il reagente di trasfezione in un rapporto di 1:2 in volume. Per le co-trasfezioni, aggiungere un totale di 1,25 μg di DNA/piatto totale, mantenendo questo rapporto DNA/reagente.
    NOTA: Negli esempi sperimentali mostrati, 750 ng di plasmide correlato alla SLA/FTD di interesse è stato trasfettato per esprimere dipeptidi legati a C9orf72-ALS, proteina FUS mutante, ecc. Assicurarsi che il tag fluorescente del plasmide co-trasfettato non entri in conflitto con il canale FITC dell'imaging GCaMP. Allo stesso modo, se si esegue l'imaging del colorante stirilico, assicurarsi che il plasmide co-trasfettato non entri in conflitto con il canale di imaging TRITC. L'uso di sinaptofisina-GCaMP3 è ugualmente efficace in questo protocollo. Pertanto, trasfettare la stessa quantità di questo plasmide e seguire tutti i passaggi come al solito nel paragrafo 7.
  3. Incubare il complesso reagente di trasfezione del DNA a temperatura ambiente per 10 minuti.
  4. Aggiungere delicatamente il complesso incubato ai neuroni dropwise con vortice. Riportare il piatto all'incubatore a CO2 a 37 °C per 45-60 min.
  5. Rimuovere l'intero terreno di coltura contenente il complesso di reagenti di trasfezione del DNA e sostituirlo con una preparazione 50-50 per volume di mezzi neuronali pre-condizionati e freschi. Quindi, rimettere le cellule nell'incubatore a CO2 per 48 ore fino all'imaging.

4. Preparazione di soluzioni tampone e soluzione madre di colorante stirilico

  1. Preparare soluzioni aCSF basse e alte fresche prima dell'imaging utilizzando gli ingredienti elencati nella Tabella 1. Filtrare entrambe le soluzioni tampone prima dell'uso.
    NOTA: CaCl2 diidrato può formare Ca(OH)2 al momento della conservazione. Per la massima efficacia, utilizzare sempre un contenitore aperto di recente. Se ciò non è possibile, per rimuovere Ca(OH)2 dalla superficie esterna e garantire la massima solubilità, le soluzioni possono essere gassate con CO2 gassosa per 5 minuti prima dell'aggiunta di CaCl2 . Se viene effettuato questo passaggio, regolare il pH della soluzione risultante per mantenere un valore di pH di 7,4, poiché un'eccessiva carbonatazione comporterà la formazione di Ca(HCO3)2 .
Tampone aCSF a basso KCL (pH da 7,40 a 7,45)
ReagenteConcentrazione
HEPES ·10 mM
NaCl140 metri quadrati
Kcl5 mM
Glucosio10 mM
CaCl2 2H2O2 mM
MgCl2 4H2O1 mM
Tampone ACSF ad alto KCL (pH da 7,40 a 7,45)
ReagenteConcentrazione
HEPES ·10 mM
NaCl95 metri quadrati
Kcl50 metri quadrati
Glucosio10 mM
CaCl2 2H2O2 mM
MgCl2 4H2O1 mM

Tabella 1: Composizione dei tamponi del liquido cerebrospinale artificiale (aCSF). Questa tabella include gli ingredienti per la preparazione di tamponi del liquido cerebrospinale artificiale a basso e alto KCl utilizzati durante l'imaging e la stimolazione dei neuroni. Vedere paragrafo 4 per le istruzioni di preparazione.

  1. Preparare la soluzione madre di colorante stirilico prendendo un flaconcino di colorante da 100 μg e ricostituendolo ad una concentrazione di riserva di 10 mM con acqua distillata o mezzo neurobasale.

5. Configurazione del microscopio e del sistema di perfusione

NOTA: per l'imaging di piastre di Petri con fondo di vetro, è preferibile un microscopio a fluorescenza confocale invertita a causa della flessibilità della perfusione e per l'uso di un obiettivo ad immersione in olio ad alta apertura numerica. Fare riferimento alla Tabella dei materiali per il microscopio confocale, la fotocamera e gli obiettivi utilizzati per l'imaging di esempi dettagliati nella sezione Risultati rappresentativi .

  1. Esegui tutti gli esperimenti a 37 °C con livelli costanti di CO2 del 5% utilizzando un supporto a stadio accoppiato al sistema di incubatore.
  2. Controlla l'acquisizione delle immagini utilizzando un software confocale. Ottimizza le impostazioni di acquisizione all'inizio della sessione di imaging per scegliere la potenza di eccitazione e il guadagno per garantire una visualizzazione ottimale dei segnali senza fotosbiancamento.
    1. Mantieni costante la potenza di eccitazione, il tempo di esposizione, il guadagno del rilevatore e il frame rate su tutti i campioni. Esegui l'imaging time-lapse utilizzando un rapporto di aspetto di 512 x 512 e un frame rate di 2 immagini / s per ridurre al minimo lo sbiancamento del colorante.
      NOTA: Mentre la puncta dovrebbe essere chiaramente visibile, l'intensità del laser dovrebbe essere impostata al minimo possibile per evitare sbiancamento e fototossicità. Impostare l'apertura confocale sull'impostazione più stretta per ottenere una risoluzione ottimale della puncta fluorescente all'interno dei neuriti. Il tempo di esposizione è impostato su 200 ms o meno, coerente tra i campioni. La velocità massima di imaging della fotocamera utilizzata è stata di 2 immagini/s. Se si utilizza una fotocamera più veloce, è possibile scattare più immagini. Se possibile, è necessario scegliere le impostazioni di imaging temporale.
  3. Selezionare le seguenti combinazioni di filtri di eccitazione/dicroico/emissione a fluorescenza per l'imaging utilizzando software confocale: Gcamp6m/Gcamp3 con FITC e colorante stirilico con TRITC, rispettivamente.
  4. Utilizza la perfetta funzione di messa a fuoco del software di acquisizione di immagini confocali durante l'imaging time-lapse per evitare la deriva z.
    NOTA: a causa della rapida velocità di imaging, viene ripreso un singolo piano. Garantire la mancanza di z-drift durante l'esperimento è molto importante.
  5. Selezionate la scheda Tempo nel pannello di acquisizione delle immagini per impostare i periodi e gli intervalli di registrazione.
    1. Impostare fase #1 su Intervallo 500 ms, Durata 3 - 5 min.
    2. Impostare Fase #2 su Intervallo 500 ms, Durata 5 min.
      NOTA: La fase #1 corrisponde alla registrazione al basale, la fase #2 al periodo di stimolazione, rispettivamente.
  6. Assemblare l'apparato di perfusione gravitazionale per aCSF utilizzando un sistema di controllo della valvola e un collettore di canale.
    1. Caricare KCl elevato (vedi Tabella 1) in una siringa da 50 mL nella parte superiore dell'apparecchio, con tubi che attraversano il sistema. Impostare la portata a 1 mL/min.
  7. Caricare una parabola di vetro da 35 mm contenente neuroni sullo stadio di imaging confocale, con l'estremità del tubo di perfusione posizionata sul bordo del piatto. Scegli il campo per l'imaging.

6. Imaging del colorante stirilico del rilascio di vescicole sinaptiche

  1. Incubare cellule in aCSF a basso KCl (vedi Tabella 1) per 10 minuti a 37 °C, 48 ore dopo la trasfezione.
  2. Caricare i neuroni corticali o motori primari su piastre di Petri a fondo di vetro con colorante stirilico.
    1. Rimuovere l'aCSF a basso KCl per aspirazione.
    2. Utilizzare una pipetta per caricare i neuroni al buio con 10 μM di colorante stirilico in aCSF contenente 50 mM KCl per 5 minuti.
    3. Rimuovere la soluzione di carico e i neuroni del bagno in basso KCl aCSF per 10 minuti per eliminare il carico di colorante non specifico.
  3. Posizionare la parabola con fondo di vetro da 35 mm sullo stadio di imaging, quindi osservare sotto un obiettivo aereo 20x o un obiettivo di immersione in olio 40x di un microscopio confocale invertito.
    NOTA: utilizzare la fluorescenza GFP per individuare le cellule trasfettate in caso di cellule co-trasfettate con un plasmide con tag GFP.
  4. Eccitare il colorante stirilico utilizzando un laser a 546 nm, raccogliere l'emissione utilizzando un filtro passa-banda da 630-730 nm (TRITC).
  5. Seleziona il campo di imaging e attiva la messa a fuoco perfetta. Quindi, scatta una singola immagine fissa con canali di marcatori a campo luminoso, TRITC e fluorescenza per contrassegnare i confini neuronali.
  6. Avvia Esegui ora nel software di acquisizione. Effettuare la registrazione basale per 3-5 minuti per escludere variazioni nell'intensità del colorante, se presenti (Fase #1).
    NOTA: È essenziale assicurarsi che qualsiasi diminuzione dell'intensità del colorante sia dovuta al rilascio di vescicole sinaptiche e non alla diffusione passiva del colorante o al fotosbiancamento. Questo periodo di pre-stimolazione di 3-5 minuti dovrebbe comportare un livello di intensità del colorante costante e mantenuto. Gli ultimi 30 s di questa registrazione verranno utilizzati per determinare un valore medio di fluorescenza basale per ciascun ROI. Prima di valutare le condizioni sperimentali, è anche possibile eseguire un'ulteriore condizione di non stimolazione di circa 10 minuti di registrazione continua utilizzando le impostazioni di acquisizione previste per garantire valori di fluorescenza costanti utilizzando le impostazioni laser per un periodo prolungato.
  7. Al passaggio alla fase #2, attivare il pulsante On per il sistema di perfusione. Quindi, perfonde costantemente 50 mM KCl ai neuroni per facilitare lo scarico del colorante (Fase #2).
    1. Effettuare registrazioni per 300 s dopo l'aggiunta di KCl. Dopo questo, l'acquisizione si ferma; attivare l'interruttore Off per il sistema di perfusione.
  8. Salva l'esperimento e analizza i dati utilizzando un software confocale come descritto nella sezione 8 di seguito.
    NOTA: l'esperimento può essere interrotto a questo punto e l'analisi può essere eseguita in un secondo momento. Nel caso in cui le cellule non richiedano la trasfezione per l'espressione di proteine di interesse, questo protocollo può essere eseguito in qualsiasi momento in vitro quando si cerca di esaminare la funzionalità dello scarico sinaptico. A seguito di un test delle cellule di controllo per garantire un corretto scarico sinaptico, lo sperimentatore deve essere cieco alle condizioni genetiche o farmacologiche di ciascun piatto testato per ridurre al minimo i pregiudizi.

7. Imaging a fluorescenza dei transienti di calcio Gcamp6m

  1. Trasfettare i neuroni corticali primari dei roditori coltivati su piatti con fondo di vetro da 35 mm con 500 ng di Gcamp6m come indicato nel paragrafo 3.
    NOTA: Se lo si desidera, co-trasfettare i neuroni con un plasmide di interesse contenente un tag fluorescente nell'intervallo rosso o rosso lontano.
  2. Incubare i neuroni con basso KCl aCSF per 15 min 48 h post-trasfezione e quindi montare la parabola sulla piattaforma di imaging.
  3. Visualizza la fluorescenza GCaMP6m utilizzando un filtro FITC (488 nm) e un obiettivo 20x o 40x.
  4. Seleziona il campo di imaging e attiva la messa a fuoco perfetta. Quindi, scatta una singola immagine fissa con canali di marcatori a campo luminoso, FITC e fluorescenza per contrassegnare i confini neuronali.
  5. Avvia Esegui ora nel software di acquisizione. Effettuare la registrazione al basale per 5 minuti, quindi perfusare con aCSF contenente 50 mM KCL nello stesso modo descritto nel paragrafo 6 per gli esperimenti sul colorante stirilico.
    NOTA: l'obiettivo di questa immagine è misurare i transitori di calcio evocati. Se un neurone ha attività di attivazione basale e flussi di calcio durante il periodo di pre-stimolazione, non viene utilizzato nell'analisi dei dati. Invece, vengono utilizzate solo cellule con fluorescenza di fondo stabile. I periodi post-stimolazione possono anche essere estesi a 60 minuti per i transitori di calcio, con o senza ulteriore perfusione continua ad alto KCl.
  6. Salva l'esperimento e analizza i dati utilizzando un software confocale come descritto nella sezione 8 di seguito. L'esperimento può essere interrotto a questo punto e l'analisi può essere eseguita in un secondo momento.
    NOTA: Se le cellule non richiedono la trasfezione per l'espressione di proteine di interesse, questo protocollo può essere eseguito in qualsiasi momento in vitro quando si cerca di esaminare i transitori di calcio. A seguito di un test delle cellule di controllo per garantire la misurazione dei transitori di calcio, lo sperimentatore deve essere cieco alle condizioni genetiche o farmacologiche di ciascun piatto testato per ridurre al minimo i pregiudizi.

8. Analisi delle immagini

  1. Apri immagini time-lapse con software confocale.
  2. Allineare le immagini in serie time-lapse per la serie di comandi : Immagine | | di elaborazione Allinea documento corrente. Selezionate Allinea al primo fotogramma.
  3. Selezionare le regioni di interesse (ROI) lungo i neuriti utilizzando lo strumento di selezione del ROI, un'icona a forma di fagiolo a destra della cornice dell'immagine (Figura 3B). Inoltre, contrassegna un ROI che rappresenta l'intensità della fluorescenza di fondo.
    NOTA: i ROI vengono selezionati scegliendo aree di punti nettamente separati lungo le tracce neuronali indicate dall'immagine fissa in campo luminoso. Almeno cinque ROI per neurone sono scelti per l'analisi. Il ROI di sfondo viene scelto in una regione del campo visivo che non contiene neuriti.
  4. Misurare la fluorescenza grezza nel tempo per i ROI selezionati utilizzando la seguente serie di comandi: Misurare | Misurazione del tempo.
    1. Avviate la funzione Misura nella parte superiore del pannello Misurazione tempo . Vengono generati una rappresentazione grafica della fluorescenza grezza nel tempo (Figura 3C) e dati quantitativi.
      NOTA: ogni punto dati rappresenta la fluorescenza grezza per quel ROI per il fotogramma associato a quel punto temporale misurato specifico.
  5. Esporta le intensità di fluorescenza grezze nel software del foglio di calcolo.
  6. Analizza ogni ROI in modo indipendente. Innanzitutto, normalizza i dati sottraendo l'intensità del ROI in background dal ROI dell'intensità degli interessi in ogni momento.
    1. Prendi il valore di fluorescenza grezzo dal ROI di fondo in ogni punto temporale specifico e sottrailo dal valore di intensità grezza del ROI di interesse in quel momento.
      NOTA: Questo viene fatto per l'intero periodo di registrazione, sia basale che di stimolazione.
  7. Determinare il ROI medio dell'intensità degli interessi per gli ultimi 30 s della linea di base.
    1. Media dei valori basali grezzi normalizzati generati nel passaggio 8.6 dagli ultimi 30 s del periodo di registrazione basale di 3-5 minuti.
      NOTA: l'intero periodo di registrazione basale potrebbe essere utilizzato per generare questo valore. Tuttavia, poiché questo valore si stabilizza e viene mantenuto, i 60 punti temporali degli ultimi 30 s sono di dimensioni di campionamento sufficienti per rappresentare il tutto.
  8. Confrontare questo valore di base con il valore di intensità normalizzato in ogni punto temporale, generando una variazione del valore di fluorescenza (ΔF).
    1. Prendere il valore dal passaggio 8.7 e sottrarre il valore fluorescente medio di base. Fai questo e i passaggi successivi per l'intero periodo di registrazione, sia la fase basale che quella di stimolazione.
  9. Calcolare questo cambiamento relativo al valore di fluorescenza basale, generando un cambiamento nella fluorescenza / fluorescenza basale (ΔF / F). Per fare ciò, prendi il valore dal passaggio 8.8 e dividilo per il valore fluorescente medio di base.
  10. Infine, imposta il valore del punto di partenza su 1 in modo che gli aumenti o le diminuzioni possano essere facilmente visualizzati graficamente nel tempo.
    1. Prendere il valore generato nel passaggio 8.9 e aggiungere 1.
      NOTA: se questa operazione viene eseguita correttamente, i 30 s dei valori del periodo di riferimento devono essere posizionati vicino al valore di 1. Nelle cellule che rilasciano efficacemente il contenuto sinaptico, questo valore dovrebbe tendere da 1 a 0 dopo l'inizio della stimolazione. Un esempio dei passaggi da 6 a 9 è presentato nella Figura 3E.

9. Analisi dei dati

NOTA: lo sperimentatore può essere slegato dalle condizioni sperimentali per raggruppare i dati per l'analisi in modo appropriato. Utilizzare una dimensione del campione di almeno 10 neuroni per condizione da ciascuno dei tre esperimenti indipendenti. Considerare i neuroni per l'inclusione solo se è possibile designare almeno cinque regioni ROI. Questo livello di replicazione sperimentale è stato sufficiente negli studi pubblicati per dimostrare una profonda perdita di scarico sinaptico nelle cellule poli-GA-contenenti SLA rispetto ai controlli GFP (vedi Risultati rappresentativi). Tuttavia, se si osserva un fenotipo più sottile, il numero di repliche biologiche e/o tecniche può richiedere un'ottimizzazione da parte dell'utente.

  1. Utilizzando tutti i valori ΔF/F calcolati nel tempo dai ROI di una data condizione sperimentale, determinare un valore ΔF/F medio per ogni punto temporale insieme a un SEM.
  2. Traccia i dati utilizzando un programma software di grafici e statistiche in formato xy, dove x è il tempo trascorso e y è il valore ΔF/F calcolato nel passaggio 9.1. Presentare tutti i valori come media ± SEM.
  3. Per determinare la significatività statistica, utilizzare il t-test dello studente per confrontare due gruppi e l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) seguita dall'analisi posthoc di Tukey per confrontare tre o più gruppi.

Risultati

A seguito del successo dell'implementazione del protocollo di cui sopra, vengono mostrati risultati rappresentativi per un tipico esperimento di rilascio di vescicole sinaptiche con colorante stirilico. I neuroni corticali primari di ratto in coltura sono stati caricati con colorante utilizzando il metodo descritto nel paragrafo 6. La specificità del carico del colorante è stata determinata dalla co-etichettatura con sinaptofisina con sinaptofisina marcatore delle vescicole sinaptico. La maggior parte dei puncta positi...

Discussione

Tre passaggi comuni a entrambi i metodi descritti sono di cruciale importanza per il successo sperimentale e risultati quantificabili. In primo luogo, la preparazione di un ACSF fresco prima di ogni ciclo di esperimenti è essenziale, seguendo le istruzioni allegate. In caso contrario, potrebbe impedire un'appropriata depolarizzazione neuronale. Un campione di neuroni di controllo non trattati dovrebbe essere costantemente testato prima della stimolazione di qualsiasi gruppo sperimentale per garantire una corretta depola...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Vorremmo ringraziare gli attuali ed ex membri del Jefferson Weinberg ALS Center per il feedback critico e i suggerimenti per l'ottimizzazione di queste tecniche e delle loro analisi. Questo lavoro è stato supportato da finanziamenti del NIH (RF1-AG057882-01 e R21-NS0103118 a D.T),del NINDS (R56-NS092572 e R01-NS109150 a P.P), della Muscular Dystrophy Association (D.T.), del Robert Packard Center for ALS Research (D.T.), della fondazione Family Strong 4 ALS e della Farber Family Foundation (B.K.J., K.K. e P.P).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
20x air objectiveNikonFor imaging
40x oil immersion objectiveNikonFor imaging
B27 supplementThermo Scientific17504044Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mLThermo Scientific13-689-8Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hoodBakerSterilGARD III SG403AAsceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-MercaptoethanolMillipore SigmaM3148For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum AlbuminMillipore SigmaA9418For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrateMillipore Sigma223506Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubatorThermo Scientific13-998-123For culturing and maintenance of neurons
CentrifugeEppendorf5810RFor neuronal culture preparation
Confocal microscopeNikonEclipse Ti +A1R coreFor fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD cameraPhotometricsFor image acquisition
D-GlucoseMillipore SigmaG8270Component of aCSF solutions
DNaseMillipore SigmaD5025For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley ratsCharles river400SASSDFor preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cubeNikon77032509For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dyeInvitrogenT13320For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5)CellVisD35-10-1.5-NFor growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipetteGrainger52NK56For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Millipore SigmaH6648For preparing neuronal cultures
HEPESMillipore SigmaH3375Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)For imaging. Please see recipes*
horse serumMillipore SigmaH1138For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hoodNUAIRENU-301-630For preparing neuronal cultures
LamininThermo Scientific23017015For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 MediumThermo Scientific11415064For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol redThermo Scientific21083027For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM)Thermo Scientific25030149Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermo Scientific11668019For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)For imaging. Please see recipes*
Magnesium chlorideMillipore Sigma208337Component of aCSF solutions
Microsoft ExcelMicrosoftSoftware for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PESThermo Scientific565-0020Filter unit for aCSF solution
Neurobasal mediumThermo Scientific21103049For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced ResearchNikonSoftware for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubesThermo Scientific339650For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubesThermo Scientific339652For preparing neuronal culture and buffer solutions
OptiprepMillipore SigmaD1556For preparing neuronal cultures
PapainMillipore SigmaP4762For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Scientific15140122To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion systemWarner InstrumentsSF-77BFor exchange of aCSF
Perfusion tubingCole-ParmerUX-30526-14Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmidAddgene40754For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromideMillipore SigmaP7886Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chlorideMillipore SigmaP3911Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonateMillipore SigmaS5761Component of aCSF solutions
Sodium ChlorideMillipore SigmaS9888Component of aCSF solutions
Stage Top IncubatorTokai HitFor incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cubeNikon77032809For imaging FM4-64
Trypsin InhibitorMillipore SigmaT6414For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redThermo Scientific25200056For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation tableNew PortVIP320X2430-135520Table/stand for microscope

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